SNT 1961.14-2013 出口食品過敏原成分檢測 第14部分：實時熒光PCR方法檢測魚成分_第1頁
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中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業標準出口食品過敏原成分檢測第14部分：實時熒光PCR方法檢測魚成分督 出口食品過敏原成分檢測第14部分：本部分所規定方法的最低檢出限(LOD)為0.01%(質量分數)GB/T27403實驗室質量控制規范食品分子生物學檢測在PCR反應體系中加入熒光基團利用熒光信號的積累實時監控整個PCR擴增過程。2名稱序列(5'-3')目的基因內參照5’端引物內參照3’端引物內參照探針AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCFAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC魚3'端引物魚探針FAM-TTTACGACCTCGATGTTGGA用10%鹽酸調pH至8.0,121℃,高壓滅菌20min,備用。5.3TE緩沖液(Tris-Cl、EDTA緩沖液):10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA5.1070%乙醇。6.4冰箱：2℃~8℃,-20℃。37.1DNA提取7.1.2加入500μL酚、三氯甲烷和異戊醇的混合液，體積比為25:24:1;強烈振蕩，12000g離心7.1.6加入200μL三氯甲烷：異戊醇(24:1),強烈振蕩，12000g離取適量DNA溶液原液加雙蒸水稀釋一定倍數后，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測7.3.1實時熒光PCR反應體系各1pL,魚探針1μL,dNTP1μL,Taq酶0.7.3.2實時熒光PCR反應參數48質量控制以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效：a)空白對照：無熒光對數增長，相應的Ct值>40.0;b)陰性對照：無熒光對數增長，相應的Ct值>40.0;c)陽性對照：有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值<30.0;d)內參照：有熒光對數增長，且熒光通道出現典型的擴增曲線，相應的Ct值<30.0。9結果判定及表述9.1結果判定在符合第8章的情況下，被檢樣品進行檢測時：a)如Ct值≤35.0,則判定為被檢樣品陽性，擴增靶標序列參見附錄A;b)如Ct值≥40.0,則判定為被檢樣品陰性；c)如35.0<Ct值<40.0,則重復一次。如再次擴增后Ct值仍為<40.0,則判定被檢樣品陽性；如再次擴增后Ct值≥40.0,則判定被檢樣品陰性。9.2.2結果為陰性者，表述為“未檢出過敏原魚成分”檢測過程中防止交叉污染的措施按照GBT27403中的規定執行。5ATAACAG

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