關于菌種選育理論與技術菌種選育是一門應用科學技術理論基礎：微生物學、微生物遺傳學、生物化學、分子生物學、基因工程等。目的第2頁,共49頁，星期六，2024年，5月簡化生產工藝條件，縮短生產周期菌種選育的目的研究抗生素生物合成調控的機制科研生產分析抗生素生物合成途徑獲得帶遺傳標記的菌株了解菌種遺傳背景改變產品組分、改進質量條件抵抗不良培養條件適應新的原材料提高產量提供分子遺傳學研究材料產生新的生物活性物質第3頁,共49頁，星期六，2024年，5月青霉素生產菌種的選育目前工業發酵水平經誘變85000U／mlWisQ176，900U／ml產黃青霉，20U／ml點青霉，2U／ml1943年，發霉的甜瓜1928年，Fleming第4頁,共49頁，星期六，2024年，5月菌種選育的基本方法根據菌種自然變異而進行的自然選育。用人工方法引起菌種變異或形成新的雜種，再按照工業要求進行篩選來獲得新的變種或雜種。

包括誘變育種，雜交育種，原生質體育種，基因工程育種等。第5頁,共49頁，星期六，2024年，5月第一節

自然選育自然選育（naturalscreening）是指利用微生物在一定條件下產生自發突變的原理，通過分離、篩選排除衰退型菌株，從中選出維持或高于原有生產菌株的過程，以達到穩定或提高生產的目的。自然選育的目的淘汰衰退菌種，保存優良菌株，純化菌種，防止菌種衰退，穩定生產，提高發酵產量。第6頁,共49頁，星期六，2024年，5月一、菌種衰退的原因菌種遺傳特性的改變經誘變劑處理后的退化變異

菌種生理狀況的改變

（培養條件）導致衰退可能的原因：沙土管長期保藏、連續傳代、新陳代謝產生的誘變物質、多因素低劑量誘變效應、互變異構現象等。第7頁,共49頁，星期六，2024年，5月二、自然選育的一般過程第8頁,共49頁，星期六，2024年，5月1、單孢子懸浮液的制備

定量稀釋后制成50～200個單細胞／ml的菌懸液。2、分離及單菌落培養

根據計數結果，按絲狀真菌、放線菌菌落大小不同，分離量以5～20個菌落／平皿為宜。3、篩選

將分離培養后的各型單菌落，接斜面培養，成熟后接入發酵瓶，測定發酵單位的過程稱為篩選。它分初篩、復篩兩個過程。

第9頁,共49頁，星期六，2024年，5月優點

簡單易行缺點

效率低，進展慢，難以獲得高產突變株

以微生物的自然變異為基礎的生產選種幾率并不是很高，一個基因的自然突變頻率僅10－6～10－10目的

純化、復壯菌種第10頁,共49頁，星期六，2024年，5月第二節

誘變育種誘變育種（mutationbreeding）是利用物理或化學誘變劑處理均勻分散的微生物細胞群體，促進其突變率大幅提高，然后采用簡便、高效的篩選方法，從中選出少數具有優良性狀的突變菌株。優點：速度快，收效大，方法簡便。缺點：誘發突變缺乏定向性，工作量大。誘變育種工作主要包括出發菌株的選擇、誘變處理和篩選突變株三個部分。第11頁,共49頁，星期六，2024年，5月出發菌株（沙土管或冷凍管）誘變育種的一般步驟第12頁,共49頁，星期六，2024年，5月一、誘變劑的種類物理誘變劑：主要包括物理輻射中的各種射線

化學誘變劑：與DNA發生作用、改變其結構，并引起遺傳變異的化學物質。生物誘變劑：一些能引起DNA結構改變，從而造成突變效應的生物體或生物分子。

第13頁,共49頁，星期六，2024年，5月超凈工作臺小型X射線衍射儀Co60射線機第14頁,共49頁，星期六，2024年，5月二、誘變育種的過程前突變：誘變劑所造成的DNA分子的某一位置的結構改變。

突變：由于染色體或基因本身的變化而產生的遺傳性狀的變異。表型延遲：表型改變落后于基因型改變的現象。

第15頁,共49頁，星期六，2024年，5月（一）誘變劑接觸DNA分子前1、細胞對誘變劑的透性將影響誘變效果。2、細胞質的某些組分和某些酶可和誘變劑相互作用而影響誘變效果。3、與基因所處的狀態有關，而基因的狀態又和培養條件有關。

第16頁,共49頁，星期六，2024年，5月（二）DNA損傷修復光修復作用（光復活作用）切補修復

四種酶的作用：核酸內切酶

、核酸外

切酶

、DNA多聚酶

、DNA連接酶重組修復SOS修復系統DNA聚合酶的矯正作用第17頁,共49頁，星期六，2024年，5月第18頁,共49頁，星期六，2024年，5月（三）前突變到突變的過程校正差錯：光復活作用、切補修復和DNA多聚酶校正作用

引起差錯：重組修復和SOS修復系統

一切影響這些修復系統中的酶活性的因素都能影響由前突變向突變轉變這一過程

。誘變前后的處理可影響誘變的效果

：1、通過影響與DNA修復作用有關的酶的活性而影響誘變的效果；2、通過使誘變的目的基因處于活化狀態(復制或轉錄狀態)，使之更容易被誘變劑所作用，從而影響目的基因的突變率。

第19頁,共49頁，星期六，2024年，5月(四)從突變到突變型1、分離性遲延

是經誘變處理后，細胞中的基因處于不純的狀態(野生型基因和突變型基因并存于同一細胞中)，突變型基因由于屬于隱性基因而暫時得不到表達，需經過復制、分離，在細胞中處于純的狀態(一細胞中只有突變型基因，沒有野生型基因)時，其性狀才得以表達。2、生理性遲延

突變基因由雜合狀態變為純合狀態時，還不一定出現突變表型，新的表型必須等到原有基因的產物稀釋到某一程度后才能表現出來。

第20頁,共49頁，星期六，2024年，5月三、誘變育種的步驟出發菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理中間培養突變株的分離和篩選第21頁,共49頁，星期六，2024年，5月第22頁,共49頁，星期六，2024年，5月四、突變株的篩選(一)隨機篩選(二)理性化篩選（定向篩選）

運用遺傳學、生物化學的原理，根據產物已知的或可能的生物合成途徑、代謝調控機制和產物分子結構來進行設計和采用一些篩選方法，以打破微生物原有的代謝調控機制，獲得能大量形成產物的高產突變株。第23頁,共49頁，星期六，2024年，5月第24頁,共49頁，星期六，2024年，5月1、初級代謝產物高產菌株的篩選普遍存在著反饋抑制和反饋阻遏，要打破反饋調節系統，可從兩個方面著手：

(1)

篩選細胞膜透性改變的突變株例如，谷氨酸發酵選育的高產菌株為谷氨酸棒桿菌的生物素營養缺陷型。第25頁,共49頁，星期六，2024年，5月（2）篩選營養缺陷型突變株

營養缺陷型:誘變產生的缺乏合成某些營養物質的能力，須在基本培養基中加入相應的營養成分才能正常生長的變異株。

野生型:與營養缺陷型對應的是野生型。

滲漏缺陷型:是遺傳性障礙不完全的營養缺陷型，突變使某一種酶的活性下降而不是完全喪失，能少量地合成某一代謝產物。第26頁,共49頁，星期六，2024年，5月(2)篩選結構類似物抗性突變株結構類似物：在化學和空間結構上和代謝的中間物（終產物）相似，因而在代謝調節方面可以代替代謝中間物（終產物）的功能，但細胞不能以其作為自身的營養物質第27頁,共49頁，星期六，2024年，5月2、次級代謝產物(主要是抗生素)高產菌株的篩選利用營養缺陷型篩選

篩選負變株或零變株的回復突變株篩選去磷酸鹽調節突變株篩選去碳源分解代謝調節突變株篩選氨基酸結構類似物抗性突變株

篩選二價金屬離子抗性突變株篩選前體或前體結構類似物抗性突變株篩選自身所產的抗生素抗性突變株第28頁,共49頁，星期六，2024年，5月1、抗性篩選抗性突變株的篩選相對比較容易，只要有10–6頻率的突變體存在，就容易篩選出來抗性突變株的篩選常用的有一次性篩選法和階梯性篩選法兩種手段（三）理性化篩選的方法第29頁,共49頁，星期六，2024年，5月（1）一次性篩選法一次性篩選法就是指在對出發菌株完全致死的環境中，一次性篩選出少量抗性變異株抗噬菌體菌株篩選耐高溫菌株篩選耐高酒精度、高滲透壓的菌株也可分別在高濃度酒精或加蔗糖等造成的高滲環境下一次性篩選獲得第30頁,共49頁，星期六，2024年，5月（2）階梯性篩選法無法知道微生物究竟能耐受多少高濃度的藥物藥物的抗性變異也是逐步發展的，時間上是漸進的梯度平板法紙片擴散法第31頁,共49頁，星期六，2024年，5月吡哆醇與代謝拮抗物異煙肼的分子結構梯度平板法也常用于抗代謝拮抗物突變株的篩選，以提高相應代謝產物的產量。如：吡哆醇高產菌株篩選第32頁,共49頁，星期六，2024年，5月

梯度平板法(Gradientplate)第33頁,共49頁，星期六，2024年，5月

紙片擴散法與梯度平板法的原理類似，用打孔器將較厚的濾紙打成小圓片，并使紙片吸收一定濃度的藥物，經干燥或不經干燥，放入涂布了菌懸液的平板上，一般9厘米的培養皿中等距放置三片為宜。經培養后觀察圍繞紙片的抑菌圈，抑菌圈內出現的可能就是抗性菌。紙片擴散法第34頁,共49頁，星期六，2024年，5月階梯性篩選法的缺點

階梯性篩選法只有在抑制區域才能挑選抗性菌，而低濃度區域面積較大，優良的抗性突變株若被分散在低濃度區域或遠離紙片的區域，則可能沒有被檢出，因此，漏檢的幾率較大。

第35頁,共49頁，星期六，2024年，5月2、營養缺陷型突變株篩選與篩選營養缺陷型有關的三類培養基①基本培養基（MM，minimalmedium）：能滿足某一菌種的野生型或原養型菌株營養要求的最低成分的合成培養基②補充培養基（SM，supplementalmedium）：在基本培養基中有針對性地補加某一種或幾種營養成分，以滿足相應的營養缺陷型菌株生長需要（其他營養缺陷型仍不能生長）的培養基③完全培養基（CM，completemedium）：可滿足該菌各種營養缺陷型菌株營養需要的天然或半合成培養基第36頁,共49頁，星期六，2024年，5月營養缺陷型突變株的篩選方法1)淘汰野生型抗生素法：將誘變處理液在MM中培養短時讓野生型處于活化階段，而缺陷型處于休眠狀態且在培養基中加入一定量的抗生素，結果活化狀態的野生型就被殺死，保存了缺陷型菌絲過濾法：對于霉菌，因孢子生長后會長出菌絲體，就可用濾紙過濾法將菌絲濾去，而缺陷型孢子卻因未發芽而保留在處理液中第37頁,共49頁，星期六，2024年，5月2)檢出缺陷型原理：在固體基本培養基和完全培養基上，生長情況完全不同，缺陷型在CM上生長良好，而在MM上則不生長，野生型都能生長具體方法：影印法、點種法、夾層法第38頁,共49頁，星期六，2024年，5月第39頁,共49頁，星期六，2024年，5月也稱任意法用接種針或牙簽將CM上長出的菌落在MM和CM兩副平板上接種，依次在相應位置點種，然后一起培養，觀察其生長情況此法結果明確，但工作量大點種法第40頁,共49頁，星期六，2024年，5月先在培養皿上倒一層基本瓊脂培養基，凝固后涂上一層含菌的MM，凝固后再倒一薄層MM瓊脂培養基，培養24h，將出現的菌落標記，然后倒上一層CM瓊脂培養基，再培養。這時第二批長出的菌落就可能是缺陷型此法缺點是，結果有時不明確，而且將缺陷型菌落從夾層中挑出并不很容易夾層法第41頁,共49頁，星期六，2024年，5月3)營養缺陷型生長譜的確定方法二以不同組合的營養混合物與融化涼至50℃的MM培養基混合鋪成平皿，然后在這些平皿上劃線接種各個缺陷型菌株于各相應位置，培養后根據在這些組合長出可推知其營養因子在5～6個平皿上可測20株菌以上。第42頁,共49頁，星期六，2024年，5月第三節

雜交育種雜交育種是指將兩個基因型不同的菌株經吻合(或接合)使遺傳物質重新組合，從中分離和篩選具有新性狀的菌株。雜交育種的目的在于：（1）通過雜交使不同菌株的遺傳物質進行交換和重新組合，從而改變原有菌株的遺傳物質基礎，獲得雜種菌株(重組體)；（2）可以通過雜交把不同菌株的優良生產性能集中于重組體中，克服長期用誘變劑處理造成的菌株生活力下降等缺陷；（3）通過雜交，可以擴大變異范圍，改變產品的質量和產量，甚至出現新的品種；（4）分析雜交結果，可以總結遺傳物質的轉移和