關于血紅蛋白的分離和提取思考：“課題1--DNA的粗提取與鑒定”實驗理想的材料是什么？“課題3--血紅蛋白的提取和分離”這實驗理想的材料又是什么？原因是？答：雞的紅細胞具有細胞核，含有DNA，便于進行DNA的提取，哺乳類動物成熟的紅細胞無細胞核，結構簡單，血紅蛋白含量豐富便于提取血紅蛋白。第2頁,共29頁，星期六，2024年，5月一、基礎知識：（一）蛋白質分離原理

（二）蛋白質分離的方法

1）凝膠色譜法：又稱分配色譜法

2）電泳法（三）緩沖液的作用第3頁,共29頁，星期六，2024年，5月二、實驗操作－－實驗步驟

血液組成成分

（1）洗滌紅細胞

（2）釋放血紅蛋白

（3）分離血紅蛋白

（4）透析血紅蛋白1、樣品處理3、純化4、純度鑒定2、粗分離SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白純度凝膠色譜法進行純化注意事項第4頁,共29頁，星期六，2024年，5月蛋白質提取與分離的依據－－蛋白質的物理化學性質差異：

1.分子的形狀、大小

2.電荷性質和多少

3.溶解度

4.吸附性質

5.對其他分子親和力

第5頁,共29頁，星期六，2024年，5月1.凝膠色譜法

一些微小多孔的球體（內含許多貫穿的通道，具多孔的凝膠就叫分子篩）根據相對分子質量的大小分離蛋白質的方法（2）概念：（1）凝膠第6頁,共29頁，星期六，2024年，5月3、原理：當不同的蛋白質通過凝膠時，（）的蛋白質容易進入凝膠內部的通道，路程（），移動速度（），而（）的蛋白質無法進入凝膠內部的通道，只能在（）移動，路程（），移動速度（），相對分子質量不同的蛋白質因此得以分離。相對分子質量較小較長較慢相對分子質量較大凝膠外部較短較快總結：大分子經過路程短，流動快；小分子經過路程長，流動慢。第7頁,共29頁，星期六，2024年，5月洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。混合物上柱洗脫大分子流動快小分子流動慢收集大分子收集小分子

4、具體過程第8頁,共29頁，星期六，2024年，5月2．凝膠電泳法：1）原理：不同蛋白質的帶電性質（正電荷或負電荷）、電量、分子形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。2）影響蛋白質分子運動速度的因素電泳：帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程第9頁,共29頁，星期六，2024年，5月3）常用電泳方法

瓊脂糖凝膠電泳

聚丙酰胺凝膠電泳

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

在測定蛋白質分子量時通常用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用時可選用一組已知分子量的標準蛋白同時進行電泳做對照，根據兩者的電泳區帶位置，利用相關計算公式算出相對分子量

SDS帶負電荷多的，因而掩蓋了不同種蛋白質間的電荷的差別，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。第10頁,共29頁，星期六，2024年，5月影響蛋白質分子運動速度的因素

決定運動方向決定運動速率電荷性質電荷量分子形狀分子大小√√√√第11頁,共29頁，星期六，2024年，5月由弱酸和相應的強堿鹽溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等緩沖溶液－－洗脫劑

（1）作用：

（2）配制：抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持pH穩定。（3）在血紅蛋白的提取和分離實驗中用的緩沖液的原因？

目的是利用緩沖液模擬細胞內的PH環境，保證血紅蛋白的正常結構和功能。第12頁,共29頁，星期六，2024年，5月血液組成成分閱讀思考：血液由______和________兩部分組成。血細胞中________細胞數量最多，細胞的含量最高的化合物是_____________。該化合物是由_____________和____________構成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結合的______________________基團。血漿血細胞紅細胞血紅蛋白2條α-肽鏈2條β-肽鏈

亞鐵血紅素第13頁,共29頁，星期六，2024年，5月1.洗滌紅細胞閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌的方法是什么？洗滌干凈的標志是什么？血液100mL3g檸檬酸鈉低速短時間離心紅細胞血漿吸出血漿紅細胞5倍體積生理鹽水攪拌10min重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色第14頁,共29頁，星期六，2024年，5月2.釋放血紅蛋白閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細胞加入了哪些物質，有什么用？目的分析：蒸餾水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分攪拌的目的是____________________________。使紅細胞大量吸水脹裂溶解紅細胞的細胞膜加速紅細胞的破裂第15頁,共29頁，星期六，2024年，5月濾紙過濾脂類物質3.分離血紅蛋白分離過程紅細胞混合液高速離心10min離心管燒杯有機溶劑血紅蛋白第16頁,共29頁，星期六，2024年，5月20mmol/L磷酸緩沖液4.透析血紅蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血紅蛋白中的小分子雜質第17頁,共29頁，星期六，2024年，5月純化－－凝膠色譜法1.凝膠色譜柱的制作：2.凝膠色譜柱的裝填：教材圖5－193.樣品的加入和洗脫第18頁,共29頁，星期六，2024年，5月注意：（1）凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹；凝膠裝填時盡量緊密；裝填時不能有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。

（2）裝完后，立即用緩沖液洗滌，使凝膠裝填緊密第19頁,共29頁，星期六，2024年，5月3.樣品的加入和洗脫

1.調液面2.加樣

4.洗脫5.收集緩沖液凝膠注意：洗脫過程不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象，否則重新填裝。3.再調液面

1.調液面2.加樣3.再調液面

4.洗脫、5.收集第20頁,共29頁，星期六，2024年，5月注意事項1.紅細胞的洗滌：

洗滌次數不能過少；低速、短時離心。2.凝膠的預處理：

沸水浴法，還能除去微生物和氣泡3.色譜柱的裝填：

裝填盡量緊密；無氣泡；洗脫液不能斷流。4.

色譜柱成功標志：紅色區帶均勻一致地移動。Why？第21頁,共29頁，星期六，2024年，5月知識總結血紅蛋白的提取和分離蛋白質分子的差異性凝膠色譜法原理分離過程凝膠電泳法緩沖溶液組成作用蛋白質的提取分離樣品處理粗分離純化純度鑒定第22頁,共29頁，星期六，2024年，5月1、用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的是A、相對分子質量較小的蛋白質行程大于相對分子質量較大的蛋白質B、相對分子質量較小的蛋白質行程小于相對分子質量較大的蛋白質C、相對分子質量較小的蛋白質行程等于相對分子質量較大的蛋白質D、二者根本無法比較練習鞏固第23頁,共29頁，星期六，2024年，5月2.相對分子質量不同的蛋白質在凝膠中的進行過程可表示為圖中哪一個B第24頁,共29頁，星期六，2024年，5月3.凝膠色譜法分離蛋白質時，凝膠的種類較多，但其作用的共同點是()

A.改變蛋白質分子通過凝膠時的路徑

B.吸附一部分蛋白質，從而影響蛋白質分子的移動速度

C.將酶或細胞固定在凝膠中

D.與蛋白質分子進行化學反應，從而影響其移動速度4.在利用凝膠電泳法分離蛋白質時，一定要加入緩沖液，其作用主要是()A.使酶的活性最高B.使蛋白質的活性最高

C.維持蛋白質所帶的電荷D.使蛋白質帶上電荷AC第25頁,共29頁，星期六，2024年，5月5、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A電荷的多少B分子的大小C肽鏈的多少D分子形狀的差異第26頁,共29頁，星期六，2024年，5月6.下列是有關血紅蛋白提取和分離的相關操作，其中正確的是（）A．可采集豬血作為實驗材料B．用蒸餾水重復洗滌紅細胞C．血紅蛋白釋放后應低速短時間離心D．