PAGEPAGE10生物工程實驗指導（試用版）（適用于生物科學和生物技術專業）主編高國輝副主編李勁松周曉輝溫州醫學院生命科學院2010年1月目錄基因工程學實驗實驗一重組原核表達載體的構建與克隆鑒定………………1實驗二重組蛋白的誘導表達…………………9實驗三重組蛋白的聚丙烯凝膠電泳（PAGE）…………………12實驗四重組蛋白純化：可溶性HisTag-蛋白的抽提…………16實驗五蛋白質免疫印跡分析（WesternBlot）………………19微生物工程學實驗實驗一種子、發酵培養基制備及培養基實消…………………22實驗二發酵種子擴大培養、一級種子制備……24實驗三接種與發酵過程控制管理…………………25實驗四發酵液SOD活性檢測……………………27生化工程學實驗實驗一超氧化物歧化酶粗酶液的分離純化………28實驗二超氧化物歧化酶蛋白濃度和酶活性的測定………………30實驗三超氧化物歧化酶活性染色鑒定法…………33實驗一重組原核表達載體的構建與克隆鑒定一、實驗原理重組表達載體的構建是基因工程實驗的第一步，也是目的蛋白進行表達的基礎，其關鍵技術為DNA體外重組，即應用酶學方法，將需表達的基因片段在體外進行特異性切割，與合適的表達載體分子重新連接，組裝成一個新的重組表達載體質粒。表達載體在基因工程中扮演首十分重要的角色，負責克隆目的的基因、指導目的基因在宿主體內的轉錄和翻譯，表達載體內有3個系統完成以上3種功能。（1）DNA復制及質料DNA的篩選。這一系統與普通的克隆質料一樣，由DNA復制起始位點ori和抗藥性基因（如氨芐青霉素抗性基因Amp、四環素抗性基因Tet等）來完成，松馳型ori位點能使載體借用宿主的DNA復制體系大量復制載體DNA，同時克隆的目的基因亦得以大量復制，為基因的高水平轉錄提供足夠多的模板，如載體還裝配有其它生物的ori，則可在不同生物宿主中進行載體DNA復制，這類載體稱為穿梭載體，截體上的抗藥性基因賦予宿主特定的抗藥性，使其能在有抗生素的培養條件下正常生長，這樣就篩除掉不含載體的宿主，同時保證載體在宿主中的穩定存在。（2）目的基因的轉錄，這一系統包含啟動子、抑制物基因和轉錄終止子，啟動子是一個段能被宿主RNA聚合酶特異性性識別和結合并指導宿主轉錄目的基因的DNA順序，位于目的基因的上游，表達載體選用在宿主中起始功能強的強啟動子（如原核的Lac,Trp,T7等啟動子），目的基因在這類啟動子的指導下轉錄出大量的mRNA，為后一步的蛋白質翻譯提供盡可能多的模板，抑制物基因產物對啟動子起始功能產生抑制，適當的誘導條件可使抑制物失活，啟動子功能置新恢復，是一種控制啟動子功能的蛋白質，通過它使目的基因在宿主培養到最佳狀態時進行轉錄，保證轉錄有效進行，特別是表達產物對宿主害時，控制轉錄時機尤其置要；轉錄終止于是一段終止RNA聚合酶轉錄的DNA順序，使轉錄在目的基因之后立刻停止、避免作多余的轉錄以節省宿主內RNA的合成底物，提高目的基因的轉錄量，啟動子和終止子因宿主的不同而有差別，往往在不同的物種宿主中表達的效率也不一樣、特別是原核生物和真核生物宿主間期完全不同，相互不能通用，這一點應特別注意。（3）蛋白質的翻譯，這一系統包含核糖體識別位點（如原核的SD順序）翻譯起始密碼子和終止密碼子。SD順序與原核宿主核糖休16srRNA特異配對而結合，大腸桿菌SD順序的成基組成為AGGA，mRNA翻譯模板與核糖休的親和力高低對翻譯效率極重要，起始密碼子是翻譯的起始位點，通常為ATG，編碼Met（甲硫氨酸），也有極少數生物利用其他密碼子作為翻譯過程，這些位點可指導宿主的蛋白質翻譯系統準確高效地合成目的基因編碼蛋白質，根據位點的構造不同還可分為完整蛋白和融合蛋白表達載體：①完整蛋白表達載體：目的基因直接克隆進其后，利用自身的起始密碼子表達編碼蛋白，有的載體其啟動子后接有SD順序，另一些載體其啟動子后沒有接SD順序，需要目的基因上游帶進SD順序；②融合蛋白表達載體：載體啟動子后連有SD順序和超始密碼子并表達另外一種多肽，目的基因按這個多肽的三聯密碼子閱讀框插進多肽基因中的某一位點，表達出來產物為部分多肽與目的蛋白雜合的融合蛋白質。轉錄出的mRNA5’上游的SD順序與ATG的間距長度和組成對目的基因的翻譯效率也很關鍵，間距以6-11個堿基，堿基組成CG比例不超過50%為最好。真核基因在原核生物中表達時，ATG以后的20-40個堿基組成也很重要，通過適當的CG突變成AT的定點突變改造，有時可使表達效率提高幾倍甚至十倍以上，視基因不同和改造的位點不同而有不同的提高。二、試劑與材料1、菌種：大腸桿菌DH5α菌株（無抗生素抗性）或Topl0F+（四環素抗性）2、原核表達載體質料：pET28（Ka‘）3、外源DNA片段：HBVS基因片段（bp）由PCR從病人血清中擴增得到（引物為：LEFT5–CGAATTCATGGAGAGCACAACATCAGG-3RIGHT5–CAAGCTTAAATGTATACCCAAAGACAAA-3上下游分別引入EcoRI和HindIII酶切位點）PCR產物克隆入TA克隆。4、LB培養基每升液體LB培養基中含蛋白胨10克酵母浸出液5克NaCl10克NaOH調pH值至7.0-7.5每升固體LB培養基：加1.5%的瓊脂于液體之中。高壓蒸氣滅菌5、堿解法抽提質粒之深液溶液I：50mM葡萄糖+25mMTris-HCI(pH8.0)+10mMEDTA，高壓蒸氣滅菌溶液II：0.2NNaOH+1%SDS溶液III：5MKAC，60ml冰乙酸，11.5ml水，28.5ml6、限制性內切酶EcoRI和HindIII及10×酶切緩沖溶，-20℃7、膠回收用低熔點瓊脂糖凝或者華舜公司膠回收試劑盒8、T4連接酶或Takara公司快速連接酶試劑盒9、感受態細菌制備之溶液0.1%CaCl2溶液，4℃甘油，4℃10、其他試劑氨芐青霉素：貯存液100mg/ml，-20℃保存，工作濃度60-100ug/ml卡那霉素：貯存液50mg/ml，-20℃保存，工作濃度50ug/ml四環素：貯存液15mg/ml，-20℃避光保存，工作濃度15ug/mlTE緩沖液（pH8.0）10mMTris-HCI(pH8.0)+0.1mMEDTA,4℃3MNaAC（pH5.2）4℃無水乙醇11、電泳試劑電泳緩沖液TBE：5×母液，0.5×工作液溴化乙錠（EB）：10mg/ml1%agarose：1克agarose中加入100ml電泳緩沖液加熱溶解，然后加入5μg/ml。溴酚蘭指示劑：0.25%溴酚蘭+50%甘油12、器材細菌搖床、無菌試管、吸管、三角涂棒、50ml離心管、0.5ml和1.5微量離心管管、微量加樣器、高速臺式離心機、普通離心機、冰浴、干燥器、電泳儀、電泳槽、-40℃冰箱（菌種保存）等。三、操作1、堿裂解法小量制備細菌質粒DNA（pTA/HBs以及pET28）（1）接種環挑取LB平板上的單個菌落，接種于2ml含相應抗生素的LB液體培養基中，37℃，200rpm振搖培養過夜。（2）吸取1.5ml菌液于一微量離心管管中，10000g離心1min，倒掉培養液，使細菌沉淀盡量干燥。（3）加入100μl溶液I，旋渦振蕩器上充分振蕩，使沉淀懸浮。（4）加入200μl新鮮配制的溶液II，蓋緊蓋子，上下顛倒五次，冰上靜置5分鐘。（5）加入150μl溶液III，蓋緊蓋子、上下顛倒五次，冰上靜置5分鐘。（6）15000rpm離心5分鐘。上清轉移到另一微量離心管管中。（7）加入等量酚：氨仿（體積比1：1）抽提一次，15000離心5分鐘，將上清轉移到另一微量離心管中。（8）加入2倍體積的無水乙醇，冰上放置20分鐘，15000rpm離心10分鐘，小心傾去上清液。（9）用1ml70%乙醇洗滌DNA沉淀，15000rpm離心5分鐘，小心傾去上清液，在空氣中使核酸沉淀干燥15分鐘。（10）加30μl含Rnase（20ug/ml）的TE溶液（pH8.0）或ddH2O溶解DNA沉淀。（11）取2μl質粒溶液進行瓊脂糖凝膠電泳，檢查質粒抽提結果。2、限制性內切酶反應（1）混合下列溶液于一個0.5ml的微量離心管中。10μl質料DNA溶液（pTA/HBs或pET28）（100ng/μl）7μlddH2O2μl10×酶切反應緩沖液0.5μl(10U/μl)EcoRI0.5μl(10U/μl)HindIII（總體積20μl）（2）37℃，溫育1小時3、低熔點瓊脂糖凝膠回收DNA片段及載體（1）DNA樣品用合適的限制性內切酶完全消化，低熔點瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，然后用解剖切切下目的條帶（盡量小）。（2）將凝膠塊于68℃熔化，估計融膠的體積，加入等休積的TE緩沖液（pH8.0）平衡酚，旋渦振蕩器上劇烈振蕩。（3）15000rpm離心5分鐘，依次可見酚相、瓊脂糖相和水相。小心吸取水相。（4）往剩下的酚、瓊脂糖相中加入與融膠等體積的水，1500rpm離心5分鐘，小心吸取水相。（5）合并兩次得到的水相，估計體積，加入1/10體積的3MNaAc溶液（pH5.2）。再用兩倍體積無水乙醇沉淀DNA（室溫放置30分鐘）。15000rpm離心15分鐘，小心吸去上清。（6）用200μl70%的乙醇洗滌沉淀一次，15000rpm離心5分鐘,小心棄去上清。（7）加入適量的ddH2O或TE緩沖液溶解DNA。注：如用華舜公司膠回收試劑盒回收，則按說明書進行。4、連接反應混合下列溶液于一個0.5ml的微量離心管中：1μl質粒pET283μlHBVS基因片段1μl10×連接緩沖液1μlT4DNA連接酶（5U/μl）4μl水（總體積為10μl，16℃連接2小時）注：載體和片段的摩爾比為1：3.如用Takara公司快速連接酶試劑盒則按說明書進行。5、感受態細菌的制備，要求無菌操作（1）接種大腸桿菌E.coliDH5α或Top10F+單一菌落于2mlLB培養基中，37℃振搖培養過夜。（2）吸取1ml的菌液，轉移到100mlLB培養基中，37℃振搖培養約3小時，使細菌處于對數生長期。（3）菌液放冰浴中冷卻10分鐘，然后將菌液分裝到2個預冷無菌的50ml離心管中。（4）4℃,4000rpm離心10分鐘，棄上清，細胞沉淀用10ml冰上預冷的0.1M的CaCl2溶液重新縣浮，冰上放置半小時。（5）5℃,4000rpm離心10分鐘，棄上清，細胞沉淀用2ml冰上預冷的0.1MCaCl2溶液重新懸浮，即得新鮮的感受態細胞。（6）如果凍存，加入預冷的甘油（15%體積），然后分裝到無菌預冷的微量離心管中，100μl/每管，凍存于-70℃。6、質料DNA轉化大腸桿菌DH5α或Top10F+細胞。（1）于100μl感受態細胞（新鮮或凍存，凍存的感受細胞應先置冰浴上融化）中加入5μl連接反應產物，輕輕旋轉以混勻。（2）冰浴45分鐘，42℃熱擊90秒。（3）加入無抗生素的LB培養基900μl，37℃120rpm振蕩培養1小時。（4）6000rpm離心2分鐘，棄上清600μl。吸取200μl于LB平板（含相應抗生素）上，用無菌三角涂棒涂布均勻，37℃培養12-16小時，平板上出現菌落，即為轉化體。7、重組質料轉化體的酶切鑒定（1）用接種環從平板上挑取克隆，接種到2mlLB培養基中（含相應抗生素），37℃振蕩培養12-16小時。（2）酶切鑒定：堿裂解法抽提質料，用限制性內切酶消化，瓊脂糖凝膠電脈查看酶切結果。如果有大小正確的片段切下，說明質料pUC19中已插入HBVS基因片段。（3）PCR鑒定：隨機挑取轉化平板上數個菌落接種于微量孔板上（每孔加入含應的抗生素的LB液100μl）37℃孵育3-4小時后進行PCR。PCR反應總體積30μl，含正、反向引物（25uM）各lul、10×Buffer3μl（含MgC121.5mM）、Taq酶0.3μl（1.5U）、10mMdNTPlul、菌液3μl，根據需要鑒定的片段大小設計PCR循環方式，進行25-30個PCR循環后，取5μlPCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，判斷有無基因片段插入。（4）測序鑒定：將酶切鑒定或PCR鑒定得到陽性克隆進行擴增后，用“小量質料抽提試劑盒”抽提質料后送至公司測序，或直接送細菌樣品進行測序。8、菌種的保存對獲得的陽性細菌必須進行保存。將確證為陽性的細菌克隆進行擴增后取出約800-900ul的菌液加入甘油管中（甘油終濃度為15%），混勻后放置-40℃或-70℃保存。注意：1、在細菌接種、擴增等過程中，LB液中必須加有對應抗生素，否則細菌缺少這種壓力攜帶的質粒拷貝會逐漸丟失，使得抽提的質粒量少，難以進行實驗。2、mRNA轉錄出來后，如果在SD序列或目的基因的ATG位點及附近出現有二級折疊結構，并且其莖環中莖的長度大于5bp時，會嚴重影響到蛋白質的翻譯效率，產率極低。通過定點突變或更換載體使這類二級結構消除，可使表達效率提高10-100倍以上。PET28a-c原核表達載體圖譜實驗二重組蛋白的誘導表達一、實驗原理最早建立并得到廣泛應用的表達系統是以大腸桿菌lac操縱子調控機理為基礎設計、構建的表達系統，稱為Lac表達系統，lac操縱子是研究最為詳盡的大腸桿菌基因操縱子，該操縱子的轉錄受正調節因子CAP和負調節因子lacl的調控。在無誘導物情形下，lacl基因產物形成四聚體阻遇蛋白。與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始，異丙基-α-βD-硫代半乳糖苷（IPTG）等乳糖類似物是lac操縱子的誘導物，它們與阻遇蛋白結合后使之改變構象，導致與操縱基因的結合能力降低而解離出來，lac操縱子的轉錄因此被激活，由子lac操縱子具有這種可誘導調控基因轉錄的性質，因此其元件和它們的一些突變體經常被用于表達載體的構建。如前圖所示，pET-28原核表達載體中則帶有lacl基因，故可用IPTG進行透導表達。表達載體、目的基因和宿主菌共同構成一個完整的表達系統，因此良好的表達系統不僅與表達載體的目的基因有關，選擇合適的宿主菌也十分重要。首先表達載體的啟動子應在宿主中具有強起動功效，不同的啟動子對應的宿主往往不同，如大場桿菌中的啟動子選用大腸桿菌宿主，枯草桿菌啟動子選用枯草桿菌宿主，這樣有利于充分發揮強啟動子的效率；其次，某些表達載體自身不帶抑制藥基因，用這類載體就應選擇能產生抑制物蛋白質的宿主菌，否則表達不能調控，不利于高誑表達目的的基因，第三，表達的蛋白質產物因宿主菌內的蛋白酶作用會發生降解，所以許多用作表達的宿主都經過改造，以便于表達蛋白的積累。當表達的蛋白質對宿主菌有毒害，應考慮換一種宿主細胞，目前，我們對原核生物的了解要比對真核生物更全面更深入。當前開發出的基因工程產品中80%-90%是用的原核生物表達系統。原核生物表達系統因基相關的基本理論和技術方法成熟、操作成本較低而得到廣泛的應用。但是表達真核基因方面，因宿主缺少真核生物的蛋白質加工系統（如剪切和糖基化）、基因的密碼子偏愛性不同及包含體復性等而受到限制。原核生物除大腸桿菌表達系統外，還有棒狀桿菌、枯草桿菌和沙門氏桿菌等表達系統，它們都有各自的優缺點。二、試劑與材料1、表達菌株BL21DE3plysS感受態細胞2、pET28/HBs陽性克隆質粒3、LB液體培養基（無抗性）4、LB液體培養基（kan+）5、LB平板（kan+）6、IPTG貯備液：2gIPTG溶于10mlddH2O，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝成1ml/份，-20℃保存。工作濃度為1mM7、器材：細菌搖床、無菌試管、吸管、三角涂棒、50ml離心管、0.5ml和1.5ml微量離心管管、微量加樣器、高速臺式離心機、普通離心機、制冰機、-40℃冰箱（菌種保存）等。三、操作1、轉化取前面構建的陽性質粒10ng加入100ul表達細菌（BL21DE3plysS）感受態中，冰上放置45分鐘，在此過程中可以每隔幾分鐘用手輕彈Eppendof管，然后進行熱休克（42℃水浴90秒，取出立即插入冰中放置5分鐘），加入預熱的無抗生素的LB液900ul、于37℃搖床中200rpm搖1小時，吸取50-100ul菌液進行均勻涂板，LB平板必須含有相應的抗生素，將LB平板放在37℃溫箱中過夜培養。2、誘導表達隨機挑取數個菌落，各加3ml含的LB液于37℃搖過夜，取出300ul菌液加3ml有抗生素的LB液，作1：10稀釋，37℃250rpm搖2小時（OD值約為0.2-0.6），于各管中加100mMIPTG30ul（終濃度為1mM），37℃250rpm搖6小時，進行誘導。誘導后6000rpm離心2分鐘，收集菌體，用50ulddH2O重懸菌體，加等體積2×蛋白上樣液（約60ul），于沸水浴中變性5分鐘，同時取一個陰性對照（即未加IPTG誘導的菌體）經過變性處理后同時進行SDS分析，著有無目的的蛋白表達（下一次實驗的內容）。若須純化蛋白，最好選擇一表達量最大的菌種進行以后實驗。3、誘導表達條件的優化對于不同的可溶性蛋白，進行誘導的IPTG濃度、溫度、時間均不同，必須進行選擇優化，即在上述不同的條件下分別進行誘導，通過SDS分析選擇最佳條件進行蛋白誘導、表達和純化。注意：表達菌株的過夜培養物接種，是為了在誘導地培養基中的細菌能盡量處于同步生長狀態，以便于產物的大量表達，在按排實驗時前一天應考慮到將過夜菌接種培養，該實驗的時間較長，第一次操作時，時間安排不當，當天可能做不完，而表達產物又不適合于過夜放置，應當予以注意。實驗三重組蛋白的聚丙烯凝膠電泳（PAGE）一、實驗原理聚丙烯酰胺凝膠電泳由丙烯酰胺單體和交聯劑甲又雙丙烯酰胺，在催化劑作用下，形成三維網狀結構，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具有很高的分辨率，這主要是由于濃縮膠的濃縮效應和分離膠的分子篩效應。在濃縮膠中，緩沖液pH為6.8,HCI幾乎全部解離；甘氨酸的等電點為Ph6,解離度小；蛋白質的等電點多為pH5左右，其解離度在HCI和甘氨酸之間，在電場中，遷移率大小次序為CI＞Pro＞Gly，電泳開始后，CI超過了蛋白質，將蛋白質離子推倒它的后面，Gly則將蛋白質離子推到它的前面，由于濃縮膠和分離膠的不連續pH梯度作用，可在二者之間形成三種離子的界面，蛋白質離子就聚集在Cl和Gly之間，原來lcm厚的樣品層可以被壓縮至0.25μm，樣品被壓縮成一條狹窄區帶，從而提高了分離效果。在分離膠中，緩沖液的pH為8.8,甘氨酸進入分離膠后解離度大為增加，其遷移率與Cl相仿，泳至蛋白質離子前面，因此濃縮效應消失。蛋白質具有不同的電荷和分子量，在經過陰離子去污劑SDS處理后，蛋白質分子上的電荷被中和，蛋白質分子帶上均一負電荷，在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，不同的蛋白質按照其分子量大小進行分布，電泳遷移率僅取決于蛋白質的分子量，此時，由于凝膠濃度增加，孔徑變小，分子篩效應起主要作用，使得電泳遷移率僅取決于蛋白質的分子量大小。采用考馬斯亮藍快速染色，可及時觀察電泳分離效果。二、試劑與材料1、30%（W/V）凝膠貯存液丙烯酰胺30克；甲又雙丙烯酰胺0.8克加蒸餾水溶到100ml，用新華3號濾紙過濾，棕色瓶中4℃保存2、4×分離膠緩沖液（HCI調pH至8.8）Tris18.2g;SDS0.4g,加蒸餾水深至100ml3、4×濃縮膠緩沖液（HCI調pH至6.8）Tris6.06g;SDS0.4g,加蒸餾水溶至100ml4、10×PAGE電泳緩沖液Tris30.3g;Glycine144.2g;SDS10g,加蒸餾水溶至1000ml5、2×蛋白上樣緩沖液（HCI調pH至6.8）Tris1.21g;SDS4g;2-Mercaptoethanol10ml;Glycerol20ml;BromophenolBlue0.2g,加蒸餾水溶至100ml6、染色液：95%乙醇500ml冰醋酸100ml考馬斯亮藍2.5g,加蒸餾水溶至1000ml7、脫色液：95%乙醇55ml冰醋酸75ml，加蒸餾水至1000ml8、10%過硫酸銨（AP）、TEMED9、SDS低分子量蛋白Maker97.4、66.2、43、31、20.1、14.4KD10、SDS電泳裝置11、脫色搖床三、操作1、將玻璃板洗滌干凈，固定于電泳憎上，用0.8%瓊脂糖凝膠封底（約高5mm）。2、灌分離膠：7.5%10%12%15%6ml6ml6ml6mlH2O3ml2.5ml2.1ml1.5ml30%凝膠貯存液1.5ml2ml2.4ml3ml4×分離膠緩沖液（pH8.8）1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml10%過硫酸銨60μl60μl60μl60μlTEMED3μl2.5μl2μl1.5μl加入TEMED后立即混勻，小心灌入玻璃板夾層中，（膠頂距離Teflon梳子5mm左右），然后用100μl正于醇封頂，保持膠面平整。3、灌濃縮膠：待分離膠凝固后，倒出正丁醇和析出的水相，灌入濃縮膠，插好Teflon梳子。4.5%4.5%4ml2mlH2O2.4ml1.2ml30%凝膠貯存液0.6ml0.3ml4×分離膠緩沖液（pH8.8）1ml0.5ml10%過硫酸銨40μl20μlTEMED4μl2μl4、樣品處理：蛋白樣品加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，沸水浴5-10分鐘（冷卻后上樣）5、上樣：在電泳槽中加入1×PAGE電泳緩沖液，小心拔出梳子，上樣10-20μl.6、電泳：起始用低電壓8V/cm（約60V），當溴酚蘭前沿進入分離膠后，電壓提高位15V/cm（約120V），直到溴酚蘭泳到膠底為止。關閉電泳儀。7、剝膠：取出玻璃板，小心撬開，切除封底膠和濃縮膠，切去左右上角作記號。8、染色和脫色：將凝膠浸泡在染色液中，振蕩染色1-2小時，有時可根據染色液質量，染色過夜。然后換脫色液，洗至背景干凈、條帶清晰為止。9、染色和脫色：拍照或用干膠機干膠保存。注意：1、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（KD）1512-431016-687.536-945.057-2122、宿主菌都有其自身的蛋白質，表達的產物在SDS電泳時，其分子量可能會與宿主菌的蛋白質條帶重疊，給分析結果帶來麻煩，遇到這種情況。一般采用以下幾種辦法來處理：①比較表達結果與對照結果中各條蛋白帶的濃度，并選擇幾條肉眼看到濃度無差別的蛋白帶為比較對照，尋找表達結果中是否有濃度增加的蛋白條帶。如果有，則可進一步分析；②改變電泳膠的濃度（調整電泳膠的有效分辨范圍），使蛋白重疊條帶分開；③SDS轉膜后用抗血清或抗體做免疫westernBlot（免疫印跡實驗），觀察表達結果中是否有特異性條帶出現。3、影響蛋白電泳的因素有：①樣品的鹽濃度；②SDS的質量；③緩沖液的pH值不準；④上樣孔的不平整。必要是，可在拔出Teflon梳子后沖洗上樣孔，以防止殘留的丙烯酰胺再凝聚，造成上樣孔的不平齊。實驗四重組蛋白純化：可溶性HisTag-蛋白的抽提一、實驗原理一般在大腸桿菌高效表達真核基因時，所產生的產物常以包涵體的形式存在，用超聲儀破裂細菌后進行離心，表達產物存在于離心管底，而不在上清液內，因此當上清液內分析不到樣品時，應考慮分析離心沉淀物，最好是第一次分析所表達的產物時，將兩者同時進行電泳分析，以確定表達產物在宿主菌內的存在形式。包涵體產物一般不能直接用于常規層析方法進行純化，必須用鹽酸服等非離子型強變性劑溶解，并用不同的方法待產物復性后才能進行常規分離純化，否則會給后期實驗帶來不便。原核表達系統表達基因，其產物在宿主中的存在形式并不是固定不變的，隨培養基的營養狀況、誘導培養的時間和表達效果的高低而不同。如果能將表達產物變成可溶性形式，將有昨于后續實驗的快速開展，表達菌培養時，營養狀況好、誘導表達時間短、表達效率降低都有利于可溶性表達產物的形成。pET28原核表達系統的表達產物C末端均融合帶有HisTag序列蛋白，據此可用Novagen的His.Binda系列樹脂和劑盒來純化，其原理是通過固定化金屬親和層析（IMAC）來快速一步純化His-Tag序列蛋白。His.Tag序列（6、8或10個連續的組氨酸殘基）與固定在NTA-或IDA-的His.Bind樹脂上的二階陽離子Ni2+結合，洗去未結合蛋白后，用咪唑或稍低pH的洗脫液進行洗脫，從而回收目標蛋白。也可用于6M胍或尿素變性法溶解的包涵體蛋白。二、試劑與材料1、細菌誘導表達實驗的所有器材2、10mg/ml溶菌酶3、10%TritonX-1004、制冰機、高速離心機、超聲波儀5、Novagen公司的NTA-His.Binda樹脂和試劑盒6、SDS實驗的所有器材三、操作：1、樣品準備（1）準備細菌，接種，誘導表達。[IPTG]：lmM；37℃（或低溫：30℃、24℃等）；3小時或更長時間（如過夜）。（2）冰上冷卻后離心，收集細菌，加入1/20細菌生長體積的NTA-0Buffer，重懸；加10mg/ml溶菌酶（終濃度0.3mg/ml），冰上放置30分鐘，超聲破碎細菌。（3）加入10%TritonX-100(終濃度0.1%)，混勻，冰上放置15分鐘，視具體情況可再次超破碎。（4）13000rpm，離心10分鐘，取上清置于冰上，準備純化。2、純化（1）將NTA樹脂（一般為1ml）裝入層析柱，用NTA-0Buffer洗去乙醇。（2）將上述的上清加到NTA層析柱中，可收集流出成分，用于SDS分析蛋白的結合情況。（3）用NTA-0Buffer洗4-5次（視具體情況而定），每次1ml，洗去雜蛋白。（4）用NTA-40Buffer洗2次，每次1ml，其中會含有目的蛋白和雜蛋白。（5）用NTA-100Buffer洗4次，每次500ul，主要含有目的蛋白。（6）用NTA-200Buffer洗4次，每次500ul，主要含有目的蛋白。（7）用NTA-1000Buffer洗2次，每次500ul，主要含有目的蛋白。3、分析每次都要收集流出成分，取100ul樣品進行SDS分析，選取雜蛋白最少，目的蛋白最多的樣品進行以后的實驗。注意：對于不同的可溶性蛋白，進行純化的洗滌Buffer和洗脫Buffer均不同，所以在條件允許時可以用含有不同咪唑濃度的Buffer進行實驗，選擇最佳洗滌和洗脫條件進行純化蛋白。附：NTABuffer溶液配方NTA-0Buffer：20mMTris-HCIpH7.9,1MNaCl,10%Glycerol.NTA-40Buffer:20mMTris-HCIpH7.9,1MNaCl,10%Glycerol,40mMImidazole.NTA-100Buffer:20mMTris-HCIpH7.9,1mNaCl,10%Glycerol.100mMlmidazole.NTA-200Buffer:20mMTris-HCIpH7.9,1MNaCl,10%Glycerol,200mMImidazole.NTA-1000Buffer：20mMTris-HCIpH7.9,1MNaCl,10%Glycerol,1000mMImidazole.NTA-樹脂上海博彩公司有售實驗五蛋白質免疫印跡分析（WesternBlot）一、實驗原理經過SDS分離的蛋白質樣品，轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變，以固相載體上的蛋白質或多肋作為杭原與對應的抗體超免疫反應，再與酶或同位家標記的第二抗體起反應，經過底物顯色或放射自顯影以檢查電泳分離的待異性目的基因表達的蛋白成分。二、試劑與材料1、SDS實驗的全部材料2、電轉移裝置3、硝酸纖維察薄膜（0.45μm），濾紙4、轉移電泳緩沖液（pH8.3）Tris3.03gGlycine14.4gMethanol200ml加蒸餾水溶至1000ml5、PBS（pH7.4）Na2HPO412H2O3.63gKH2PO40.24gNaCl8gKCl0.2g加蒸餾水溶至1000ml，15磅（1.034×10Pa）高壓滅菌20分鐘。6、洗滌液（PBST）PBS（pH7.4）1000mlTween200.5ml7、封閉液：含5-6%脫脂奶粉之PBS8、一抗：9、酶標二抗：（如辣根過氧化物酶標記的SPA）10、底物液（臨用前配）：4一氨一1一蔡酚3mgMcthanol1mlPBS（pH7.4）5ml30%H2O25μl11、玻璃大平皿三、操作：1、對基因工程產物的蛋白樣品進行SDS電泳分離。2、轉膜：（1）切除凝膠多余的邊緣部分，用直尺量的膠的長和寬，計算出面積。然后將膠浸入轉移緩沖液中平衡10min（搖床上進行）。（2）載8張同膠大小的濾紙和一張硝酸纖維素膜，均用轉移緩沖液平衡10min（搖床上進行）。將兩張濾紙疊為一層。（3）從電極負極到正極依次按下圖順序疊放如下：海綿、濾紙一層、電泳凝膠，硝酸纖維素膜、三層濾紙、海綿，操作時注意不要有氣泡出現在里面。固定好后放入電泳槽中，接通電源，以每平方厘米4毫安的恒安電流轉移30分鐘-45分鐘。3、封閉：轉膜結束，關閉電源，取出硝酸纖維素膜。將膜浸入封閉液中，脫色搖床上緩慢振蕩30分鐘。4、加一抗：將膜用PBST洗三次，每次五分鐘，然后加入已作適當稀釋的一抗中，37℃振蕩1小時，或室溫緩慢振蕩2小時，或4℃振蕩過夜。5、加酶標二抗：用PBST洗膜三次，每次五分鐘，然后加入酶標二抗，37℃振蕩1小時，室溫振蕩緩慢振蕩2小時。6、顯色：用PBST洗膜三次，每次五分鐘，然后將膜進入到底物液中，輕輕晃動數秒后避光靜置，待特異性條帶清晰顯現即換ddH2O以終止反應。注意：1、接觸硝酸纖維素膜需帶手套。2、轉移電流不能太大以免產熱過多，影響條帶清晰度。3、封閉液有小牛血清，脫脂奶粉等。但如果封閉液中含有能和一抗結合的蛋白質、就要避免使用這種封閉液。4、PVDF（聚偏二氟乙烯）膜是一種新的固相膜載體，有很好的化學穩定性和機械強度，固定效果好，敏感度提高，轉移后的標本不僅可做免疫學檢測，而且可直接進行蛋白質或多膚的氨基酸序列分析。微生物工程學實驗實驗一種子、發酵培養基制備及培養基實消一、實驗目的：了解種子培養基的配置了解發酵培養基的配制掌握培養基滅菌的方法二、實驗器材：菌種：重組大腸桿菌種子培養基：牛肉膏、蛋白陳、NaCl、瓊脂糖發酵培養基：牛肉膏、蛋白陳、NaCl器材：無菌吸管，無菌空平皿，吸球，天平，試管，量筒，小燒杯，大燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，牛皮紙，麻繩，標簽三、操作步驟配：種子斜面、種子平板、種子培養基20ml(50ml三角瓶)一批、發酵培養基200ml（1000ml三角瓶）一批1、種子培養基配方：牛肉膏-3.0克、蛋白陳-lO.0克、NaCl-5.0克、蒸溜水-1000毫升、調整pH至7.42、發酵培養基配方：可溶性淀粉-10g、(NH4)SO4-2.6g、KH2PO4-5.7g、K2HPO4-1.7g、蒸溜水-1000毫升、調整pH至7.2—7.43、計算稱量：根據配方，計算出實驗中各種藥品所需要的量，然后分別稱(量)取。4、溶解：一船情況下，幾種藥品可一起倒入燒杯內、先加入少于所需要的總體積水進行加熱溶解(但在配制化學成分較多的培養基時，有些藥品，如磷酸鹽和鈣鹽、鎂鹽等混在一起容易產生結塊、沉淀，故宜按配方依次溶解。個別成分如能分別溶解，經分開滅菌后混合，則效果更為理想)。加熱溶解時，要不斷攪拌。如有瓊脂在內，更應注意。待完全溶解后，補足水分到需要的總體積。5、調節pH：用滴管逐滴加入1NNaOH或lNHCl邊攪動；邊用精密的pH試紙測其pH值，直到符合要求時為止。pH值也可用pH計來測定。pH值可略高，高壓滅菌后pH值會下降。6、分裝：按照實驗要求進行分裝。裝入試管中的量不宜超過試管高度的1/5，裝入三角燒瓶中的量以燒瓶總體積的一半為限。在分裝過程中，應注意勿使培養基沾污管口或瓶口、以免弄濕棉塞，造成污染。7、加塞：培養基分裝好以后，在試管口或燒瓶口上應加上一只棉塞。棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物進入培養基內，防止由此而引起的污染；另一方面保證有良好的通氣性能，使微生物能不斷地獲得無菌空氣。因此棉塞質量的好壞對實驗的結果有很大影響。8、滅菌：在塞上棉塞的容器外面再包一層牛皮紙，以防冷凝水沾濕，便可進行滅菌。培養基的滅菌時間和溫度，需按照各種培養基的規定進行，以保證滅菌效果和不損壞培養基的必要成分。常用：121℃如果分裝的斜面，要趁熱擺放并使斜面長度適當(為試管長度1/3-l/2，不能超過1/2)。培養基經滅菌后，應保溫培養2-3天，檢查滅菌效果，無菌生長者方可使用。四、注意事項1、配制固體培養基用的瓊脂應先行用冷水浸泡，紗布過濾，在調好pH值后加入。2、配制發酵培養基時應小心溶解淀粉，不要成團。五、思考題種子培養基、發酵培養基的應用原理？實驗二發酵種子擴大培養、一級種子制備一、實驗目的：1、了解種子擴大培養的程序2、學習一級種子制備的方法二、實驗器材：重組大腸桿菌、種子斜面、種子平板、種子培養基、發酵培養基、超凈工作臺、搖床、移液管等三、操作步驟種子制備1.1將冰箱中保存的重組大腸桿菌菌種，無菌操作下接種于種子斜面，37℃中恒溫培養16-18h.1.2從種子斜面接種種子平板四區劃線分離，37℃中恒溫培養種子擴大培養挑取種子平板上單克隆菌落，接種于20ml種子培養基(50ml三角瓶)，30℃中恒溫搖床培養16-18h，即得新鮮一級種子制備1000ml三角瓶中裝發酵培養基200ml，用滅菌移液管吸取20ml新鮮種子液接種于三角瓶中，在搖床中30℃、200rpm條件下恒溫培養四、注意事項將冰箱中保存的菌種取出，應在37℃恒溫培養箱中種子培養與一級種子制備的培養基、時間均不同。搖床的使用應注意轉速。五、思考題種子擴大培養、一級種子制備的特點與原理？實驗三接種與發酵過程控制管理一、實驗目的：了解大腸桿菌菌發酵的基本過程。學習發酵過程中的一些重要參數的調控。二、實驗器材：5L小型發酵罐、空氣壓縮機、蒸汽發生器、紫外分光光度計等三、操作步驟1．上罐前的準備1.1洗凈發酵罐及各連接管路1.2取配制、滅菌好的發酵培養基3L，置于罐內，并加入適量消泡劑1.3校正pH電極（pH8.0)和溶氧電極1.4按發酵罐的使用方法滅菌（見附錄）2．上罐時的操作步驟按工藝要求設置培養溫度（37℃3．發酵過程中各指標的測定發酵過程中，雖然能自動監控溫度、pH值等重要參數，但是仍然需要專人負責照看，完成下列工作：經常注意發酵罐的運轉是否正常，檢查各控制參數是否在合適的范圍內，遇到故障及時排除。每3h取樣測定：發酵液的光密度值、鏡檢觀察細胞形態，以了解細胞的生長情況及檢查是否有雜菌污染。隨著培養時間的延長，適當調節進氣量和攪拌轉速，以維持一定的DO值（溶氧濃度）。定時取樣，放入冰箱冷藏保存，至發酵結束后集中測定SOD酶活大小。每小時記錄發酵過程的培養溫度、攪拌轉速、pH、溶氧濃度、空氣流量等參數，并記錄操作情況。4．放罐經過大約48h發酵，菌體生長進入穩定期，便可放罐。發酵液離心后得到的上清液進入下一步的分離提純操作。5．清洗放罐后，向發酵罐內加入2.5L水，攪拌片刻，取出pH、DO電極，清洗干凈并要求進行保養放置。四、注意事項應嚴格按照工藝要求規范操作，合理安排輪流值班。五、思考題整理發酵過程中所測定的各種數據資料。寫出發酵過程各操作步驟。實驗四發酵液SOD活性檢測一、實驗目的掌握酶活測定方法學習發酵過程中的一些重要參數的調控二、基本原理見生化工程SOD粗酶液提取部分。三、操作1.將發酵液進行離心，6000rpm，10min，收集沉淀用2.5mM磷酸鉀緩沖液洗滌2次，離心收集菌體。2.用2.5mM磷酸鉀緩沖液15mL將菌體重懸，超聲破碎細菌至細菌懸液變的清亮透明。8000rpm，10min，上清即為SOD粗酶液。3.測定SOD酶活性，具體見生化工程酶活性測定一章。

生化工程學實驗實驗一超氧化物歧化酶粗酶液的分離純化一目的與要求(1)通過超氧化物歧化酶的分離純化,了解有機溶劑沉淀蛋白質以及纖維素離子交換層析方法的原理。(2)掌握測定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法。二原理超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)簡稱SOD,它廣泛存在于各類生物體內,按其所含金屬離子的不同,可分為3種:銅鋅超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)、錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和鐵超氧化物歧化酶(Fe-SOD)。SOD催化如下反應:O2.-+O2-+2H+→H202+02在生物體內,它是一種重要的自由基清除劑,能治療人類多種炎癥、放射病、自身免疫性疾病和抗衰老,對生物體有保護作用。在重組大腸桿菌里Mn-SOD與菌體蛋白等共存于細菌內,當細菌破裂后,用氯仿–乙醇處理溶血液,使菌體蛋白沉淀,而Mn-SOD-SOD則留在水-乙醇均相溶液中。磷酸氫二鉀極易溶于水,在乙醇中的溶解度甚低,將磷酸氫二鉀加入水-乙醇均相溶液中時,溶液明顯分層,上層是具有Cu·Zn-SOD活性的含水-乙醇相,下層是溶解大部分磷酸氫二鉀的水相(比重大)。用分液漏斗處理,收集上層具有SOD活性的含水-乙醇相,再加入有機溶劑丙酮，使SOD沉淀。極性有機溶劑能引起蛋白質脫去水化層,并降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用,致使蛋白質顆粒凝集而沉淀。采用這種方法沉淀蛋白質時,要求在低溫下操作,并且需要盡量縮短處理時間,避免蛋白質變性。將上一步收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸餾水中,在pH7.6的條下,Cu·Zn-SOD帶負電,過DE-52纖維素陰離子交換柱可得到進一步純化。三試劑和器材1、材料重組大腸桿菌發酵液。2、試劑95%乙醇,氯仿,k2HP04·3H20,丙酮,pH7.6,2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液,2OOmmol/L磷酸鉀緩沖液,DE-52纖維素等。3、器材離心機,751-GW型分光光度計,梯度混合器,玻璃柱(1.0×10cm),試管,自動收集器,紫外檢測儀,移液管,量筒,燒杯,四、操作1.將50mL發酵液進行離心，6000rpm，10min，收集沉淀用2.5mM磷酸鉀緩沖液洗滌2次，離心收集菌體。2.用2.5mM磷酸鉀緩沖液15mL將菌體重懸，超聲破碎細菌至細菌懸液變的清亮透明。8000rpm，10min，上清即為SOD粗酶液（留樣1mL測酶活和蛋白含量）。3.向上清中緩慢加入在4℃下預冷過的95%乙醇125mL(0.25倍體積),然后再緩慢加入在4℃下預冷過的氯仿75mL(0.15倍體積),充分攪拌,室溫下600Orpm，10min,棄去沉淀,收集上清液約12mL(留樣0.5mL測酶活和蛋白含量4.加入K2HP04·3H20(按43gk2HP04·3H20/100mL粗提液的比例),轉移到分液漏斗,振搖后靜置5min,見分層明顯。收集上層乙醇-氯仿相(微混濁),室溫下離心6000rpm，10min,棄去沉淀,得上清液約8mL(留樣0.5mL測酶活和蛋白含量)。5.向上一步得到的上清液加入0.75倍體積在4℃下預冷過的丙酮,Mn-SOD便沉淀下來。室溫下離心6000rpm，10min,收集灰白色沉淀物。將此灰白色沉淀物溶于約3mL重蒸水中(呈懸浮狀),在4℃下,對250mLpH7.6,2.5mmol/L的磷酸鉀緩沖液透析,每隔0.5h以上,換透析外液1次,共換2-3次。透析內液如出現沉淀,需在室溫下6000rpm，10min,棄去沉淀,收集上清液約5ml(留樣6.DE-52纖維素柱層析DE-52纖維素的處理:稱量DE-32纖維素干品5-6g用自來水浮選除去1-2min不下沉的細小顆粒,用G3燒結漏斗抽干,濾餅放人燒杯中,加適量lmol/LNaOH溶液,攪勻后放置15min,用G3燒結漏斗抽濾,水洗至中性,濾餅懸浮于lmol/LHCl溶液中,攪勻后放置lOmin后用G3燒結漏斗抽濾,水洗至中性,濾餅再懸浮于1mol/LNaOH溶液中,抽濾,水洗至中性,最后將濾餅懸浮于層析柱平衡緩沖液中待用。DE-32纖維素使用后的回收處理與上述步驟相同,只是不用HCl所用NaOH，濃度改為0.5mol/L。 將上一步所得離心上清液過DE-32纖維素柱。柱體1.O×10cm,用pH7.6,2.5mmol/L磷酸鉀緩沖液作層析柱平衡液,用pH7.6,25mmol/L(100mL)-200mmol/L(l00mL)的磷酸鉀緩沖液進行梯度洗脫。流速30mL/h,每管收集3mL,記錄總體積。.實驗二超氧化物歧化酶蛋白濃度和酶活性的測定一目的要求掌握蛋白含量和SOD酶活性的測定方法。二、原理根據國際酶學委員會規定，酶的比活性用每毫克蛋白質具有的活性單位來表示，因此，測定樣品的比活性必須測定：（1）每毫升樣品中的蛋白質毫克數。（2）每毫升樣品中的酶活性單位數。超氧化物歧化酶活性的測定方法較多,常采用鄰苯三酚((HO)3C6H81,2,3-benzenetriol)自氧化法。鄰苯三酚自氧化的機理極為復雜,它在堿性條件下,能迅速自氧化,釋放出O2-,生成帶色的中間產物。反應開始后,反應液先變成黃棕色,幾分鐘后轉綠,幾小時后又轉變成黃色,這是因為生成的中間物不斷氧化的結果。這里測定的是鄰苯三酚自氧化過程中的初始階段,中間物的積累在滯留30-45s后,與時間成線性關系,一般線性時間維持在4min的范圍內。中間物在420nm波長處有強烈光吸收,當有SOD存在時,由于它能催化O2-與H+結合生成02和H202,從而阻止了中間物的積累,因此,通過計算就可求出SOD 鄰苯三酚自氧化速率受pH,濃度和溫度的影響,其中pH影響尤甚,因此,測定時要求對pH嚴格掌握。現試劑公司開發的SOD試劑盒使用較方便，靈敏度高。測定蛋白質含量可用卡馬斯亮藍法，該方法靈敏度高，操作簡便。三、試劑pH8.的100mmol/LTris-二甲胂酸鈉緩沖液(內含2mmol/L)二乙基三氨五乙酸)，10mmol/LHCL，6mmol/L連苯三酚，卡馬斯亮藍G250，標準蛋白等等。四、操作1.卡馬斯亮藍法測蛋白（1）取7只試管，編號，按下表操作：12345標準空白各階段樣品（毫升）0.10.20.20.30.5蒸餾水0.40.30.30.20.40.5標準蛋白溶液1g/L（毫升）0.1G250（毫升）5.05.05.05.05.05.05.0立即混勻，室溫放置2-3分鐘，595nm比色，空白管調零。（2）計算出各階段樣品的蛋白濃度。2.酶活性的測定 （1）鄰苯三酚自氧化速率的測定 在試管中按表441加入緩沖液和重蒸水,25℃下保溫20min,然后加入25℃預熱過的鄰苯三酚(對照管用10mmol/LHC1代替鄰苯三酚),迅速搖勻,立即傾人比色杯中,在420nm波長處測定A值,每隔30s讀數一次,要求自氧化速率控制在0.06OA/mn(可增減鄰苯三酚的加人量,使速率正好是（2）酶活性的測定酶活性的測定按表2加樣,操作與測定鄰苯三酚自氧化速率相同。根據酶活性情況可適當增減酶樣品的加入量。 酶活性單位的定義:在lmL反應液中,每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時的酶量定義為一個活性單位,即在420nm波長處測定時,0.03OA/min為一個活性單位。若每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率在35-65%范圍,通常可按比例計算,若數值不在此范圍時,應增減樣品加入量。表1領苯三酚自氧化速度測定加樣表試劑對照管/mL樣品管/mL最終濃度/(mmol/L)pH8.的100mmol/LTris-二甲胂酸鈉緩沖液(內含2mmol/L)二乙基三氨五乙酸)4.54.550,Ph8.2Tris-二甲胂酸鈉緩沖液(內含1mmol/L)二乙基三氨五乙酸)重蒸水4.24.2-10mmol/LHCL0.3--6mmol/L連苯三酚-0.30.2總體積99-0.060―酶樣品管自氧化速率0.060（0.060―酶樣品管自氧化速率0.060XX100%50%每毫升酶液活性單位（U/mL）=50%酶樣品液稀釋倍數酶樣品液稀釋倍數酶樣品液體積X反應液總體積X酶樣品液體積總活性（U）=每毫升酶液活性單位(U/mL)X酶原液總體積每毫升酶液活性單位每毫升酶液活性單位(U/mL)比活==總活性單位數(U)每毫升蛋白濃度每毫升蛋白濃度(mg/mL)總蛋白(mg)表2酶活性測定加樣表試劑對照管/mL樣品管/mL最終濃度/(mmo