第第頁液相色譜柱的使用注意事項及再生液相色譜是如何工作的液相色譜柱的使用注意事項及再生1、色譜柱的使用說明：（1）、色譜柱使用前注意事項：色譜柱的儲存液無特別說明，均為評價報告所示的流動相。在使用前，確定要注意色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應先用10％左右的低濃度的有機相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機相中很簡單析出，堵塞色譜柱。（2）、流動相：流動相中所使用的各種有機溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水可以是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。假如將所配得流動相再經過0.45μm的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統中的在線過濾器等裝置應當定期清洗或更換。以常規硅膠為基質的鍵合相填料通常的PH值適用范圍是2.0—8.0，BDSC18適合于堿性化合物，PH值適用范圍為2.0—10.0。當必需要在PH值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結束后立刻用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗，并完全置換掉原來所使用的流動相。（3）、樣品：樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預處理柱（SPE）對樣品進行預處理；若樣品不便處理，要使用保護柱。在用正相色譜法分析樣品時，全部的溶劑和樣品應嚴格脫水。2、色譜柱的保存（1）、反相色譜柱每天試驗后的保養：使用緩沖液或含鹽的流動相，試驗完成后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應當在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。（2）、長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存，必需存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度可以是室溫。3、色譜柱的再生由于色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進樣次數的加添，會顯現色譜峰高降低，峰寬加大或顯現肩峰的現象，一般來說可能是柱效下降。（1）、反相柱的再生：依次接受20—30倍的色譜柱體積的甲醇：水=10：90（V/V），乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反次序沖洗色譜柱。（2）、正相柱的再生：依次以20—30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的次序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必需嚴格脫水。4、色譜柱在使用過程中易顯現的問題和解決方法色譜柱在使用中較為常見的問題就是柱壓上升，假如柱壓是在長時間使用過程中緩慢加添，屬于正常現象。但柱壓在使用過程中驀地上升（系統管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點：（1）、色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；（2）、色譜柱頭的填料被樣品污染；（3）、色譜柱內緩沖液中的鹽碰到高濃度的甲醇或其他有機溶劑，形成結晶析出；（4）、流動相PH值過大或過小使固定相結構破壞或溶解。解決方法如下：（1）、如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在10％的稀硝酸內超聲清洗10分鐘，后再用純水超聲10分鐘，重新裝入色譜柱。（2）、如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，認真修復后，重新安裝上柱頭螺絲。（3）、如確定定是鹽結晶，用10%的甲醇/水沖洗色譜柱使柱內鹽全部溶解，再換高濃度甲醇。（4）、假如因PH值使用不當，很難恢復。

液相色譜是目前應用多的色譜分析方法，液相色譜系統由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器構成，其整體構成仿佛于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調整。液相色譜的流動相通常是各種低沸點溶劑和水溶液。它是影響分別的一個特別緊要因素。在實際工作中，流動相的選擇和優化是確定色譜分析的緊要工作。

選擇方法

1、由強到弱：一般先用90%的乙腈（或甲醇）/水（或緩沖溶液）進行試驗，這樣可以很快地得到分別結果，然后依據出峰情況調整有機溶劑（乙腈或甲醇）的比例。

2、三倍規定：每削減10%的有機溶劑（甲醇或乙腈）的量，保留因子約加添3倍，此為三倍規定。這是一個聰慧而又省力的方法。調整的過程中，注意察看各個峰的分別情況。

3、粗調轉微調：當分別達到確定程度，應將有機溶劑10%的更改量調整為5%，并據此規定漸漸降低調整率，直至各組分的分別情況不再更改。

脫氣方法

1、吹氦脫氣法

利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排出溶解的空氣，能排出接近80%的氧氣。接受一個分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎全部氣體排出。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但氦氣價格較高，很少使用。

2、加熱回流法

此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。

3、抽真空脫氣法

此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa，即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑構成發生變化，從而影響到試驗的重現性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。

4、超聲波脫氣法

將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果差。

5、在線脫氣法

HPLC儀器均可配置專門的在線脫氣機。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。

注意事項

1、流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45m濾膜過濾、脫氣，清除微粒和灰塵。在送液泵內，為了防止雜物（固體）進入流路，裝有吸濾器，但網孔徑為10m，比此更小的顆粒仍舊可通過，這會導致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45m濾膜過濾。流動相溶劑須經脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時，或壓力溫度變化時簡單產生大量氣泡，會導致泵誤動作和輸液不暢，檢測器產生噪聲信號等。

2、流動相恢復到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復到室溫前，基線水平很難穩定，特別是發生漂移，也簡單產生氣泡等現象。水與有機溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務必注意。

3、做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水，水相流動相需常常更換，防止長菌變質。使用去離子水、針劑水、純潔水（炊用）并不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結果。

4、流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復的

5、用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用后都要用水清洗流路，禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。

6、若需要使用含鹽的流動相，使用前請務必過濾。并且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機相（有機相含量應不低于10%）的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現用現配，以免流動相因繁殖微生物而造成柱填料的污染。

7、進行梯度試驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性，避開因流動相不互溶而導致的緩沖鹽析出問題。反相系統更換正相系統或正相系統更換反相系統時，用異丙醇置換系統內的儲存流動相后在接柱子。

8、在更換兩種互不相溶的流動相時，中心要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然后在用正己烷做流動相時，確定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。

9、儀器在短期（兩三天）不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應用甲醇。

10、對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時，要使用UV吸取性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。

11、當流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，假如壓力漸漸降低，基線也顯現異常。這是由于乙氰的粘性大，導致泵的流速降低。可適當提高流速使泵的壓力恢復正常即可。

12、流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管簡單分裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避開使用。非用不可時，分析完了后，應立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。

13、用于檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。

14、注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。

在液相色譜儀的日常分別分析工作中，其色譜柱的正確使用和維護特別緊要，色譜柱使用是否得當，直接影響色譜柱的壽命及液相色譜儀的使用效果，在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護儀器。

1、柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必需防止較強的機械振動，以免柱床產生空隙。

2、假如儀器用來做常規分析，樣品種類有限，但分析次數多，則不妨為每一類常規分析配置一根柱，這樣有助于延長柱子的壽命。

3、避開壓力和溫度的急劇變化及任何機械震動。溫度的驀地變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內的填充情形；柱壓的驀地上升或降低也會沖動柱內填料，因此在調整流速時應當緩慢進行，在閥進樣時閥的轉動不能過緩。

4、應漸漸更改溶劑的構成，特別是反相色譜中，不應直接從有機溶劑更改為全部是水，反之亦然。

5、如使用柱溫掌控裝置時，應注意在通人流動相后才能升溫。

6、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質。否則反沖會快速降低柱效。

7、選擇使用適合的流動相，以避開固定相被破壞。有時可以在