代替GB/T18643—2002DiagnostictechniquesforMarek'sdisease國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會GB/T18643—2021 I Ⅱ 3臨床診斷 35瓊脂免疫擴散試驗檢測 46PCR檢測 6 8附錄A(規范性附錄)病毒分離用溶液配制 9附錄B(規范性附錄)瓊脂免疫擴散試驗用溶液配制 IGB/T18643—2021本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準代替GB/T18643—2002《雞馬立克氏病診斷技術》。本標準與GB/T18643—2002相比主要技術變化如下：——修改了鑒別診斷部分的描述(見3.4,2002年版的3.4);-——增加了病毒分離檢測方法(見第4章，附錄A);——增加了PCR檢測方法(見第6章，附錄B);———增加了熒光定量PCR檢測方法(見第7章，附錄C)。本標準的修訂參考了OIE《陸生動物診斷實驗和疫苗標準手冊》(2017版),并結合國內外技術研究新成果，與國際先進技術保持一致。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別這些專利的責任。本標準由中華人民共和國農業農村部提出。本標準由全國動物衛生標準化技術委員會(SAC/TC181)歸口。本標準起草單位：中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所、中國動物衛生與流行病學中心。本標準所代替標準的歷次版本發布情況為：ⅡGB/T18643—2021雞馬立克氏病(Marek'sdisease,MD)是一種雞的高度傳染性、以淋巴細胞增生為特征的腫瘤性疾病，由雞皰疹病毒2型(Gallidherpesvirus2,GaHV-2),即雞馬立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirus,MDV)引起。MD一般發生于3周齡以上的禽只，多發生于12周齡～30周齡。MD可引起多種嚴重的病癥，其中淋巴組織增生是最常見也是最重要的一種。經典型MD主要侵害神經組織，死亡率很少超過10%～15%,可持續數周至數月。急性型MD可使發病雞內臟器官產生淋巴瘤，發病率一般為10%~30%,暴發流行時發病率可高達70%。死亡率可能在數周內迅速增加，然后死亡停止，也可能在數月內MD在臨床診斷上容易與雞的其他腫瘤性疾病，禽白血病(Avianleukosis,AL)和禽網狀內皮組織增生病(Reticuloendotheliosis,RE),發生混淆。一般需要通過流行病學和病理組織學進行鑒別診斷。感染和感染雞排毒。由于MD疫苗普遍應用，以及疫苗的自身特點，臨床上MD疫苗毒株的接種和野從感染雞組織中分離MDV可用于該病的檢測。通常選用從抗凝血樣中分離的淋巴細胞、腎細胞或脾細胞懸液作為分離病毒用的材料，也可以用羽髓組織漿液作為MDV分離材料。細胞懸液或羽髓組織漿液可接種雞腎細胞(Chickenkidneycells,CKC)、鴨胚成纖維細胞(Duckembryofibroblast,DEF)或雞胚成纖維細胞(Chickenembryofibroblast,CEF)進行病毒分離。應用瓊脂免疫擴散試驗(Agargelimmunodiffusion,AGID)對羽髓MDV抗原進行血清學檢測，可以確定MDV感染。AGID是檢測抗體最常用的方法，然而由于MD疫苗毒株也可以刺激機體產生相應的抗體，抗體的檢測對于MD的臨床診斷僅具有參考價值。PCR(Polymerasechainreaction,PCR)方法可以用于檢測MDV,PCR法還可以鑒別MDV血清I型野毒株和疫苗毒株。1GB/T18643—2021雞馬立克氏病診斷技術本標準規定了雞馬立克氏病臨床診斷，以及病毒分離、瓊脂免疫擴散試驗、PCR檢測和熒光定量PCR檢測等實驗室檢測的技術要求和綜合判定。AGID:瓊脂免疫擴散試驗(Agargelimmunodiffusion)CEF:雞胚成纖維細胞(Chickenembryofibroblast)CKC:雞腎細胞(Chickenkidneycells)DEF:鴨胚成纖維細胞(Duckembryofibroblast)CPE:致細胞病變效應(Cytopathiceffect)DEF:鴨胚成纖維細胞(Duckembryofibroblast)DNA:脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid)EB:溴化乙錠(Ethidiumbromide)FBS:胎牛血清(Fetalbovineserum)LL:禽淋巴性白血病(Lymphoidleukosis)M199:M199培養基(M199Medium)MD:雞馬立克氏病(Marek'sdisease)MDV:雞馬立克氏病病毒(Marek'sdiseasevirus)PCR:聚合酶鏈式反應(Polymerasechainreaction)PBS:磷酸鹽緩沖液(Phosphate-bufferedsalinebuffer)RE:禽網狀內皮組織增生病(Reticularendotheliosis)2GB/T18643—2021神經型MD的病理變化為外周神經腫脹，呈半透明水腫樣，色澤變淡，橫紋消失，其腫脹程度一般為正常神經的2倍～3倍。這些變化多發生在腰薦神經叢、坐骨神經叢、臂神經叢、頸部迷走神經叢等部位。由于多為不對稱性，通過比較對側神經將有助于判定。皮膚型MD病理變化比較少見。其病理變化特征為：以皮膚的羽毛囊為中心，形成半球形隆起的腫瘤，其表面有時可見鱗片狀棕色痂皮。眼型MD是由于淋巴細胞浸潤虹膜而導致的病理變化，虹膜呈環狀或斑點狀褪色，出現淡灰色；瞳孔不規則，有時偏向虹膜一側。3.3病理組織學變化采集病雞腫脹的外周神經和內臟的腫瘤組織樣品，按常規方法制備石蠟切片、蘇木素伊紅染色，通過普通光學顯微鏡進行病理組織學觀察判定。根據病變組織中浸潤細胞的種類及形態學，外周神經病理組織學變化可分為A、B、C三個型。在同只雞的不同神經可能會出現不同的病變型。A型病變以淋巴母細胞，大、中、小淋巴細胞及巨噬細胞的增生浸潤為主。B型病變表現神經水腫，神經纖維被水腫液分離，水腫液中以小淋巴細胞、漿細胞和許旺氏細胞增生為主。C型病變為輕微的水腫和輕度小淋巴細胞增生。內臟和其他組織的腫瘤與A型神經病變相似。通常以出現大小各異的淋巴細胞增生為主。3.4鑒別診斷3.4.1與禽白血病(Avianleukosis,AL)鑒別診斷AL在病理剖檢中容易與缺乏外周神經病變的內臟型MD相混淆。一般需要通過流行病學和病理組織學進行鑒別診斷。常見的AL包括由A、B亞群白血病病毒引起的禽淋巴性白血病(Lymphoidleu-kosis,LL)和由J亞群白血病病毒引起的髓細胞瘤白血病。在流行病學方面，AL一般發生于16周齡以上的雞，多發生于24周齡～40周齡之間。而MD的死亡高峰一般發生在10周齡～20周齡之間。另外，LL的發病率較低，一般不超過5%,而MD的發病率較高。LL腫瘤病理組織學變化主要表現為大小均一的淋巴母細胞增生浸潤。另外，在LL與MD引起的法氏囊腫瘤中，其腫瘤細胞的浸潤部位存在著差異。MD腫瘤細胞主要在濾泡間增殖，而LL腫瘤細胞則主要在濾泡內增殖。J亞群白血病病毒引起的腫瘤病主要包括髓細胞性、成紅細胞性和成髓細胞性白血病，以及腎母細胞瘤、血管肉瘤和組織細胞性肉瘤病。前三者的主要表現是在受影響的組織器官內，可見顯著的未成熟髓細胞的增殖。腫瘤細胞大小不一，核漿比高，呈現細胞多形性，細胞核呈橢圓形，個體較大且偏心分布，核膜增厚且不規則。核仁明顯，染色質呈細密的點狀或較大點狀或濃染塊狀分布，并可見非典型的核分裂像。腫瘤細胞的細胞質中含有少量至多量的球形嗜酸性顆粒。J亞群白血病病毒引起的髓細胞瘤白血病在病理組織學上易與MD區分。3.4.2與禽網狀內皮組織增生病(Reti盡管RE在不同的雞群中感染率差異較大，但一般發病率較低。本病在病理組織學方面，RE法氏3GB/T18643—2021囊腫瘤主要表現為慢性B細胞性淋巴瘤，與淋巴細胞性白血病相似；非法氏囊腫瘤主要表現為T細胞性淋巴瘤，表現為形態相似的淋巴母細胞增殖，可能混雜有一部分小型淋巴細胞。3.5臨床診斷判定發病雞符合MD臨床癥狀和病理變化，判定為MD疑似病例。4病毒分離4.1試劑4.1.1磷酸鹽緩沖液(PBSpH7.4):配方見A.1。4.1.2細胞培養液與細胞維持液：配方見A.2。4.1.3淋巴細胞分離液。4.1.4SPGA/EDTA緩沖液：配方見A.3。4.1.5細胞凍存液：配方見A.4。4.2器材4.2.1倒置顯微鏡。4.2.2超聲波儀。4.2.3細胞培養箱。4.2.4微量可調移液器：(10μL～200μL,50μL～300pL)單道移液器。4.2.5手動或電動移液裝置。4.2.6細胞培養皿。4.3細胞4.3.1雞腎細胞。4.3.2鴨胚成纖維細胞。4.3.3雞胚成纖維細胞。4.4操作方法無菌采集疑似MD發病雞的抗凝血，按照常規方法，利用淋巴細胞分離液分離。按常規法制備原代的CKC或DEF或CEF,37℃靜置培養，形成單層細胞后用于病毒接種。將0.2mL懸浮液用細胞維持液稀釋至1mL接種到單層細胞中(細胞培養皿的直徑為60mm),將接種和未接種的對照細胞放在細胞培養箱中進行培養。羽髓組織懸液在接種細胞前，應倒掉細胞培養4GB/T18643—2021液，加入羽髓組織懸液經40min吸附后加入細胞維持液。每2d換一次細胞維持液，若被檢樣品中含有MDV,通常在3d~5d時出現CPE,形成由圓形和梭形的折光性細胞和多核細胞組成的蝕斑，大約7d～10d時進行蝕斑計數。4.4.4病毒繼代或收獲按照6.4方法進行PCR檢測。5瓊脂免疫擴散試驗檢測MDAGID既可用于抗原的檢測，也可以用于抗體的檢測。在人工感染試驗中，病毒抗原一般在MDV感染雞14d～24d后可檢測到；抗體一般在病毒感染21d后可檢測到。5.2.2標準陰、陽性血清：標準陰、陽性血清分別由SPF雞和接種MDV標準強毒的細胞培養物的SPF雞血清制備。5.2.3溶液配制5.2.3.1磷酸鹽緩沖液(PBSpH7.4):配方見A.1。5.2.3.21%硫柳汞溶液：配方見B.1。5GB/T18643—2021打孔。中心孔與外周孔距離為3mm。將孔中的瓊脂用針頭挑出，應避免瓊脂層脫離平皿底部。用酒精燈火焰輕烤平皿底部至瓊脂輕微融化為止，封閉孔的底部。用微量移液器吸取用滅菌生理鹽水稀釋的標準陽性血清(按產品使用說明書的要求稀釋),滴入中央孔。標準陽性抗原懸液分別加入外周相對的兩孔中，在外周的其余孔中加入被檢的羽髓浸出液。每孔均以加滿不溢出為度，每加一個樣品應換一個吸頭。加樣完畢后，靜置5min～10min,將平皿輕和48h觀察結果。操作方法同5.4.1,按如下操作加樣：標準抗原液用滅菌生理鹽水稀釋(按產品使用說明書的要求稀釋),用微量移液器吸取，滴入中央孔，標準陽性血清分別加入外周相對的兩孔中，待檢血清按順序分別加入外周的其余孔中。每孔均以加滿不溢出為度，每加一個樣品應換一個吸頭。5.5結果判定5.5.1MD瓊脂免疫擴散試驗結果判定示意圖見圖1:(陰性)特檢血清(弱陽性)(陽性)待檢血清(陰性)標準陽性血清標準陽性抗原待檢抗原(陽性)待檢抗原(陰性)待檢抗原(陰性)待檢抗原(弱陽性)標準陽性血清標準陽性抗原圖1MD瓊脂免疫擴散試驗結果判定示意圖5.5.2將瓊脂板置日光燈或側強光下進行觀察，當標準陽性血清與標準抗原孔間有明顯沉淀線，表明陽性對照成立；在陽性對照成立情況下，當待檢血清(或抗原)與標準抗原(或標準陽性血清)孔間有明顯沉淀線，且此沉淀線與標準抗原和標準血清孔間的沉淀線末端相融合，則待檢樣品為陽性。5.5.3當標準陽性血清與標準抗原孔的沉淀線的末端在比鄰的待檢血清孔或待檢抗原孔處的末端向5.5.4當陽性對照成立，而待檢血清(或抗原)與標準抗原(或標準陽性血清)孔之間無沉淀線，或標準陽性血清與抗原孔間的沉淀線末端向毗鄰的待檢血清孔或待檢抗原孔直伸或向外側偏彎曲時，該待檢血清為陰性。5.5.5介于陰、陽性之間為可疑。可疑應重檢，二次檢測仍為可疑判為陽性。6GB/T18643—20216PCR檢測針對MDV血清1型病毒特有的meq基因和132堿基重復序列(132bpr)的PCR檢測，可以對MDV血清1型病毒感染進行檢測和鑒定；同時可以對野毒株和疫苗株感染加以區分。6.2試劑6.2.1陰性和陽性對照：分別為SPF雞的組織和MDV強、弱毒細胞株培養物提取的核酸，-20℃保存。6.2.2組織細胞裂解液：為病毒總DNA提取試劑，配方見附錄C中的C.1。6.3.1PCR擴增儀。6.3.3穩壓穩流電泳儀和水平電泳槽。6.3.4凝膠成像儀(或紫外透射儀)。6.3.5—20℃冰箱。6.3.6微量可調移液器(0.5μL～10μL、5μL～40μL、40μL～200μL和200pL～1000μL各1支)。6.3.7PCR擴增管。等。在無菌環境中，將采集的動物機體組織研磨，加PBS洗2次，12000g/min離心10min,取沉淀用于提取總DNA。細胞樣品不需要研磨處理，直接用于提取總DNA。提取方法見C.2。在試劑配制區進行。設PCR反應數為n,n為待檢樣品數+陽性對照+陰性對照，宜按n+1個反7GB/T18643—2021在樣本處理區進行，在已分裝有PCR反應液的PCR擴增管中分別加入已制備好的DNA溶液將PCR管放入PCR擴增儀中，按照設定擴增條件(見C.5)進行擴增。6.4.4.11%瓊脂糖凝膠板的制備：配方見C.6。依據樣品數選用適宜的梳子，待凝膠冷卻凝固后拔出梳子(膠中形成加樣孔),放入電泳槽中，加1×TAE緩沖液(配方見C.7)淹沒膠面。6.4.4.2加樣：取6μL～8μLPCR擴增產物和2pL加樣緩沖液混勻后加入一個加樣孔。每次電泳同6.4.4.3電泳：電壓80V～100V,或電流40mA～50mA;電泳30min～40min。電泳結束后，取出凝膠板置于紫外透射儀或凝膠成像系統觀察。陽性對照樣品，meq基因應檢測此次試驗視為無效。317bp,449bp,581bp,713bp,845bp,977bp,1109bp),表明檢測樣品中MDV血清1型病毒陽性(示例圖見C.8)。6.5.2.2若待檢樣品擴增結果，meq基因檢測為786bp大小條帶，132bpr檢測為317bp或449bp大小單一條帶，表明該MDV為野毒株(示例圖見C.8)。以上的條帶，一般可出現5條～8條，大小為185bp,317bp,449bp,581bp,713bp,845bp,977bp,6.5.2.4若待檢樣品meq基因檢測和132bpr檢測出現與6.5.2.2或6.5.2.3不一致情況，則需要序列測定等方法進行綜合分析。7熒光定量PCR(q-PCR)檢測7.1試劑見6.2。7.2.1熒光定量PCR擴增儀。GB/T18643—20217.3.3q-PCR擴增按如下步驟進行q-PCR擴增：a)擴增試劑的準備：在試劑配制區進行。設實時熒光定量PCR反應管數為n,n為待檢樣品數十陽性管數+陰性管數，宜按n+1個反應進行配制。配制反應液在冰盒中進行。每個樣本檢測反應體系配制見附錄D中的D.1。將上下游引物及探針(見D.2),熱啟動Taq酶，buffer,b)加樣：在核酸提取區進行。在每個PCR反應管內加入7.3.2制備的核酸2μL,蓋上蓋子，500r/min～1000r/min離心30s。轉移至檢測區。c)q-PCR反應：把PCR管放在熒光定量PCR儀器上，按照設定擴增條件(見D.3)進行q-PCR擴增。a)陽性對照擴增曲線應成標準的S曲線，且Ct值應小于25。b)陰性對照擴增曲線應為基線下的水平線。7.4q-PCR檢測結果判定若被檢樣本檢測結果顯示曲線成標準的S曲線，且Ct值≤35,報告為MDV核酸陽性；若無S曲且擴增曲線均為典型的S曲線，報告為MDV核酸陽性；如重復后仍然35<Ct值≤40,且無典型S曲8綜合判定8.2臨床疑似判定發生MD的雞只，經分離出MDV且鑒定為野毒株感染，或經瓊脂免疫擴散試驗檢8.3臨床無明顯特異癥狀的雞只，經分離出MDV且鑒定為野毒株感染，或經PCR檢測結果符合野毒8.4臨床無明顯特異癥狀的雞只，分離出MDV且鑒定為疫苗株感染，或經PCR檢測結果符合疫苗株89GB/T18643—2021(規范性附錄)病毒分離用溶液配制氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCl)磷酸氫二鈉(Na?HPO?)磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.24g調pH值至7.4,加去離子水定容至1000mL,高壓消毒滅菌112kPa,30min,保存于4℃。A.2細胞培養與細胞維持液A.2.1細胞培養液M199培養基胎牛血清雙抗(其中青霉素濃度為10000U/mL,鏈霉素濃度為10mg/mL)將胎牛血清和雙抗依次加入M199中混勻，保存于4℃。94mLA.2.2細胞維持液M199培養基胎牛血清雙抗(其中青霉素濃度為10000U/mL,鏈霉素濃度為10mg/mL)將胎牛血清和雙抗依次加入M199中混勻，保存于4℃。96mLA.3SPGA/EDTA緩沖液蔗糖(Sucrose)7.462g磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.052g磷酸氫二鉀(K?HPO?)0.125gL-谷氨酸鈉0.083g牛血清粉1.000g乙二胺四乙酸(EDTA)0.200g去離子水80mL調pH值至6.5左右，加去離子水定容至100mL,過濾除菌，保存于4℃。A.4細胞凍存液M199培養基(規范性附錄)瓊脂免疫擴散試驗用溶液配制B.11%硫柳汞溶液硫柳汞(C?H?HgNaO?S)1g去離子水100mL溶解后，置于100mL瓶中蓋塞，室溫保存。B.2生理鹽水氯化鈉(NaCl)0.9g加去離子至100mL將氯化鈉加入90mL去離子水中，充分溶解，加去離子水將溶液定容至100mL,高壓消毒滅菌B.3瓊脂平板的制備在250mL容量的三角瓶中分別加入pH7.4的PBS100mL、瓊脂糖1g,氯化鈉8g,將三角瓶在水浴中煮沸使瓊脂糖充分融化，再加入1%硫柳汞1mL,混勻，冷卻至45℃~50℃,將潔凈干熱滅菌的直徑為90mm的平皿置于平臺上，每個平皿加入18mL～20mL加蓋待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸發。放普通冰箱4℃中冷藏保存備用，有效期為2周。GB/T18643—2021(規范性附錄)C.1組織細胞裂解液TE(Tris10mol/L,EDTA1mmol/L)十二烷基硫酸鈉(10%SDS)氯化鈉(5mol/LNaCl)蛋白酶K(PK20mg/mL)需要使用時配制。C.2核酸提取方法C.2.1取待檢樣本、陰性對照、陽性對照各5μL～10μL(1pg/μL)分別置于1.5mL離心管中，每管加入1000μL組織細胞裂解液，置于37℃水浴4h,期間適當旋轉混勻。C.2.3用寬口移液管吸出水相于新的干凈的離心管中，重復步驟C.2.2。C.2.4用寬口移液管吸出水相于新的干凈的離心管中，加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)倒轉混勻成乳濁狀，靜置5min后，1C.2.5用寬口移液管吸出水相于新的干凈的離心管中，加入等體積的異戊醇，倒轉混勻，靜置5minC.2.6重復步驟C.2.5。C.2.7用寬口移液管吸出水相于干凈的離心管中，加入2.5倍體積的無水乙醇，倒轉混勻，-20℃靜置C.2.8沉淀用75%的冷乙醇洗滌2次，12000g/min離心10min,盡量吸干液體；室溫干燥5min~MDVPCR反應體系試劑配制見表C.1。試劑名稱用量上游引物(10pmol)下游引物(10pmol)dNTP(10mmol/L)試劑名稱用量10×PCR反應緩沖液Taq酶(5U/μL)去離子水MDVPCR檢測用引物PCR檢測用引物見表C.2。PCR檢測用引物序列PCR檢測用引物序列引物名稱引物序列擴增長度擴增目的片段meq上游5'TTCCCTGACGGCCTATCTGA3'786bp或963bpmeq基因meq下游5′TTCGGGATCCTCGGTAAGAC3′132