ICS75.160.20CCSE30Determinationofchloramphenicolandmetronidazoleresiduesinporkandbeefbyliquidchromatography-tandemmassspectIT/SATA068—2024前言 2規范性引用文件 3術語和定義 4原理 5試劑 6儀器 27試樣制備與保存 27.1試樣的的制備 27.2試樣的的保存 28測定步驟 28.1提取 28.2凈化 28.3測定條件 29結果計算 410測定低限 411精密度和回收率 4附錄A（資料性）氯霉素（CAP）、D5-氯霉素（D5-CAP）、甲硝唑（MDZ）和D4-甲硝唑（D4-MDZ）多反應監測（MRM）色譜圖 5附錄B（資料性）氯霉素和甲硝唑在不同基質中的平均回收率和精密度 6T/SATA068—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本標準可能涉及某些有危險性的材料、操作和設備，但是并未對與此有關的所有安全問題都提出建議。因此，使用者在應用本標準前應建立適當的安全和防護措施，并確定相關規章限制的適用性。本文件由深圳市分析測試協會提出并歸口。本文件起草單位：深圳市龍華區疾病預防控制中心，深圳市疾病預防控制中心，深圳市南山區疾病預防控制中心，深圳市羅湖區疾病預防控制中心。本文件主要起草人：羅蘭，秦威振，王甫，黃承鵬，鐘寶輝，熊韋，任燕，曹赫，林啟輝，劉紅河，姜杰，劉桂華，曾憲東，柳潔，朱波，賴少陽，葉敏。1T/SATA068—2024動物源性食品中氯霉素和甲硝唑殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法本方法適用于液相色譜-串聯質譜對氯霉素和甲硝唑抗生素殘留量的同時測定。本標準適用于豬、牛、雞、鴨、魚、蝦、貝類中氯霉素和甲硝唑抗生素殘留量的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5009.1食品衛生檢驗方法理化部分總則GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T8170數值修約規則與極限數值的表示和判定GB/T22338-2008動物源性食品中氯霉素類藥物殘留測定液相色譜-質譜/質譜法GB/T27404實驗室質量控制規范食品理化檢測3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4原理采用乙酸乙酯提取試樣中氯霉素和甲硝唑藥物殘留，經低溫離心，正己烷除油，氮吹、定容后，用液相色譜-串聯質譜測定目標物，內標法定量。5試劑除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規定的一級水。5.1乙酸乙酯（C4H8O2）：色譜純。5.2正己烷（C6H14）：色譜純。5.3乙腈（C2H3N）：色譜純。5.4乙酸銨（C2H7NO2）：色譜純。5.5氫氧化銨（NH3OH，濃度為25%~28%）。5.6無水硫酸鈉（Na2SO4使用前經馬弗爐550℃灼燒2h，冷卻后密封保存。5.75mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.39g乙酸銨，用水稀釋至1000mL，混勻。CAS:443-48-1）、D4-甲硝唑（C6H5D4N4O3，CAS:1261392-47-5）標準物質：純度≥98%5.9標準儲備液：1000mg/mL。分別準確稱取氯霉素、甲硝唑、D5-氯霉素、D4-甲硝唑標準品10.0mg（按照純度示值折算），用甲醇溶解并定容至10mL，配成1000mg/mL的標準儲備液，-20℃以下避光保存，保存期為12個月。5.10混合標準儲備液：分別準確吸取100μL氯霉素、甲硝唑標準儲備液，用甲醇定容至10mL，配成濃度為10mg/L的混合標準儲備液，-20℃以下避光保存，保存期為6個月。2T/SATA068—20245.11混合內標儲備液：分別準確量取100μLD5-氯霉素、D4-甲硝唑標準儲備液，用甲醇定容至10mL，配成10mg/L的混合內標儲備液，-20℃以下避光保存，保存期為6個月。5.12標準使用液：準確吸取混合標準儲備液50μL，用10%乙腈-水溶液定容至10mL，標準使用液質量濃度為0.05mg/L，4℃保存，保存期為7天。5.13內標使用液：準確吸取混合內標儲備液50μL，用10%乙腈-水溶液定容至10mL，內標使用液質量濃度為0.05mg/L，4℃保存，保存期為7天。5.14混合標準工作液：分別準確吸取標準使用液5μL、10μL、20μL、50μL、100μL，內標使用液各40μL，用10%乙腈-水溶液定容至1.0mL，配制成氯霉素、甲硝唑含量為0.25ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL標準系列，其中內標濃度為2ng/mL。臨用現配。6儀器6.1天平：感量為0.01g，0.1mg6.2組織搗碎機6.3渦旋混勻器6.4超聲波清洗器6.5離心機：≥14000r/min6.6氮吹儀6.7氮氣發生器6.8液相色譜-串聯質譜儀：配有電噴霧離子源7試樣制備與保存7.1試樣的的制備取樣品約500g用肉類組織搗碎機絞碎，裝入潔凈容器作為試樣，密封并標明標記。7.2試樣的的保存將試樣于-18℃冰箱中保存。8測定步驟8.1提取稱取5g（精確到0.01g）已經均質好的樣品于50mL離心管中，加入80μL內標標準使用液、15mL乙酸乙酯、0.5mL氫氧化銨、足量的無水硫酸鈉，渦旋混勻，超聲提取30min。在14000r/min，5℃下離心15min，將上清液轉移至另一干凈的離心管中，再在樣品管中加入上述試劑，重復提取一次。合并兩次提取的上清液，于50℃氮氣吹干。8.2凈化將離心管中的殘渣用2mL5%乙腈-水溶液溶解，渦旋30s，超聲1min，加入5mL正己烷，渦旋30s，在14000r/min，5℃離心15min，棄去正己烷，重復操作3次。取水層過0.22μm的尼龍濾膜，收集濾液待上機。8.3測定條件8.3.1液相色譜條件a)色譜柱：C18(十八烷基硅烷，5μm，2.1×150mm)，或相當者；b)流動相：A相5mmol/L的乙酸銨溶液，B相為乙腈。流速為0.3mL/min，梯度洗脫見表1；表1梯度洗脫程序3T/SATA068—2024c)柱溫：40℃;d)進樣量：5μL。8.3.2質譜條件a)進樣離子源：ESI源，離子源溫度550℃。b)掃描模式：氯霉素、D5-氯霉素為負離子掃描模式，甲硝唑、D4-甲硝唑為正離子掃描模式。c)監測模式：多離子反應監測（MRM）。d)噴霧電壓：4.5kV。e)源內氣：55psi。f)輔助氣：55psi。g)氣簾氣：30psi。h)其他質譜參數見表2：表2監測離子對D-氯霉素D-甲硝唑注：對不同質譜儀器，儀器參數可能存在差異，測定前應將質譜參數優化到最佳。8.3.3定性測定將試樣溶液注入液相色譜-串聯質譜儀中，測得其峰面積，以保留時間（偏差在±2.5%之內）和監測離子的相對豐度比（監測離子相對豐度的最大允許偏差見表3）定性。根據標準曲線得到待測試樣溶液中氯霉素和甲硝唑的質量濃度。平行測定次數不少于兩次。表3定性時相對離子豐度的最大允許偏差8.3.4定量測定在儀器最佳工作條件下，對混合標準工作液（4.16）進樣，以標準溶液中被測組分峰面積和氘代內標峰面積的比值為縱坐標，標準溶液中被測組分濃度與氘代內標濃度的比值為橫坐標，繪制標準曲線，用標準曲線對樣品進行定量，樣品溶液中待測物的響應值均應在儀器測定的線性范圍內。內標法定量。氯霉素（CAP）、D5-氯霉素（D5-CAP）、甲硝唑（MDZ）和D4-甲硝唑（D4-MDZ）的多反應監測(MRM)色譜圖參見圖A.1。4T/SATA068—20249結果計算試樣中各目標化合物的含量按公式（1）計算：式中：X——試樣中目標化合物的含量，單位為微克每千克(μg/kgc——根據標準曲線計算得到的試樣中目標化合物的濃度，單位為微克每升(μg/Lv——定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣的取用量，單位為克（gf——稀釋倍數。10測定低限本標準對氯霉素、甲硝唑的測定低限均為0.05μg/kg。11精密度和回收率本標準的精密度數據是參考GB/T27404附錄F有關規定而確定的，參見附錄B。5T/SATA068—2024（資料性）氯霉素（CAP）、D5-氯霉素（D5-CAP）、甲硝唑（MDZ）和D4-甲硝唑（D4-MDZ）多反應監測（MRM）色譜圖圖A.1氯霉素（CAP