1豬病原微生物檢測——高通量靶向測序法本文件規(guī)定了高通量靶向測序技術(shù)在豬病原微生物鑒定的應(yīng)用推薦與相關(guān)要求，包括靶向測序的本文件適用于規(guī)范高通量靶向測序在豬病原微生物檢測中的應(yīng)用，指導(dǎo)有關(guān)高通量靶向測序在獸本文件適用于獸醫(yī)臨床領(lǐng)域中涉及高通量靶向測序項目研發(fā)和應(yīng)用的豬養(yǎng)殖場和豬屠宰場、高等NY/T541-2016獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第503號高致病性動取，而后通過PCR擴增手段富集樣品核酸中的靶向序列，通過對富集對靶2增等，最終構(gòu)建的文庫在高通量測序平臺上進序列的讀長Readlengthofsequencing指在一次高通量靶向測序試驗中對特定靶向基因組區(qū)域的測序覆蓋度。通常以×倍為單位來表示，相對豐度Relativeabundance和絕對豐度Absoluteab相對豐度是指比對到的某病原基因的序列數(shù)占該病原所有基因總序列數(shù)的百分比。絕對豐度是指3外參核酸Spike-innucleicacid和內(nèi)參基因Internalcontrolgene4符號和縮略語PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，PolymeraseChainReactioncDNA：互補脫氧核糖核酸，ComplementaryDeoxyribonucle5.1核酸提取試劑推薦使用商品化的微生物DNA提取試劑盒、病毒DNA/RNA提取試劑盒、5.2文庫構(gòu)建試劑推薦根據(jù)不同測序平臺要求使用相應(yīng)的建庫試劑，并按照測序平臺說明書進行建庫處理。5.3靶向擴增試劑可根據(jù)以上不同微生物病原聯(lián)合鑒定推薦選擇目標(biāo)病原靶向擴增的組合性引物組，也可按照實際分析等五個步驟。針對需要解決的臨床問題和靶向靶向測序檢測的樣品采樣及運輸所涉及的實驗操作應(yīng)按NY/T541-2016規(guī)定執(zhí)行。樣品前處理的主要目的是從各種類型的送檢樣品中提取微生物核酸以確保后續(xù)測序步驟的有效進4試劑性能，根據(jù)不同樣品類型和測序目的選擇不同的方式或試劑進應(yīng)使用合適的DNA樣品和文庫構(gòu)建試劑進行文不完全滿足文庫構(gòu)建要求，可以嘗試進行該步驟，但不完全滿足文庫構(gòu)建要求，可以嘗試進行該步驟，但5應(yīng)使用合適的文庫高通量測序試劑進行高通量測序。高通量生物信息分析是對測序后的原始序列數(shù)據(jù)進行分析和處理，對于靶向測序的檢測結(jié)果具有重要的質(zhì)量控制與過濾、比對與分析等。因此結(jié)合靶向測序的數(shù)據(jù)分析流程，提出以下建議實驗室能根據(jù)檢測方法與檢測需求的特點來搭建實驗室分析平臺，結(jié)合靶向測序特點與預(yù)期用途來建立質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。每個步驟都要仔細評估數(shù)據(jù)處理的準(zhǔn)確性和完整性，確保達到預(yù)可用測序數(shù)據(jù)量應(yīng)達到聲明靶標(biāo)病原可從樣品中檢測到的最小測序數(shù)據(jù)量。每個樣品測序生成的注：序列數(shù)目為單端測序序列條數(shù)，或雙端測序序列對數(shù)。），6于5條，同時在陰性對照文庫中無檢出，可以判定該病原靶標(biāo)基間，同時在陰性對照文庫中無檢出，則判定該病原靶標(biāo)基靶向測序可能的污染來源主要是核酸提取與建庫過程中引入的污染，建議實驗室自建有效的防污期更新病原基因組的數(shù)據(jù)庫，以及提高檢測的敏感國國務(wù)院令第424號和中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第302號的規(guī)定執(zhí)行。7A.1測序樣品的選擇1根據(jù)檢測目的進行樣品核酸提取，實細菌、支原體、寄生蟲、螺旋體等多2345A.2測序流程A.2.1基本流程圖A.2.2測序樣品處理A.2.2.1核酸提取對待測序的生物樣品進行核酸提取，并對提取的核酸進行質(zhì)量檢A.2.2.2靶向片段擴增A.2.2.3接頭連接將富集目標(biāo)片段的靶標(biāo)檢測文庫連接接頭得到待測序文庫。A.2.3待測序文庫質(zhì)量控制按照測序儀廠商提供的質(zhì)量要求進行質(zhì)量控制，建庫過程中宜設(shè)置陰性對照和陽性A.2.4測序89豬病原微生物高通量靶向測序主要通過對目標(biāo)病原微生物靶標(biāo)基因的測序?qū)崿F(xiàn)病原微生物的鑒定114L；K205R2orf6；orf73456polyprotein；5'UTR78N；S9N；S1N；SN；SVP6；VP7vtaA；infBplpE；kmt1aafAcpa；cpb；etx；iap；