附件15體內彗星試驗InVivoMammalianAlkalineCometAssay1范圍本規范確定了體內彗星試驗的基本原則、要求和方法。本規范適用于化妝品原料的遺傳毒性檢測。2試驗目的評價化妝品用原料的遺傳毒性。3定義3.1堿性單細胞凝膠電泳：在單個細胞或細胞核水平檢測DNA損傷的一種敏感技術。3.2彗星：經過電泳后細胞核的形狀，形似彗星。細胞核部分形成彗星頭部，在電場力的作用下脫離細胞核的DNA片斷形成彗尾。3.3“刺猬狀”細胞：顯微圖像下由小或模糊不清的頭以及大的彌漫性尾組成的細胞。3.4尾部DNA含量：反應總強度（彗頭與彗尾之和）中彗星的強度。可反應DNA片斷的數量，用百分比表示。3.5最大耐受劑量：試驗期內引起動物產生輕微毒性效應的最高劑量，在這個劑量下，動物產生明顯的臨床體征，如異常行為或反應，輕微的體重下降或靶組織細胞毒性，但是并不會引起死亡或痛苦。4試驗原理DNA雙螺旋結構在強堿性溶液中（pH>13）會松弛，在電場力的作用下，正常的DNA保留在原位不動，而單鏈或雙鏈DNA斷裂所形成的DNA片斷在會向陽極移動，形成彗星狀。DNA片斷所形成的彗星狀拖尾的長度及強度可以反應DNA片斷的大小和數量。通過檢測尾部DNA含量（%）等終點指標可以評價DNA損傷程度。5試驗基本原則動物染毒一定時間后處死并解剖動物，獲取靶器官，制備單細胞懸液。單細胞懸液與瓊脂糖混合后經過裂解過程去除細胞膜，并暴露于強堿性溶液（pH>13）中進行DNA解旋，經過電泳、固定、染色，在熒光顯微鏡下觀察，通過分析軟件對彗星狀細胞進行分析，判定DNA損傷程度。每個樣品需分析足夠數量的細胞進行最終結果評價。6溶液的配制（所有溶液均現用現配）6.10.5%(w/v)低熔點凝膠低熔點膠以0.5%(w/v)的濃度溶于D-PBS（無Ca2+、Mg2+和酚紅）溶液中，并利用微波爐加熱。配好的膠保存在37℃~45℃，用后棄去。6.21.0%~1.5%（w/v）基底層標準瓊脂糖凝膠常規熔點瓊脂糖經微波爐加熱溶于磷酸鹽緩沖液中（pH7.0~7.4，不含Ca2+、Mg2+和酚紅），制成1.0%~1.5%（w/v）標準瓊脂糖凝膠。6.3裂解液用純水配制溶液，裂解液終濃度為100mmol/LEDTA-2Na、10mmol/Ltris-base、2.5mol/LNaCl，用5mol/LNaOH或6mol/LHCl將溶液pH調至10，保存于4℃~8℃冰箱中。試驗前，向裂解液中加入1%(v/v)triton-X100和10%(v/v)DMSO，保存于4℃~8℃冰箱至少30min。6.4堿性解旋液和電泳液用純水配制溶液，堿性解旋液和電泳液終濃度為1mmol/LEDTA-2Na和300mmol/LNaOH，pH≥13，用前保存于4~8℃冰箱中，并測定其pH值。6.5中和液用純水配制溶液，中和液終濃度為0.4mol/Ltris-base（用5mol/LNaOH或6mol/LHCl調節pH7.5），保存于4℃~8℃冰箱中。6.6組織勻漿緩沖液將EDTA-2Na溶于HBSS（無Ca2+、Mg2+和酚紅）中，終濃度為20mmol/LEDTA-2Na，用5mol/LNaOH或6mol/LHCl將其pH調至7.5，保存于4℃~8℃冰箱中，使用前加入10%DMSO。6.7染液DNA熒光染料（如SYBRGold、SYBRGreenI、Gelred、碘化丙啶或溴化乙錠等），制備和使用按照產品要求。7實驗動物和飼養環境7.1動物的選擇動物的選擇應符合GB14922.1和GB14922.2的有關規定，選用SPF級健康成年嚙齒類動物。常用6周齡以上雄性大鼠。實驗開始時，動物體重的差異應不超過±20%。7.2動物飼養動物飼養條件應符合GB14925、飲用水應符合GB5749、飼料應符合GB14924的有關規定。可分籠群飼（每籠通常不超過5只），也可單籠飼養。室內的溫度應控制在22℃（±3℃）。相對濕度應控制在50%~60%，不低于30%，最高不超過70%（清潔時例外）。照明應控制為12h光照、12h黑暗。常規飲食，自由飲水。7.3動物分組首先應確定實驗分組，動物隨機分配為對照組和試驗組。試驗開始前，實驗動物至少適應5天。一般實驗設計需要三個劑量組以及陰性和陽性對照組，每組動物至少5只。編號應使用創傷較小的方法，包括：耳孔法、標簽法、烙印法、染色法。8試驗條件8.1溶劑溶劑不應該產生毒性作用，并且不應當與受試物產生化學反應。如果使用不常用的溶劑，應有數據支持該溶劑在受試動物的應用、暴露途徑及檢測終點等方面是可行的。應根據受試物的理化性質（水溶性或脂溶性）確定受試物所用的溶劑，通常用水、植物油等。應當注意的是，某些溶劑（特別是粘稠的溶劑）多次使用后，能誘導炎癥反應及在接觸部位可能增加DNA鏈斷裂的背景水平。8.2樣品的制備固體受試物應溶于適當的溶劑中或混合在飲食或飲水中。液體受試物可直接或稀釋后染毒。用吸入暴露時，根據受試物的物理化學性質，將其處理為氣體、蒸汽或氣溶膠。受試物應現用現配。8.3對照陽性對照。每次試驗都應設置陽性對照，每種性別至少有3只可供分析的動物。如需進行多次采樣（例如，用單一的染毒方案），不僅需要在每一個采樣點設置陽性對照，而且要確保平行性。陽性對照的暴露途徑可以與受試物不同。陽性對照物質應該能夠引起靶器官產生DNA鏈斷裂，可以選擇甲磺酸乙酯（EMS）作為陽性對照，其已經被證實能夠誘發多種組織器官產生DNA鏈斷裂效應。陽性對照應選擇能夠產生中等毒性效應的劑量，同時能夠評估試驗的可行性和靈敏度，可以根據實驗室建立的陽性物劑量-反應曲線進行選擇。陽性對照組的尾DNA含量（%）應該與實驗室前期建立的數據范圍保持一致。陽性對照物質及其靶器官（作用于嚙齒動物）見表1。也可以選擇其他一些被證實陽性的物質。表1陽性對照物及其靶器官化學物及CAS.號靶器官甲磺酸乙酯EMS(CAS62-50-0)所有組織乙基亞硝基脲(CAS759-73-9)肝、胃、十二指腸、空腸甲磺酸甲酯MMS(CAS66-27-3)肝、胃、十二指腸、空腸、肺及支氣管肺泡細胞、腎、膀胱、睪丸、骨髓造血系統N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(CAS70-25-7)胃、十二指腸、空腸二甲基肼吡啶(CAS306-37-6)肝、腸甲基亞硝基脲(CAS684-93-5)肝、骨髓、血細胞、腎、胃、空腸、腦陰性對照。陰性對照組的動物用溶劑單獨染毒，其余操作過程與試驗組相同，每次試驗每個采樣點每種組織都應該設置陰性對照。陰性對照組的尾DNA含量（%）應該在實驗室前期建立的背景數據范圍之內。必要時增加空白對照。9劑量設計受試物應設3個劑量組。首先通過預試驗確定最大耐受劑量,一般取最大耐受劑量及至少兩個適當間隔的劑量水平（優選劑量間隔為QUOTE）。對于無毒物質，14天或以上的染毒期，最大染毒劑量采用1000mg/kg/BW/d。如果染毒期少于14天，最大染毒劑量采用2000mg/kg/BW/d。10染毒方式染毒方式一般選用灌胃方式，除一些陽性物質外，一般不建議腹腔注射。灌胃或注射一次染毒的最大體積取決于受試動物的體重，灌胃量不應超過1mL/100g體重，水溶液受試物最大染毒量可達到2mL/100g體重。11采樣時間最佳采樣時間是由受試物或染毒途徑決定的，依據受試物藥代動力學數據[在血漿中達到峰值的時間或組織濃度時，或在多次染毒后的穩定狀態。在沒有動力學數據的情況下，一般在持續兩次及以上染毒的最后一次染毒后2h~6h采樣，或在單次染毒后的2h~6h和16h~26h均采樣。在最后一個（或一次性）采樣后，在同一時間內尸檢所有動物。采樣時間還可以依據出現在靶器官（如果可用）上的毒作用表現來判斷。12試驗方法12.1組織收集及樣本制備肝臟是最常用來研究并收集數據的組織。如果沒有任何背景資料或特定組織，即可選取肝臟。在某些情況下，也可檢查直接接觸部位的臟器（如，經口染毒可選取胃）。肝臟及胃的組織收集方法如下。肝臟：（1）取約5mm3肝左葉中間部分，用冷的組織勻漿緩沖液洗去多余的血細胞；（2）剩下的肝左葉部分用福爾馬林固定用于病理檢查；（3）取下的肝組織用剪刀剪約100次以釋放細胞；（4）用3mL組織勻漿緩沖液將剪碎的細胞制成單細胞懸液，輕輕吹打約15次，過篩（孔徑：40μm）得上清液用于制片；胃：（1）將胃沿胃大彎剪開，用冷的PBS清洗胃部；（2）胃分為左右兩部分，分別用于制片和福爾馬林固定病理檢查；（3）用冷的組織勻漿緩沖液清洗用于試驗的胃，棄去前胃部分，腺胃浸于現配冷的組織勻漿緩沖液15min~30min；（4）胃表面上皮用塑料刮板/解剖刀片或Teflon刀片刮幾次后用冷的組織勻漿緩沖液充分沖洗；（5）用不銹鋼壓舌板平的那一面/解剖刀片或Teflon刀片輕輕刮胃粘膜5次或更多以釋放細胞；（6）用3mL組織勻漿緩沖液將刮下的細胞制成單細胞懸液，輕輕吹打約15次，過篩（孔徑：40μm）得上清液用于制片；備注：最好將取下的胃展平后固定在硅膠墊板上再進行細胞的刮取（該墊板也需冰浴）。12.2制備玻片預涂載玻片。制片前，載玻片應用甲醇浸泡過液以除去表面的油脂，風干。預涂截玻片保證干凈無塵，滴1%凝膠溶液50μL于載玻片上，加上蓋玻片，使瓊脂糖溶液散開，凝固后取下蓋玻片，風干30min。制片過程需在單細胞懸液制備完成1h內完成。用冷的組織勻漿緩沖液將細胞濃度調至2.0×105個/mL。取上述制備好的各組織單細胞懸液與0.5%低熔點凝膠1:10混合(應確保玻片上的低熔點瓊脂糖的百分比不少于0.45%)。混勻后的單細胞懸液與低熔點瓊脂糖混合物均勻鋪于第一層凝膠上面，加上蓋玻片，置于4℃冰箱固化5-10min，至凝膠凝固，蓋玻片可慢慢從瓊脂糖上移除。12.3裂解細胞載玻片在預冷的裂解液中，于4℃~8℃冷藏浸泡中至少1h（或過夜），應避免暴露于可能含有紫外線的白光，可以使用黃光或避光。裂解后使用純凈水、中性緩沖液或磷酸鹽緩沖液來沖洗載玻片以去除殘留洗滌劑和鹽份。12.4解旋和電泳載玻片均衡放置在水平電泳槽中，加入足夠的電泳溶液，使得玻片的表面被完全覆蓋（覆蓋深度應該始終一致），并盡量減少批次之間的變化。玻片應該放置至少20min，等待DNA解旋。在0.7V/cm條件下，電泳時間不少于20min。電泳時間越長（例如30min~40min，可最大限度地提高靈敏度）已知誘變劑的陽性反應越強。但是延長電泳時間也可能會導致陰性對照組樣品過度遷移。根據實驗需求調整緩沖液的深度以保持電壓穩定，以0.7V/cm的速度電泳，電流應在保持在300mA。在電泳開始和結束都需要記錄電流。用于解旋和電泳通常在4℃~10℃避光進行，記錄解旋開始時、電泳開始時和電泳結束后的溫度。12.5中和與固定電泳后，用預冷的中和緩沖液漂洗玻片至少5min，在37℃下干燥15min后，室溫或冷藏保存（濕度不高于60%）。12.6染色使用適當的DNA熒光染料（如SYBRGold、SYBRGreenI、Gelred、碘化丙啶或溴化乙錠等）避光染色5min。可在紅光或黃光下進行，避免受試細胞受外界其他因素影響，增加結果的可靠性和真實性。13結果測定方法13.1使用自動或半自動的圖像分析系統來定量評分彗星。顯微鏡使用恰當的放大倍數（如200倍）進行觀察，顯微鏡上可配備有熒光發射器和適當的檢測器或數碼照相機（如CCD）。13.2分析所有玻片，包括陰性對照和陽性對照，每個樣本（每個動物的每個組織）至少觀察150個細胞。每劑量至少5只動物，每只動物計數150個細胞。在同樣的密度下多觀察幾個視野以確保彗星的尾部沒有重疊。玻片邊緣部分不需要計分。單獨記錄“刺猬狀”細胞的發生頻率。13.3細胞在彗星圖像中可分為3類圖譜，即計分細胞（有清晰的頭部和尾部并與相鄰細胞沒有干擾）、“刺猬狀”細胞和不計分細胞（如彗星頭、彗星尾不清晰或重疊細胞等），其中只有計分細胞能夠進行尾部DNA百分比的分析，避免偽影。13.4彗星試驗DNA鏈斷裂的觀察終點以尾部DNA含量（也稱尾部強度）作為結果評價與分析的指標。14試驗結果的評價14.1試驗結果計算方法：每個樣本（每個動物的每個組織）至少觀察150個細胞，計算每個細胞的終點指標（尾長、尾矩、尾DNA含量），每個終點指標首先計算150個細胞的平均值，再計算每劑量組5只動物的平均值作為該劑量組該項指標的結果。每個細胞的終點指標=QUOTETi=受試組或陽性物終點測定指標（尾長、尾矩、尾部DNA含量）M溶劑對照組=溶劑對照組終點測定MQUOTEM空白對照組=空白對照組終點測定指標（尾長、尾矩、尾部DNA含量）平均值14.2試驗滿足以下標準，則認為試驗成立陰性對照組數值落在實驗室預先建立的歷史陰性對照數據范圍內，且陰性對照組尾部DNA含量百分比值應<8%；陽性對照組數值落在實驗室預先建立的歷史陽性對照數據范圍內，且與陰性對照組數值相比差異有統計學意義；14.3受試物組與平行陰性對照組相比，尾部DNA含量百分比值增加且差異有統計學意義，并有明顯劑量-反