摘

要：結(jié)合病毒類生物疫苗的生產(chǎn)工藝流程及設(shè)備分析，總結(jié)了不同生產(chǎn)工藝步驟的潔凈室級別，針對不同生產(chǎn)工藝要求的病毒類疫苗的無菌生產(chǎn)，對其工藝布局進(jìn)行了分析和優(yōu)化，提出了經(jīng)濟、有效、可行性較高的工藝布局模式。關(guān)鍵詞：無菌生產(chǎn)；病毒類疫苗；工藝布局；生物反應(yīng)器

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引言無菌是生物技術(shù)中的一個重要概念。培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備等只有處于無菌前提下，微生物接種后，才能實現(xiàn)純種培養(yǎng)，最終得到所需的產(chǎn)品。生物疫苗可分為細(xì)菌類疫苗和病毒類疫苗。細(xì)菌類疫苗以培養(yǎng)、發(fā)酵工藝為主，病毒類疫苗以細(xì)胞培養(yǎng)、病毒擴增工藝為主，這兩類疫苗的工藝生產(chǎn)具有相似性。本文針對不同生產(chǎn)工藝的、非最終滅菌的病毒類生物疫苗產(chǎn)品，對其生產(chǎn)車間的工藝布局進(jìn)行了分析，提出了更經(jīng)濟、更高效、更合理的工藝布局模式。

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生產(chǎn)工藝流程及設(shè)備分析1.1

工藝流程分析病毒類疫苗的生產(chǎn)流程（圖1）可以分為以下幾個階段：（1）細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)及擴增，該生產(chǎn)過程為無毒生產(chǎn)過程；（2）細(xì)胞擴增到一定程度后進(jìn)行細(xì)胞洗滌，并加入病毒液接種，然后帶毒培養(yǎng)，并不斷洗滌；（3）細(xì)胞培養(yǎng)好后，收集疫苗液；（4）如果制作滅活疫苗則需要進(jìn)行病毒滅活、制作過程，如果生產(chǎn)活疫苗則不需要該過程；（5）配制疫苗原液；（6）分裝入庫。同時，病毒接種前需要經(jīng)過復(fù)蘇培養(yǎng)及擴增階段。圖1

病毒類疫苗生產(chǎn)流程1.2

工藝設(shè)備分析目前，病毒類生物疫苗的原液生產(chǎn)工藝主要包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)、細(xì)胞工廠培養(yǎng)以及生物反應(yīng)器培養(yǎng)（罐培養(yǎng)）等。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)是傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，工藝相對落后。現(xiàn)國內(nèi)各企業(yè)通過工藝的優(yōu)化升級，逐步將傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝升級為細(xì)胞工廠培養(yǎng)或者生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝。細(xì)胞工廠培養(yǎng)技術(shù)，對貼壁細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)有著明顯優(yōu)勢。首先，采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝，適用于擴大生產(chǎn)，無需添加生產(chǎn)設(shè)備，大大縮短了從研發(fā)到生產(chǎn)的時間。其次，細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝的一次性投入很少，無需大型昂貴設(shè)備，也無需復(fù)雜的管道設(shè)計。此外，細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝能夠靈活地根據(jù)市場需求，安排生產(chǎn)規(guī)模。因此，越來越多的疫苗生產(chǎn)廠家采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)，作為現(xiàn)階段比較先進(jìn)的一種技術(shù)，與傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)以及細(xì)胞工廠培養(yǎng)技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點：（1）單位體積內(nèi)的有效工作細(xì)胞數(shù)量增加；（2）全密閉、管道化的系統(tǒng)生產(chǎn)流程及過程自動化監(jiān)控、控制技術(shù)，不僅減少了污染細(xì)胞的可能性，而且減輕了勞動力強度，減少了人為誤操作因素的影響；（3）生物反應(yīng)器容積的擴大，提升了終端產(chǎn)品的均一性，結(jié)合后期純化工藝，不但產(chǎn)品產(chǎn)量明顯提高，產(chǎn)品質(zhì)量也獲得提升；（4）生產(chǎn)疫苗所用勞動力和車間、水、電、原材料、能源等成本遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝，綜合成本大大降低。

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不同生產(chǎn)工藝步驟的潔凈室級別某一工藝步驟需滿足的潔凈室級別取決于各工藝步驟的執(zhí)行情況，主要有兩種基本情況：開放系統(tǒng)的操作（開放工藝步驟）和密閉系統(tǒng)的操作（密閉工藝步驟）。這兩種情況的具體設(shè)計理念如下：密閉工藝步驟要求產(chǎn)品在整個工藝步驟持續(xù)時間內(nèi)裝在完全關(guān)閉、密封的容器（或罐等）中，需通過泄漏試驗對容器（或罐等）進(jìn)行氣密性驗證。如有必要的話，可以采用經(jīng)完整性檢測并且被用作阻擋容器（或罐等）外潔凈室空氣接觸的屏障——除菌級通風(fēng)過濾器對容器（或罐等）進(jìn)行通風(fēng)。如果在密閉工藝步驟中必須向產(chǎn)品中添加物質(zhì)或取樣，就需使用適當(dāng)?shù)臒o菌裝置，例如蒸汽穿閥裝置，一次性無菌連接、無菌取樣系統(tǒng)或熔管器/密封器。如果滿足這些前提條件，所有密閉工藝步驟可在D級環(huán)境下進(jìn)行。D級是GMP指南中所定義的用于如CIP/SIP之前進(jìn)行拆卸和組裝設(shè)備的最低潔凈室級別。對于開放工藝步驟和系統(tǒng)，基于產(chǎn)品染菌風(fēng)險，一般區(qū)分為兩種情況：情況1：如果產(chǎn)品明顯暴露于潔凈室空氣中，就是完全開放的工藝步驟或系統(tǒng)。例如，產(chǎn)品置于瓶中，但瓶蓋被移開進(jìn)行取樣；或產(chǎn)品置于罐中，但人孔（檢修孔）蓋被打開用于添加溶液。情況2：關(guān)閉的但非密封的容器、罐等也被視為開放系統(tǒng)，相關(guān)工藝步驟也被定義為開放式步驟。例如，產(chǎn)品置于帶蓋的玻璃瓶中，但瓶和蓋之間沒有保證氣密性的膠墊。但此種情況下的產(chǎn)品染菌風(fēng)險遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于情況1。通常情況下，產(chǎn)品滅菌前的開放式工藝步驟應(yīng)該在C級環(huán)境下完成。C級比D級高一個級別（D級適用于密閉工藝步驟），更重要的是，C級是第一個對動態(tài)粒子有要求的房間級別。產(chǎn)品滅菌前，上述情況2的系統(tǒng)/工藝步驟可以在C級潔凈室下進(jìn)行，不需額外的保護(hù)處理。然而情況1的系統(tǒng)/工藝步驟，由于產(chǎn)品染菌的風(fēng)險高，需要借助UAF（單向流）裝置進(jìn)行額外的局部保護(hù)。產(chǎn)品滅菌后，情況1的開放式工藝，需在B+A環(huán)境下進(jìn)行（或A級隔離器，二選一）無菌操作。情況2的開放式工藝，不適用于無菌產(chǎn)品生產(chǎn)，需確保A級環(huán)境外的產(chǎn)品容器完全密封。需要注意的是，所有不直接與產(chǎn)品生產(chǎn)相關(guān)的工藝步驟，即非關(guān)鍵步驟，如設(shè)備清潔、工裝清洗、滅菌密封等將在D級區(qū)完成。必要時，清潔品的開放處理可在D級區(qū)域內(nèi)的UAF裝置保護(hù)下完成。

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不同生產(chǎn)工藝的工藝布局分析非最終滅菌的不可除菌過濾的病毒類生物疫苗產(chǎn)品，鑒于其產(chǎn)品特性，不可最終除菌過濾及滅菌，要求在原液生產(chǎn)過程中，在最后一步可除菌或滅菌工藝之后，全程無菌操作以滿足無菌要求。非最終滅菌的不可除菌過濾的病毒類生物疫苗的生產(chǎn)工藝一般包括：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝、細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝以及生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝。3.1

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的工藝布局受傳統(tǒng)慣例、對GMP等法規(guī)認(rèn)識不深、無菌概念不清晰等因素的影響，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝一般在C級環(huán)境下的局部層流保護(hù)下生產(chǎn)。根據(jù)法規(guī)要求，C級環(huán)境下的局部層流保護(hù)環(huán)境，不可作為無菌操作環(huán)境，其層流保護(hù)下的環(huán)境不是無菌環(huán)境，在該環(huán)境下生產(chǎn)，產(chǎn)品染菌風(fēng)險較高，影響產(chǎn)品質(zhì)量及收率。如按照無菌操作要求，將生產(chǎn)車間環(huán)境提升至B級背景下的A級環(huán)境，則會大大增加造價以及運行成本。由于轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的收率相對較低，在增加成本的同時，不能有效提高收率，因此車間整體的布局經(jīng)濟性、可行性較低。現(xiàn)階段各企業(yè)經(jīng)過工藝優(yōu)化升級，逐步淘汰了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的大規(guī)模生產(chǎn)，僅在病毒培養(yǎng)等局部工藝或小規(guī)模生產(chǎn)中采用。傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的車間局部工藝布局如圖2所示。圖2

傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的車間局部工藝布局由圖2可以看出，傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝均是在C級環(huán)境下的層流保護(hù)下進(jìn)行，無菌環(huán)境的保證性較差。因此需對傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的工藝布局進(jìn)行優(yōu)化升級，如圖3所示。優(yōu)化升級后的工藝布局，將裝瓶培養(yǎng)無菌操作設(shè)置在B級背景下的局部A級層流保護(hù)中，實現(xiàn)無菌操作，保證了產(chǎn)品質(zhì)量。培養(yǎng)箱設(shè)備放置在低級別的D級區(qū)，開口設(shè)在B級區(qū)，在方便使用的同時，減少了對B級區(qū)的影響，便于設(shè)備維修、維護(hù)。退出部分設(shè)置前室，對操作間僅開設(shè)一個門，降低對操作間無菌環(huán)境的影響。圖3

優(yōu)化升級后的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝車間局部工藝布局3.2

細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝的工藝布局細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝在連接、換液等操作環(huán)節(jié)不能夠?qū)崿F(xiàn)密閉操作。傳統(tǒng)的國內(nèi)原液生產(chǎn)車間，以二倍體細(xì)胞狂犬疫苗為例，其車間工藝布局如圖4所示。將細(xì)胞培養(yǎng)、毒種接種以及培養(yǎng)等工藝設(shè)置在C級環(huán)境中，在C級背景下的局部層流保護(hù)下進(jìn)行生產(chǎn)暴露操作，僅將最后的純化操作設(shè)置在B級環(huán)境下。這種操作不能實現(xiàn)無菌，染菌風(fēng)險較大。由于二倍體狂犬病毒疫苗不可最終除菌過濾，生產(chǎn)過程如果不能實現(xiàn)全程無菌化操作，則產(chǎn)品質(zhì)量不能得到有效控制。圖4

原細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝的生產(chǎn)車間局部工藝布局根據(jù)無菌操作要求，原液生產(chǎn)一般在B級背景下的A級環(huán)境下完成。操作完成后，放置于恒溫室內(nèi)恒溫培養(yǎng)一段時間后，反復(fù)進(jìn)行換液等操作，若干次后收獲原液。恒溫培養(yǎng)時，細(xì)胞工廠處于密閉狀態(tài)，因此在D級環(huán)境下的恒溫室培養(yǎng)即可。由于細(xì)胞操作在B級環(huán)境下進(jìn)行，恒溫培養(yǎng)在D級環(huán)境下進(jìn)行，因此有兩種選擇：（1）將培養(yǎng)設(shè)置在B級環(huán)境下，這樣方便操作和使用，物料無需反復(fù)進(jìn)出B級區(qū)，但能耗較大，在大規(guī)模生產(chǎn)中可行性不高。（2）為了保證無菌環(huán)境，充分考慮能耗等因素以及物料如何有效進(jìn)出B級區(qū)，B級區(qū)需要采用VHP滅菌、濕熱滅菌等有效的滅菌手段以控制無菌環(huán)境。根據(jù)VHP的特性，進(jìn)出時長在1h以上，不利于細(xì)胞、病毒的培養(yǎng)。同時，細(xì)胞工廠反復(fù)進(jìn)出B級區(qū)，在增加工作量的同時，也不利于B級環(huán)境的保持。因此，考慮將操作間與恒溫室采用背靠背的模式，利用穿墻連接，實現(xiàn)物料在B級操作間內(nèi)無菌操作的同時，在D級環(huán)境下培養(yǎng)。優(yōu)化后的細(xì)胞工廠車間局部工藝布局如圖5所示。圖5

優(yōu)化后的細(xì)胞工廠車間局部工藝布局3.3

生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝的工藝布局根據(jù)反應(yīng)器的性能及特點，生物反應(yīng)器可分為兩類：一類是非全密閉反應(yīng)器，即反應(yīng)器本身培養(yǎng)過程是全密閉化的，但不可實現(xiàn)在線清洗等操作；另一類是全密閉反應(yīng)器，即反應(yīng)器可實現(xiàn)全密閉化生產(chǎn)、清洗、操作等。因此，需根據(jù)不同的反應(yīng)器類型，有針對性地進(jìn)行工藝布局。非全密閉生物反應(yīng)器，是一種多用于小規(guī)模生產(chǎn)下的小容量生物反應(yīng)器，一般為玻璃等材質(zhì)。根據(jù)無菌要求，其生產(chǎn)操作需要在B級背景下的A級環(huán)境中進(jìn)行。非全密閉生物反應(yīng)器局部工藝布局如圖6所示。圖6

非全密閉生物反應(yīng)器局部工藝布局從圖6可以看出，非全密閉生物反應(yīng)器的生產(chǎn)操作間為B級環(huán)境，能耗較大，適用于不可完全密封、在線清洗的操作場合。而生物反應(yīng)器經(jīng)過長期發(fā)展，優(yōu)化升級，可實現(xiàn)全密閉培養(yǎng)和操作，實現(xiàn)在線清洗、滅菌等。通過生物反應(yīng)器的優(yōu)化升級，可降低對環(huán)境的要求，如果全過程實現(xiàn)密閉操作，則生產(chǎn)環(huán)境可降為D級，全密閉生物反應(yīng)器局部工藝布局如圖7所示。圖7

全密閉生物