飼料中細菌總數的測定2023-08-06發布國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件代替GB/T13093—2006《飼料中細菌總數的測定》,與GB/T13093—2006相比，除結構調整和編輯性改動外，主要技術變化如下：a)更改了適用范圍(見第1章，2006年版的第1章);b)更改了原理(見第4章，2006年版的第4章);c)更改了培養基(見5.7,2006年版的第6章);d)刪除了試樣的制備(見2006年版的第7章)e)增加了樣品(見第7章);f)刪除了測定程序(見2006年版的第8章);g)增加了空白試驗(見8.1.2.3);h)更改了培養條件(見8.2,2006年版的9.1.5);i)更改了菌落計數(見8.3,2006年版的9.2);j)更改了試驗數據處理(見第9章，2006年版的9.3)。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國飼料工業標準化技術委員會(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位：中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所、中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所。本文件及其所代替文件的歷次版本發布情況為：——1986年首次發布為GB/T13093—1986,1991年第一次修訂，2006年第二次修訂；——本次為第三次修訂。1飼料中細菌總數的測定1范圍本文件描述了檢測飼料中細菌總數的平板計數法。本文件適用于配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和動植物源性飼料原料中細菌總數的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。細菌總數bacterialcount飼料試樣經過處理，在一定條件下(如用特定的培養基、培養溫度和時間等)培養后，所得每克或每毫升試樣中菌落的數量。注：菌落的數量以菌落形成單位(colonyformingunit,CFU)表示。4原理將飼料待測樣品經適當處理和稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞；統計菌落數量，根據其稀釋倍數和取樣接種量即可換算出飼料中的菌數。5試劑或材料除非另有規定，僅使用分析純的試劑。5.2氫氧化鈉溶液(1mol/L):稱取20g氫氧化鈉，溶于水，冷卻至室溫后，用水定容至500mL。5.3鹽酸溶液(1mol/L):量取42mL的濃鹽酸，用水稀釋至500mL,搖勻。5.4磷酸鹽緩沖儲備液：稱取34.0g磷酸二氫鉀溶解于500mL水中，用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.2后，用水稀釋至1000mL,混勻，2℃~8℃存放。5.5無菌磷酸鹽緩沖液：取磷酸鹽緩沖儲備液(5.4)1.25mL,用水稀釋至1000mL,分裝適宜容器或每管9mL,121℃高壓滅菌15min。25.6無菌生理鹽水：稱取氯化鈉8.5g,用水溶解并定容至1000mL,分裝適宜容器或每管9mL,121℃高壓滅菌15min。5.7平板計數瓊脂培養基：按照附錄A制備。5.8無菌液體石蠟：取液體石蠟，121℃高壓滅菌20min。5.9無菌吐溫80:取吐溫80,121℃高壓滅菌20min。6儀器設備6.1恒溫培養箱：控溫精度±1℃。6.2拍打式均質器。6.3恒溫裝置：控溫精度±2℃。6.4高壓滅菌器。6.5天平：感量0.1g和0.01g。6.6pH計或精密pH試紙。6.7無菌均質杯或無菌均質袋。6.8無菌移液管或微量移液器及吸頭：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)。6.9無菌試管。6.10無菌培養皿：直徑90mm。7樣品按照GB/T20195進行樣品制備，磨碎，過0.45mm孔徑篩。樣品應盡快檢驗。8試驗步驟8.1試樣溶液的制備和稀釋8.1.1試樣溶液的制備8.1.1.1普通試樣：以無菌操作稱取25g(mL)試樣，放于含有225mL無菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水的無菌均質杯內，8000r/min～10000r/min均質1min～2min,或放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍打式均質器拍打1min～2min,制成1:10的試樣勻液。8.1.1.2油脂類試樣：以無菌操作稱取25g(mL)試樣，先加12.5mL無菌液體石蠟混勻，再加25mL無菌的吐溫80,在40℃~44℃水浴中振蕩混合10min,加入無菌的生理鹽水187.5mL(在40℃~44℃水浴中預溫),在40℃~44℃水浴中乳化，制成1:10的試樣勻液。8.1.2試樣溶液的稀釋無菌移液管或微量移液器吸取1:10試樣勻液1mL,沿管壁慢慢注入含有9mL無菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水的無菌試管中(注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液),振搖試管，或放微型混合器上，混合30s,制成1:100的試樣勻液。8.1.2.2按8.1.2.1操作方法，作10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次應更換一次無菌移液管或微量移液器吸頭。8.1.2.3根據對試樣污染狀況的估計，選擇2個～3個適宜連續稀釋度的試樣勻液，每個稀釋度吸取1mL試樣勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，吸取1mL無菌磷酸鹽緩沖液或無菌生3GB/T13093—2023理鹽水置于無菌平皿內做空白對照。8.2培養稀釋液移入平皿后，及時將15mL～20mL涼至46℃~50℃的培養基(可放置于48℃±2℃恒溫裝置)傾注平皿，小心轉動平皿使試樣與培養基充分混勻。從稀釋試樣到傾注培養基之間，時間不超過30min。如果估計試樣可能在培養基表面彌漫生長時，待培養基完全凝固后，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層涼至48℃±2℃平板計數瓊脂培養基(約4mL)。待瓊脂凝固后，水平倒置平板于36℃±1℃恒溫培養箱內培養48h±2h。8.3細菌菌落計數8.3.1細菌菌落計數時，可用肉眼觀察，必要時可借助于放大鏡或菌落計數器檢查，以防遺漏。細菌計數以菌落形成單位(CFU)表示。8.3.2選擇菌落數在30CFU～300CFU之間，無蔓延菌落生長的平板計數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄成多不可計。8.3.3兩個平板其中一個平板有較大片狀菌落生長時，應選擇無較大片狀菌落生長的平板進行菌落計數；若片狀菌落不到平板的一半，而另一半菌落分布又很均勻，則應選擇菌落分布均勻的半個平板進行菌落計數，計數結果乘以2代表這個平板的菌落數。8.3.4若平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長，則將每條單鏈作為一個菌落計數。8.3.5若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。9試驗數據處理9.1細菌總數的計算9.1.1若只有一個稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每克或每毫升試樣中細菌總數結果，見附錄B中示例1。9.1.2若有兩個連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時，按公式(1)計算：式中：N——樣品中細菌總數；C——平板(含適宜范圍的平板)菌落數；n?——第一稀釋度(低稀釋倍數)平板個數；n?——第二稀釋度(高稀釋倍數)平板個數；d——稀釋因子(第一稀釋度)。計算結果作為每克或每毫升試樣中細菌總數結果，見附錄B中示例2。9.1.3若所有稀釋度的平板上菌落數均大于300CFU,則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算，見附錄B中示例3。9.1.4若所有稀釋度的平板菌落數均小于30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算，見附錄B中示例4。9.1.5若所有稀釋度平板均無細菌生長，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算，見附錄B中示例5。9.1.6若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分小于30CFU或大于300CFU時，則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算，見附錄B中示例6。49.2結果表述9.2.2細菌總數大于或等于100CFU時，第3位數字采用“四舍五入”原則修約，取前2位數字，后面用0代替位數；也可用10的指數形式來表示，按照“四舍五入”原則修約后，采用2位有效數字。5(規范性)平板計數瓊脂培養基制備A.1培養基成分培養基成分見表A.1。表A.1培養基成分成分質量或體積胰蛋白胨/g酵母浸膏(浸粉)/g葡萄糖/g瓊脂/g三級水/mLA.2制法將上述成分煮沸溶解，用1mol/L氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調節pH至7.0±0.2。分裝至三角瓶或試管中，121