植物生理學

實驗指導

目錄

植物材料的采集、處理與保存..........................................3

實驗一擬南芥種植和形態觀察........................................7

實驗二植物細胞的活體染色和死活的鑒定.............................10

實驗三植物原生質體的分離和融合...................................12

實驗四植物葉面積測定原理、方法和步驟.............................16

實驗五植物細胞滲透勢的測定（質壁分離法）.........................17

實驗六植物組織水勢的測定（小液流法）.............................20

實驗七植物根系活力的測定（TTC法）................................22

實驗八根系總吸收面積和活躍吸收面積的測定.........................24

實驗九離體葉綠體的制備以及完整度的測定...........................27

實驗十葉綠體色素的提取、分離和理化性質...........................31

實驗H植物葉片光合速率的測定（改良半葉法）.....................35

實驗十二氧電極法測定植物組織的光合與呼吸速率.....................38

實驗十三小籃子法（廣口瓶法）測定植物的呼吸速率...................43

實驗十四谷物淀粉含量的測定（旋光法）.............................45

實驗十五類似生長素對種子萌發的影響...............................47

實驗十六赤霉素對a-淀粉酶的誘導形成..............................48

實驗十七植物種子生活力快速測定...................................50

實驗十八植物光周期現象的觀察.....................................53

實驗十九植物抗逆性的測定（電導儀法）.............................55

實驗二十脯氨酸含量的測定.........................................57

實驗二一丙二醛（MDA）含量的測定....................................59

實驗二二GUS活性檢測..............................................62

附錄...........................................................65

主要參考文獻.......................................................68

植物材料的采集、處理與保存

植物生理實驗使用的材料非常廣泛，根據來源可劃分為天然的植物材料（如植物幼苗、

根、莖、葉、花等器官或組織等）和人工培養、選育的植物材料（如雜交種、誘導突變種、

植物組織培養突變型細胞、愈傷組織、酵母等）兩大類；按其水分狀況、生理狀態可劃分為

新鮮植物材料（如蘋果、梨、桃果肉，蔬菜葉片，綠豆、豌豆芽下胚軸，麥芽、谷芽，鱗莖、

花椰菜等）和干材料（小麥面粉，玉米粉，大豆粉，根、莖、葉干粉，干酵母等）兩大類，

因實驗目的和條件不同，而加以選擇。

植物材料的采集和處理，是植物生理研究測定中的重要環節。在實際工作中，往往容易

把注意力集中在具體的儀器測定上，而對于如何正確地采集和處理樣品卻不夠注意，結果導

致了較大的實驗誤差，甚至造成整個測定結果的失敗。因此，必須對樣品的采集、處理與保

存給予足夠的重視。

一、原始樣品及平均樣品的采取、處理

植物生理研究測定結果的可靠性（或準確性），首先取決于試材對總體的代表性，如果采

樣缺乏代表性，那么測定所得數據再精確也沒有意義。所以，樣品的采集除必須遵循田間試

驗抽樣技術的一般原則外，還要根據不同測定項目的具體要求，正確采集所需試材。目前，

隨著研究技術的不斷發展，應該不斷提高采樣技術的水平。

在作物苗期的許多生理測定項目中都需要采集整株的試材樣品，在作物中后期的一些生

理測定項目中，如作物群體物質生產的研究，也需要采集整株的試材樣品，有時雖然是測定

植株的部分器官，但為了維持器官的正常生理狀態，也需要進行整株采樣。

除研究作物群體物質生產外，對于作物生理過程的研究來說，許多生理指標測定中的整

株采樣，也只是對地上部分的采樣，沒有必要連根采樣，當然對根系的研究測定例外。采樣

時間因研究目的而不同，如按生育時期或某一特殊需要的時間進行。除逆境生理研究等特殊

需要外，所取植株應是能代表試驗小區正常生育無損傷的健康植株。

為了保證植物材料的代表性，必須運用科學方法采取材料。從大田或實驗地、實驗器皿

中采取的植物材料，稱為“原始樣品”，再按原始樣品的種類（如植物的根、莖、葉、花、果

實、種子等）分別選出“平均樣品”，然后根據分析的目的、要求和樣品種類的特征，采用適

當的方法，從“平均樣品”中選出供分析用的“分析樣品”。

（一）原始樣品的取樣法

1.隨機取樣

在試驗區（或大田）中選擇有代表性的取樣點，取樣點的數目視田塊的大小而定。選好

點后，隨機采取一定數量的樣株，或在每一個取樣點上按規定的面積從中采取樣株。

2.對角線取樣

在試驗區（或大田）可按對角線選定五個取樣點，然后在每個點上隨機取一定數量的樣

株，或在每個取樣點上按規定的面積從中采取樣株。

（二）平均樣品的取樣法

1.混合取樣法

一般顆粒狀（如種子等）或已碾磨成粉末狀的樣品可以采取混合取樣法進行。具體的做

法為：將供采取樣品的材料鋪在木板（或玻璃板、牛皮紙）上成為均勻的一層，按照對角線

劃分為四等分。取對角的兩份為進一步取樣的材料，而將其余的對角兩份淘汰。再將已取中

的兩份樣品充分混合后重復上述方法取樣。反復操作，每次均淘汰50%的樣品，直至所取

樣品達到所要求的數量為止。這種取樣的方法叫做“四分法二

一般禾谷類、豆類及油料作物的種子均可采用這個方法采取平均樣品，但注意樣品中不

要混有不成熟的種子及其他混雜物。

2.按比例取樣法

有些作物、果品等材料，在生長不均等的情況下，應將原始樣品按不同類型的比例選取

平均樣品。例如對甘薯、甜菜、馬鈴薯等塊根、塊莖材料選取平均樣品時，應按大、中、小

不同類型的樣品的比例取樣，然后再將每一單個樣品縱切剖開，每個切取1/4、1/8或

1/16,混在一起組成平均樣品。

在采取果實的平均樣品時，如桃、梨、蘋果、柑橘等果實，即使是從同一株果樹上取樣,

也應考慮到果枝在樹冠上的各個不同方位和部位以及果實體積的大、中、小和成熟度上的差

異，按各自相關的比例取樣，再混合成平均樣品。

（三）取樣注意事項

1.取樣的地點，一般在距田填或地邊一定距離的株行取樣，或在特定的取樣區內取樣。

取樣點的四周不應該有缺株的現象。

2.取樣后，按分析的目的分成各部分（如根、莖、葉、果等），然后捆齊，并附上標簽，

裝入紙袋。有些多汁果實取樣時，應用鋒利的不銹鋼刀剖切，并注意勿使果汁流失。

3.對于多汁的瓜、果、蔬菜及幼嫩器官等樣品，因含水分較多，容易變質或霉爛，可以

在冰箱中冷藏，或進行滅菌處理或烘干以供分析之用。

4.選取平均樣品的數量應當不少于供分析用樣品的兩倍。

5.為了動態地了解供試驗用的植物在不同生育期的生理狀況，常按植物不同的生育期采

取樣品進行分析。取樣方法系在植物的不同生育時期先調查植株的生育狀況并區分為若干類

型，計算出各種類型植株所占的百分比，再按此比例采取相應數目的樣株作為平均樣品。

二、分析樣品的處理和保存

1.從田間采取的植株樣品，或是從植株上采取的器官組織樣品，在正式測定之前的一段

時間里，如何正確妥善的保存和處理是很重要的，它也關系到測定結果的準確性。

一般測定中，所取植株樣品應該是生育正常無損傷的健康材料。取下的植株樣品或器官

組織樣品，必須放入事先準備好的保濕容器中，以維持試樣的水分狀況和未取下之前基本一

致。否則，由于取樣后的失水，特別是在田間取樣帶回室內的過程中，由于強烈失水，使離

體材料的許多生理過程發生明顯的變化，用這樣的試材進行測定，就不可能得到正確可靠的

結果。為了保持正常的水分狀況，在剪取植株樣品后，應立即插入有水的桶中，對于枝條，

還應該立即在水中進行第二次剪切，即將第一次切口上方的一段在水中剪去，以防輸導組織

中水柱被拉斷，影響正常的水分運輸。對于器官組織樣品，如葉片或葉組織，在取樣后就應

立即放入已鋪有濕紗布帶蓋的瓷盤中，或鋪有濕濾紙的培養皿中。對于干旱研究的有關試材，

應盡可能維持其原來的水分狀況。

采回的新鮮樣品（平均樣品）在做分析之前，一般先要經過凈化、殺青、烘干（或風干）

等一系列處理。

（1）凈化：新鮮樣品從田間或試驗地取回時，常沾有泥土等雜質，應用柔軟濕布擦凈，

不應用水沖洗。

（2）殺青：為了保持樣品化學成分不發生轉變和損耗，應將樣品置于105c的烘箱中

烘15min以終止樣品中酶的活動。

（3）烘干：樣品經過殺青之后，應立即降低烘箱的溫度，維持在70-80°C,直到烘至

恒重。烘干所需的時間因樣品數量和含水量、烘箱的容積和通風性能而定。在無烘箱的條件

下，也可將樣品置蒸籠中以蒸汽殺青，而后于陰涼通風處風干。但在蒸汽殺青過程中，常有

可溶性物質的外滲損失，因此，此法僅可作為測量大量樣品干重時的變通方法，在進行成分

分析時應盡量避免。烘干時應注意溫度不可過高，否則會把樣品烤焦，特別是含糖較多的樣

品，在高溫下更易焦化。為了更精密地分析，避免某些成分的損失（如蛋白質、維生素、糖

等），在條件許可的情況下最好采用真空干燥法。

此外，在測定植物材料中酶的活性或某些成分（如維生素C、DNA、RNA等）的含量

時，需要用新鮮樣品。取樣時注意保鮮，取樣后應立即進行待測組分提取；也可采用液氮中

冷凍保存或冰凍真空干燥法得到干燥的制品。放在0-4℃冰箱中保存即可。在鮮樣已進行了

勻漿，尚未完成提取、純化，不能進行分析測定等特殊情況下，也可加入防腐劑（甲苯、苯

甲酸），以液態保存在緩沖液中，置于0-4c冰箱即可。但保存時間不宜過長。

2.已經烘干（或風干）的樣品，可根據樣品的種類、特點進行以下處理：

（1）種子樣品的處理：一般種子（如禾谷類種子）的平均樣品清除雜質后要進行磨碎，

在磨碎樣品前后都應徹底清除磨粉機（或其他碾磨用具）內部的殘留物，以免不同樣品之間

的機械混雜，也可將最初磨出的少量樣品棄去，然后正式磨碎，最后使樣品全部無損地通過1

mm篩孔的篩子，混合均勻作為分析樣品貯存于具有磨口玻塞的廣口瓶中，貼上標簽，注明樣

品的采取地點、試驗處理、采樣日期和采樣人姓名等。長期保存的樣品，貯存瓶上的標簽還

需要涂蠟。為防止樣品在貯存期間生蟲，可在瓶中放置一點樟腦或對位二氯甲苯。

對于油料作物種子（如芝麻、亞麻、花生、薨麻等）需要測定其含油量時，不應當用磨

粉機磨碎，否則樣品中所含的油分會吸附在磨粉機上將明顯地影響分析的準確性。所以，對

于油料種子應將少量樣品放在研缽內研碎或用切片機切成薄片作為分析樣品。

（2）莖稈樣品的處理：烘干（或風干）的莖稈樣品，均要進行磨碎，磨莖稈用的電磨與

磨種子的磨粉機結構不同，不宜用磨種子的電磨來磨碎莖稈。如果莖稈樣品的含水量偏高而

不利于磨碎時，應進一步烘干后再進行磨碎。

-1倍的蒸儲水。充分搗碎后的樣品應成漿狀，從中取出混合均勻的樣品進行分析。如果

不能及時分析，最好不要急于將其搗碎，以免其中化學成分發生變化而難以準確測定。

有些蔬菜（如含水分不太多的葉菜類、豆類、干菜等）的平均樣品可以經過干燥磨碎，

也可以直接用新鮮樣品進行分析。若采用新鮮樣品，可采用上述方法在電動搗碎機內搗碎，

也可用研缽（必要時加少許干凈的石英砂）充分研磨成勻漿，再進行分析。

在進行新鮮材料的活性成分（如酶活性）測定時，樣品的勻漿、研磨一定要在冰浴上或

低溫室內操作。新鮮樣品采后來不及測定的，可放入液氮中速凍，再放入-70℃冰箱中保存。

測定材料在取樣后，一般應在當天測定使用，不應該過夜保存。需要過夜時，也應在較

低溫度下保存，但在測定前應使材料溫度恢復到測定條件的溫度。

對于采集的籽粒樣品，在剔除雜質和破損籽粒后，一般可用風干法進行干燥。但有時根

據研究的要求，也可立即烘干。對葉片等組織樣品，在取樣后則應立即烘干。為了加速烘干,

對于莖稈、果穗等器官組織應事先切成細條或碎塊。

實驗一擬南芥種植和形態觀察

一、實驗原理

擬南芥屬thaliana）十字花科，被子植物門，雙子葉植物綱。

二年生草本，高7-40厘米。基生葉有柄呈蓮座狀，葉片倒卵形或匙形；莖生葉

無柄，披針形或線形。總狀花序頂生，花瓣4片，白色，匙形。長角果線形，長

1--5月。我國內蒙、新疆、陜西、甘肅、西藏、山東、江蘇、安徽、湖北、四川、

云南等省區均有發現。擬南芥的優點是植株小（1個茶杯可種植好幾棵）、每代時

間短（從發芽到開花不超過6周）、結籽多（每棵植物可產很多粒種子）、生活力

強（用普通培養基就可作人工培養）。擬南芥的基因組是目前已知植物基因組的

1/80,這就使克隆它的的有關基因相對說來比較容易。擬南芥是自花受粉植物，

基因高度純合，用理化因素處理突變率很高，容易獲得各種代謝功能的缺陷型。

例如用含殺草劑的培養基來篩選，一般獲得抗殺草劑的突變率是1/100000。由于

上述這些優點，所以，廣泛用于植物遺傳學、發育生物學和分子生物學的研究，

已成為一種典型的模式植物。

二、實驗材料、試劑與儀器設備

（-）實驗材料：擬南芥種子

（二）試劑：PNS營養液（1L）

母液毫升

母液15

母液22

母液32

母液4

母液5

母液61

PNS營養液母液配方

母液1：IMKNO：S

母液2：IMCa(N03)2?4H#

母液3：IMMgSO.1,7HQ

母液4：20mM

FeS04

EDTA

注意先各自配成溶液，再混合。

磷酸二氫鉀

磷酸氫二鉀

母液6：MS微量元素

硼酸

硫酸鎰(MnSO,H20)

CuS04'H，0

ZnSO,,7H20

NaMoOt,2H,0

NaCl

CoCi,6IL0

以上母液均配至IL,配制時使用滅菌的雙蒸水。配制后4c冰箱中保存備用。

人工土：3份蛭石，1份珍珠巖和1份黑土混合。

(三)儀器設備：培養皿，鑲子，托盤，保鮮膜，花盆，人工氣候箱。

三、實驗步驟

1.將春化過的擬南芥種子種于澆過飽和PNS營養液的人工土中，并用保鮮

膜罩上。兩天后光照，三天后揭膜。

2.人工培養室條件：相對濕度80%,恒溫20-24°C,光照強度

80-200umol/M7S,光照周期為8h黑暗、16h光照培養。

四、實驗結果

每隔三天觀察生長情況，并適時澆水。按照下表記錄擬南芥的生長情況。

株高(cm)葉片花果莢收獲

第1天

第4天

第7天

第10天

第13天

第16天

第19天

第22天

第25天

第28天

第31天

第34天

第37天

第40天

第43天

第47天

第50天

第53天

第56天

第60天

五、思月章題

1.繪制擬南芥的株高的生長曲線。

2.為什么說擬南芥是模式植物？

3.擬南芥的特點？

實驗二植物細胞的活體染色和死活的鑒定

一、實驗原理

用某種對植物無害的染料稀溶液對活細胞進行染色稱活體染色。中性紅（2-

甲基-3-氨基-6-二甲氨基二氮雜恿鹽酸鹽，3-氨基-6-二甲氨基-2-甲基吩嗪鹽酸

鹽，Neutralred,Neutralredchloride,Toluylenered,

Aminodimethy1aminotoluaminozine,

3-Amino-6-dimethylamino-2-methylphenazinehydrochloride0分子式：

C,5H,7CIN,1；分子量：。）是常用的活體染料之一。深綠色、棕色或淺黑色結晶-

成長的細胞是一個滲透系統，活的原生質具有選擇透性，原生質內部包含著

一個大液泡，具有一定的溶質勢。當細胞與外界低水勢溶液接觸時，細胞內的水

分外滲，原生質隨著液泡一起收縮而發生質壁分離；其后，當與清水（或高水勢

溶液）接觸，細胞又因液泡的吸水膨脹而發生質壁分離復原。死細胞因其原生質

的選擇透性已遭破壞，故與低水勢溶液接觸時不產生質壁分離。

二、材料、儀器設備及試劑

1.材料：洋蔥；

2.儀器設備：不銹鋼單面刀片；鑲子；吸水紙；酒精燈；載玻片；蓋玻片；

膠頭滴管；顯微鏡；

3.試劑：蔗糖液；0.1%中性紅溶液母液。

三、實驗步驟

1.制片染色

?左右的小塊，用尖頭鏡子輕輕地撕取洋蔥（玉蔥）鱗片內表皮薄片，浸到％

中性紅溶液中10T5min進行染色。

2.觀察

將染色后的植物材料放到載玻片上，用弱堿性水略加清洗后，蓋好蓋玻片，

在蓋玻片的一側滴加去離子水（或pH略高于的自來水），然后在顯微鏡下觀察，

可以看出液泡染成櫻桃紅色；原生質層（細胞質和細胞）則無色透明緊貼細胞壁

（注意：在細胞的角隅上可以看見）。

在第1項觀察后，接著從蓋玻片的一邊滴2滴蔗糖液，在蓋玻片的另一

邊用吸水紙吸蓋玻片下的水，將蔗糖液引入蓋玻片下浸漬植物材料，并立即鏡檢,

可以看到細胞很快發生質壁分離。先是凹形質壁分離，而后變為凸形質壁分離。

在第2項觀察后，接著在蓋玻片的一邊加入2-3滴去離子水，在另一邊用吸

水紙吸去糖液，將去離子水引入蓋玻片底，立即鏡檢可以看到帶有液泡的原生質

體重新吸水膨大，最后充滿整個細胞腔，即質壁分離復原（復原緩慢進行時，細

胞仍可正常存活；如果進行很快，則會因原生質機械破壞而死亡，注意觀察機械

損傷的細胞的特點）。

將一片經中性紅染色的植物材料放在載玻片上，加一滴去離子水后加蓋玻

片，在酒精燈火焰上微微加熱，然后在顯微鏡下觀察，可以看到細胞質凝結成不

均勻的凝膠狀，與細胞核一起染成紅色。然后按法加蔗糖液也不發生質壁分

離。

四、實驗結果收集照片。

五、思考題

1.活體細胞觀察應該注意什么？

2.機械損傷后的細胞有什么特點？

實驗三植物原生質體的分離和融合

實驗目的：

1、掌握原生質體分離的方法；

2、了解并掌握利用PEG原生質體融合的原理和方法。

一、實驗原理：

植物原生質體融合和培養在理論和實踐上都有很大的意義，在植物遺傳工程

和育種研究上具有廣闊的應用前景。它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一,

它不僅能克服遠源雜交有性不親和障礙，也可克服傳統的通過有性雜交誘導多倍

體植株的麻煩，最終將野生種的遠源基因導入栽培種中，原生質體融合技術可望

成為作物改良的有力工具之一。植物原生質體培養方法起源于植物單細胞的培養

方法。1954年，植物單細胞培養才獲得成功。Mllir培養的萬壽菊及煙草懸浮細

胞植入到長有愈傷組織的培養基上得到了它們的單細胞克隆，并建立了看護培養

的方法；1960年，Jone等建立了微室培養法。同年，Cocking應用酶法分離原生

質獲得成功，從而在實驗條件下很容易獲得大量的原生質體。隨著多種適用原生

質體分離的商品酶的出現，原生質體的培養方法也得到了不斷地改進，現在常用

的原生質體培養方法有：液體淺層培養法、雙層培養法、瓊脂糖包埋法、瓊脂島

培養法以及使用條件培養基或飼喂培養等。

植物原生質體是除去細胞壁后為原生質所包圍的“裸露細胞”，是開展基礎

研究的理想材料。其中酶解法分離原生質體是一個常用的技術，其原理是植物細

胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶和

果膠酶能降解細胞壁成分，除去細胞壁，即可得到原生質體。由于原生質體內部

與外界環境之間僅隔一層薄薄的細胞膜，必須保持在滲透壓平衡的溶液中才能保

持其完整性。其次，還應當考慮取材、酶的種類和純度、酶液的滲透壓、酶解時

間及溫度等因素對分離原生質體的影響。測定原生質體的活性有多種方法。熒光

素雙醋酸酯(FDA)染色是常用的一種方法,FAD本身無熒光，無極性，可透過完整

的原生質膜。一旦進入原生質體后，由于受到酯酶分解而產生具有熒光的極性物

質熒光素。它不能自由出入原生質膜,因此有活力的細胞能產生熒光,無活力的原

生質體不能分解FAD無熒光產生。許多化學、物理學和生物學方法可誘導原生質

體融合，現在被廣泛采用并證明行之有效的融合方法是聚乙二醇（PEG）法、高

鈣高pH法和電融合法；聚乙二醇（PEG）作為一種高分子化合物，20-50%的濃

度能對原生質體產生瞬間沖擊效應，原生質體很快發生收縮與粘連，隨后用高鈣

高pH法進行清洗，使原生質體融合得以完成。聚乙二醇（PEG）誘導的機理：聚

乙二醇（PEG）由于含有酸鍵而具有負極性，與水、蛋白質和碳水化合物等一些

正極化基團能形成氫鍵，當聚乙二醇（PEG）分子足夠長時，可作為臨近原生質

表面之間的分子橋而使之粘連、聚乙二醇（PEG）也能連接鈣等陽離子，鈣可在

一些負極化基團和聚乙二醇（PEG）之間形成橋，因而促進粘連。從而引起原生

質體融合：高鈣高pH由于增加了質膜的流動性，因而也大大提高了融合頻率，

洗滌時滲透壓沖擊也可能起作用。原生質體分離純化后，在適當的培養基上應用

合適的培養方法，能夠再生細胞壁，并啟動細胞持續分裂，直至形成細胞團，長

成愈傷組織或胚狀體，再分化發育成苗。其中，選擇合適的培養基及培養方法時

原生質體培養中最基礎也是最關鍵的環節。PEG為一種高分子化合物，能與水、

蛋白質、和碳水化合物等一些基團能形成氫鍵。普遍認為聚乙二醇分子能改變各

類細胞的膜結構，使兩細胞接觸點處質膜的脂類分子發生疏散和重組，由于兩

細胞接口處雙分子層質膜的相互親和以及彼此的表面張力作用，從而使細胞發生

融合。該方法的優點是：用法簡單，容易獲得融合體，融合效果好。

二、實驗材料、試劑與儀器設備：

（-）實驗材料：

（1）韭菜或大蒜葉；

（2）紅辣椒

（二）試劑:

（1）20%蔗糖；

（2）13%CPW洗液:

3）

2?2H20）

gSO.）

4）

13%W/V甘露醇

（3）酶液：

1%纖維素酶

1%果膠酶

2Poi

10mM兩個結晶水的氯化鈣（CaCk?2HQ）

（4）40%PEG液:

40%PEG液（MW1500-6000）

2?2H20）

2POI）o

（三）儀器設備：350目網，離心機，試管，離心管，吸管，顯微鏡，恒溫

水浴鍋。

三、實驗步驟：

植物原生質體的分離與純化

25c黑暗條件下，酶解1-2小時。

2、用350目網過濾除去未完全消化的葉片等殘渣。

3、在lOOOrpm條件下離心5分鐘，棄上清液。紅辣椒800轉/分離心5分

鐘。加入3-4ml13/CPW洗液，相同條件下離心,棄上清液。加1ml13隊PW洗

液懸浮。

4、蔗糖漂浮法去除碎片。

蔗糖漂浮方法：

（1）用細口吸管吸20%蔗糖溶液約3ml,小心插入盛有原生質體懸液的離心

管底部，緩緩將蔗糖溶液擠出，由于比重不同，蔗糖溶液與原生質體懸液中間有

一明顯界面（注意要有明顯界面）.

（2）離心5分鐘（韭菜1000轉/分，辣椒800轉/分），此時死細胞及碎片降

至蔗糖溶液內，聚集在離心管底部，而活細胞由于有大量泡沫，故漂浮在上下界

面處，

（3）用細管吸取漂浮在上下界面處的健康原生質體，轉入干凈的離心管中，

加入3-4ml13版PW洗液離心（鏡檢決定是否需要離心），離心5分鐘（韭菜1000

轉/分，辣椒800轉/

細胞融合

1.不同的原生質體各300u1與帶蓋離心管中，另加入300u140%PEG液,

30C水浴中溫浴15min；

2.融合液一滴于載玻片上（注意保持一定濕度，不能太干），輕輕蓋上蓋玻片，

顯微鏡觀察。

四、實驗結果：

用光學顯微鏡或倒置顯微鏡（高倍）觀察2-3個細胞靠近或融合的過程式觀

察時注意不同程度的融合現象。通常分為五個階段。①兩細胞膜接觸，粘連；②

細胞膜形成穿孔；③兩細胞的細胞質連通；④通道擴大，兩細胞連成一體；⑤細

胞完全合并，形成一個含有兩個或多個核的圓形細胞。）

五、思考題

1.繪制原生質體融合的基本過程；

2.簡述細胞融合的原理

3.做細胞融合實驗時，應注意哪些問題？

實驗四植物葉面積測定原理、方法和步驟

植物的生長與葉面積密切相關，一方面葉面積的大小影響了植物的光合物質

積累，另一方面掌握的生長又通過葉面積的變化得到體現，因此測定植物的葉面

積對于植物的生長生理、光合生理和逆境生理具有重要的意義。

一、實驗原理

植物的生長與葉面積密切相關，一方面葉面積的大小影響了植物的光合物質

積累，另一方面掌握的生長又通過葉面積的變化得到體現，因此測定植物的葉面

積對于植物的生長生理、光合生理和逆境生理具有重要的意義。可以用葉面積儀

直接測定，沒有條件的試驗室也可以通過測量、稱重的方法測得。

二、材料與用品

校園里各種植物葉片

直尺、剪刀、復印紙、電子天平等

三、方法與步驟

1、從葉片基部用剪刀小心剪取10片葉片。

2、用直尺量取每一片葉的最長處為葉長、最寬處為葉寬，記錄下來。

3、將葉片固定在復印紙上，用鉛筆沿葉緣將葉片形狀描下來，用剪刀剪下來。

4、將剪下的紙葉子在電子天平上稱重，記錄。

5、稱出一張復印紙的質量，測量出長和寬，計算出紙的面積，然后換算出每

克重量所對應的紙面積。

6、將剪下來的紙葉子的質量換算成面積，是為每片葉的面積。

7、用每片葉的面積除以其長度與寬度的乘積，可以得到一個小于1的系數，

該系數與葉片的形狀有關，稱為形狀系數或校正因子，計算10片葉子的形狀系

數，算出其平均值。在以后的測量中，可以只用直尺測量該種植物葉片的長和寬，

二者的乘積乘以形狀系數，即為葉面積。

8、測定形狀不規則葉片的葉面積可按照上述1,2,3,4,5,6步操作。

四、結果與分析

測量出葉片的長和寬，計算出葉面積和形狀系數。

實驗五植物細胞滲透勢的測定（質壁分離法）

一、實驗原理

植物細胞的滲透勢主要取決于液泡的溶質濃度，因此又稱溶質勢。滲透勢與

植物水分代謝、生長及抗逆性等有密切關系。已知在干旱、鹽漬等條件下，一些

植物常在細胞內主動積累溶質，以降低其滲透勢，增加吸水能力，而在一定程度

上維持細胞膨壓，保障細胞的生長和氣孔的開放，這種現象叫做滲透調節作用。

滲透調節能力的大小可以用逆境條件下細胞的滲透勢的降低值來表示，在水分生

理與抗逆性生理研究中經常需要測定植物細胞的滲透勢。

將植物組織放入一系列不同濃度的蔗糖溶液中，經過一段時間，植物細胞與

蔗糖溶液間將達到滲透平衡狀態。如果在某一溶液中細胞脫水達到平衡時剛好處

于臨界質壁分離狀態，則細胞的壓力勢（中p）將下降為零。此時細胞液的滲透

勢（中S）等于外液的滲透勢中so。此溶液稱為該組織的等滲溶液，其濃度稱為

該組織的等滲濃度，即可計算出細胞液的滲透勢（甲S）。實際測定時，因為臨界

質壁分離狀態難以在顯微鏡下直接觀察到，所以一般均以初始質壁分離作為判斷

等滲濃度的標準。處于初始質壁分離狀態的細胞體積，比吸水飽和時略小，故細

胞液濃縮而滲透勢略低于吸水飽和狀態時的滲透勢稱基態滲透勢。

二、實驗材料、試劑與儀器設備

（-）實驗材料

紫皮洋蔥鱗莖

（二）試劑

1.1mol/L蔗糖水溶液：稱取預先在60-80C下烘干的蔗糖溶于60ml蒸

儲水中，定容到100ml。

3.蔗糖系列標準液：取干燥潔凈的小試劑瓶7支編號，用1mol/L蔗糖水

溶液依據C1XV1=C2XLLLLLLL等一系列不同濃度的蔗糖水溶液（具體范圍可

根據材料不同而加以調整），貯于試劑瓶中，瓶口加塞以防蒸發濃縮。取不同濃

度的蔗糖溶液10ml稱重，計算其密度。

（三）儀器設備

顯微鏡，載玻片，蓋玻片，溫度計，尖頭鏡子，刀片，直徑6cm小培養皿,

試劑瓶若干，燒杯，容量瓶，量筒，吸管，吸水紙適量。

三、實驗步驟

1.取干燥、潔凈的培養皿7套編號，將配制好的不同濃度的蔗糖溶液約5ml

按順序加入各培養皿，使之成一薄層，蓋好皿蓋備用。

2,迅速分別投入各種濃度的蔗糖溶液中，使其完全浸入，每一濃度4-

3.5-10min后，取出表皮薄片放在滴有同樣溶液的載玻片上，蓋上蓋玻片，

于低倍顯微鏡下觀察，如果所有細胞都產生質壁分離的現象，則取低濃度溶液中

的制片作同樣觀察，并記錄質壁分離的相對程度。如果在兩個相鄰濃度的切片中，

一個沒有發生質壁分離或質壁分離的細胞不足50%,另一個發生質壁分離的細胞

數超過50%,則可粗略地將這兩個濃度的平均值作為其等滲濃度，也可用插值法

更準確地確定等滲濃度。每一制片觀察的細胞不應少于100個。檢查時可先從中

間濃度開始。

在找到上述濃度極限時，用新的溶液和新鮮的葉片重復進行幾次，直至有把

握確定為止。在此條件下，細胞的滲透勢與兩個極限溶液濃度之平均值的滲透勢

相等。

4.也可用CaCk或NaCl代替蔗糖，但須改變式中等滲系數。CaCl2?

將結果記錄于下表中。

植物細胞滲透勢測定記載表

實驗人日期材料名稱實驗

室溫度

蔗糖濃度（mol/kg）滲透勢（Mpa）質壁分離細胞數/總細胞數

*100%

四、結果計算

由所得到的等滲濃度和測定的室溫，用下式計算供試溶液的滲透勢（中so）,

即為細胞的滲透勢(Ws)。

Ws(MPa)=Wso=-iCRT

式中，Wso——供試溶液的滲透勢，MPao

i一一解離系數，蔗糖=1o

C——供試溶液的濃度，mol/L(以水作溶劑)。

R-----MPa/(mol?K)］。

T——絕對溫度，(273+t℃),Ko

五、思考題

1、某種植物葉片吸水飽和時的滲透勢經測定為--

2、試問不同植物材料得滲透勢是否相同？

實驗六植物組織水勢的測定（小液流法）

一、實驗原理

水勢（waterpotential）表示水分的化學勢，象電流之由高電位處流向低電

位處一樣，水從水勢高處流向低處（代表水的能量水平）。植物體組織之間，細胞

之間以及植物體及環境間的水分移動方向都由水勢差決定。當植物細胞或組織放

在溶液中時，如果植物的水勢小于溶液的滲透勢（溶質勢），則組織吸水而使溶液

濃度變大；反之，則植物細胞內水分外流而使溶液濃度變小；若植物組織的水勢

與溶液的滲透勢相等，則二者水分保持動態平衡，外部溶液濃度不變，此溶液的

滲透勢即等于所測植物的水勢。可以利用溶液的濃度不同其比重也不同的原理來

測定試驗前后溶液濃度的變化。然后根據公式計算其滲透勢。因溶液的濃度是已

知的，可以根據公式算出其滲透壓，取其負值，為溶液的滲透勢（中“），即代表

植物的水勢（力.）。

%=2,=-iCRT（大氣壓）

二、材料、儀器設備及試劑

（-）材料：小白菜葉片

（-）儀器設備：具塞小瓶12個、帶有橡皮管的注射針頭、鑲子、打孔器

培養皿。

三、實驗步驟

（-）取干燥潔凈的具-小瓶的2/3處），另取6個干燥潔凈的小-

（二）取待測樣品的功能葉數片，用打孔器打取小圓片約50片，放至培養

皿中，混合均勻。用鏡子分別夾入5-8個小圓片到盛有不同濃度的甲烯藍蔗糖溶

液的小瓶中（乙組）。蓋上瓶塞，并使葉圓片全部浸沒于溶液中。放置約30-60min,

為加速水分平衡，應經常搖動小瓶。

（三）經一定時間后，用注射針頭吸取乙組各瓶藍色糖液少許，將針頭插入

對應濃度甲組小瓶溶液中部，小心地放出少量液流，觀察藍色液流的升降動向。

（每次測定均要用待測濃度的甲烯藍蔗糖溶液清洗幾次注射針頭）。如此方法檢

查各瓶中液流的升降動向。若液流上升，說明浸過小圓片的蔗糖溶液濃度變小（即

植物組織失水）；表明葉片組織的水勢高于該濃度糖溶液的滲透勢；如果藍色液

流下降則說明葉片組織的水勢低于該糖溶液的滲透勢，若藍色液流靜止不動，則

說明葉片組織的水勢等于該糖溶液的滲透勢，此糖溶液的濃度即為葉片組織的等

滲濃度。

四、結果計算

將求得的等滲濃度值代入如下公式：

力，=W?=—iCRT

式中：口=植物組織的水勢(單位：MPa)；帆=溶液的滲透勢；C=等滲濃

度(mol/L)；區=氣體常數［L?MPa/(mol-K)］；T=絕對溫度；1=解離系數

(蔗糖=1,CaCl2

五、思考題

1、測定同一植物上部及下部葉片的水勢有何差別？

2、用小液流法測定植物組織水勢與用質壁分離法測定植物細胞滲透勢都是

以外界溶液的濃度算出的溶質勢為根據，它們之間的區別何在？

實驗七植物根系活力的測定(TTC法)

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響

地上部的生長和營養狀況及產量水平。本實驗練習測定根系活力的方法，為植物

營養研究提供依據。

一、實驗原理

氯化三苯基四氮哩(TTC)是標準氧化電位為80mV的氧化還原色素，溶于水

中成為無色溶液，但還原后即生成紅色而不溶于水的三苯甲瓚，生成的三苯甲瓚

比較穩定，不會被空氣中的氧自動氧化，所以TTC被廣泛地用作酶試驗的氫受體,

植物根系中脫氫酶所引起的TTC還原，可因加入琥珀酸，延胡索酸，蘋果酸得到

增強，而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC還原量能表示脫氫酶活性并作為根

系活力的指標。

(TTC)(TTF)

二、材料、設備儀器及試劑

(-)材料：水培小麥根系。

(三)試劑:

1、乙酸乙酯(分析純)。

2、次硫酸鈉(Na2szOD，分析純，粉末。

3、1%TTC溶液：準確稱取TTC,溶于少量水中，定容到100ml。用時稀釋至

各需要的濃度。

4、磷酸緩沖液(1/15mol/L,pH7)0

5、Imol/L硫酸:

6、：稱取琥珀酸，溶于水中，定容至100ml即成。

三、實驗步驟

1、定性測定

(2)把根仔細洗凈，把地上部分從莖基部切除。將根放入三角瓶中，倒入

反應液，以浸沒根為度，置37℃左右暗處放1-3h,以觀察著色情況，新根尖

端幾毫米以及細側根都明顯地變成紅色，表明該處有脫氫酶存在。

2、定量測定

（1）TTC標準曲線的制作：2SO粉搖勻后立即產生紅色的甲攢攢25ug、

50ug,100ug、150ug,200Pg的標準比色系列，以空白作參比，在485nm波

長下測定吸光度，繪制標準曲線。

C下暗保溫l-3h,此后加入lmol/L硫酸2ml,以停止反應。（與此同時做一

空白實驗，先加硫酸與根樣品，10分鐘以后（完全殺死根系）再加其他藥品，操

作同上）。

（3）把根取出，吸干水分后與乙酸乙酯3-4ml和少量石英砂一起在研缽內

磨碎，以提出甲攢。紅色提取液移入試管，并用少量乙酸乙酯把殘渣洗滌二、三

次，皆移入試管，最后加乙酸乙酯使總量為10ml,用分光光度計在波長485nm下

比色，以空白試驗作參比測出吸光度，查標準曲線，即可求出四氮理還原量。

四、結果計算

四氮嚏還原強度（mg/g（根鮮重）/h）=四氮理還原量（mg）/［根重（g）X

時間（h）］

五、思考題

1、為什么要測定根系活力？植物的根與地上部分有何關系？

2、植物根系活力的測定為什么要以殺死根系作為空白對照？

實驗八根系總吸收面積和活躍吸收面積的測定

植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和活力水平直接影響

地上部的生長和營養狀況及產量水平。本實驗學習測定根系吸收面積和活力的方

法。

一、實驗原理

根據植物礦質吸收的理論，植物對溶質的最初吸收具有吸附的特性，并假定

這時在根系表面均勻地覆蓋了一層被吸附物質的單分子層，因此可以根據根系對

某種物質的吸附量來測定根的吸收面積。常用甲烯藍作為被吸附物質，它的被吸

附量可以根據供試液濃度的變化用比色法準確地測出。已知Img甲烯藍成單分子

層時所占面積為2,據此即可求出根系的總吸收面積。當根系在甲烯藍溶液中已

達到吸附飽和而仍留在溶液中時，根系的活躍部分能把原來吸附的物質吸收到細

胞中去，因而繼續吸附甲烯藍。從后一吸附量求出活躍吸收面積，可作為根系活

力指標。

二、儀器與試劑

分光光度計1臺、50ml燒杯3只、20或50ml量筒1個(依根系大小而定)、

移液管1ml1支,10ml1支、試管(15X150mm)10支、容量瓶1000ml1個、

100ml1個、吸水紙適量、試管架1個。

甲烯藍溶液：精確稱取甲烯藍(C//3SCI-3H20),加水溶解，定容至1000ml。

此溶液每ml含甲烯藍。

的甲烯藍溶液：用刻度吸管吸取甲烯藍定容至100ml,搖勻即成。

三、實驗方法

1.植物材料的準備本實驗最好采用水培玉米，以獲得完整而無損傷的根

系。玉米根系發達，是較好的材料。田間栽培的材料因不可能無損地挖出全部根

系，最好避免在正式試驗中使用。

2.甲烯藍溶液標準曲線的制作取試管7支編號，按表1次序加入各溶液,

即成甲烯藍系列標準液。

表1各試劑加入順序

試管號1234567

甲烯藍溶液(ml)0

1246810

蒸儲水(ml)10

986420

甲烯藍濃度mg/ml0

-以第1管(水)為參比在分光光度計下比色，取波長660nm,讀出光密度,

以甲烯藍濃度為橫坐標，光密度為縱坐標繪成標準曲線。

3.取待測植物根系用濾紙將水吸干再用排水法在量杯或量筒中測定其根系

體積。把甲烯藍溶液分別倒在三個編號的小燒杯里，每杯中溶液量約10倍于根

的體積，準確記下每杯的溶液用量。

4.取根系，用吸水紙小心吸干數次，慎勿傷根，然后順次浸入盛有甲烯藍

溶液的燒杯中，每杯中浸。注意每次取出時都要使甲烯藍溶液能從根上流回到原

燒杯中。

5.從三個燒杯中各取1ml溶液加入試管，均稀釋10倍，測得其光密度，查

標準曲線，求出每杯浸入根系后溶液中剩下的甲烯藍毫克數。

測定根系吸收面積記載表

植物名稱

杯中甲烯藍溶液量(ml)

開始時甲烯藍濃度

(mg/ml)

浸根后燒杯1

溶液濃度燒杯2

(mg/ml)燒杯3

燒杯1

被吸收的

燒杯2

甲烯藍量

燒杯1+2

(mg)

燒杯3

根體積(ml)

總的

根吸收

活躍的

面積m2

活躍/總的(%)

總的

比表面______________________________________________

活躍的

四、結果計算

把結果記入上表，并以下式求出根的吸收面積：

總吸收面積面)={[(Cl-ClOXV1]+[(C2-C2OXV2]}

活躍吸收面積(m2)=[(C3—C3'

活躍吸收面積(％)=活躍吸收面積/總吸收面積x100

比表面=根的總吸收面積/根的體積

式中C—溶液原來的濃度mg/ml；

C'—浸提后的濃度mg/ml；

1,2,3—燒杯編號

實驗九離體葉綠體的制備以及完整度的測定

一、實驗原理

葉綠體是植物進行光合作用的細胞器，分布在葉肉細胞內（組成氣孔的保衛

細胞也含有葉綠體）。葉綠體是由被膜、間質和類囊體三部分組成。依據分離所

得葉綠體的結構完整程度，大致將葉綠體分成兩類：一類為被膜已破碎的葉綠體,

稱之為破碎葉綠體，它具有光合電子傳遞、光合放氧和光合磷酸化的功能；另一

類為被膜完整的葉綠體，它具有同化二氧化碳的完全的光合作用功能。分離和制

備有活性的離題葉綠體是研究葉綠體的結構功能、光合作用原理及遺傳控制機理

的前提。要分離有活性、較純的完整葉綠體相當困難，有些植物葉片細胞的細胞

比較厚，葉綠體不易從細胞中分離出來；有些植物葉綠體外膜極易破損，有些植

物葉片細胞中含有某些內源性抑制物質。例如：水解酶、氧化酶等，在制備過程

中極易釋放出來，破壞葉綠體的結構和活性。因此，不是所有的高等植物都適合

用來分離和制備葉綠體，最常用的植物材料有菠菜、豌豆、玉米、甜菜、大麥等。

此外，低等植物如衣藻、小球藻等也是常用的材料。葉綠體遺傳轉化技術作為一

項新技術近年來為植物基因工程提供了一條新途徑。但葉綠體一旦離體，其翻譯

活性在15-30min后就可能完全喪失。葉綠體是綠色植物細胞中典型的細胞器，

可通過研磨葉片并勻漿后，根據其顆粒大小經過濾、差速離心加以分離。分離葉

綠體應在等滲溶液中制備，以減少滲透壓對葉綠體的傷害。整個分離過程應在

0-4℃下進行，所有提取物、溶液和材料，也應保存在該溫度下備用。葉綠體活

力會隨著離體時間延長而不斷下降，因此，分離工作應盡可能在短時間內完成。

下面分別介紹這兩類葉綠體的制備以及被膜完整度的測定。

分離和制備葉綠體的方法很多，目前最常用且較方便的是分步差速離心的方

法。一般葉綠體的直徑約為幾個微米，因此細胞破碎后在一定的離心力范圍內即

能分離獲得葉綠體。

二、實驗材料、試劑與儀器設備

1.器材與試劑

（1）器材

普通離心機（最好帶有水平離心頭）、研缽或電動搗碎器、分光光度計、冰箱、

扭力天平、pH計、量筒、移液管、離心管、脫脂紗布等。

(2)試劑

①，「'，Tricine20mmol?匚一小冰箱中備用。)

②80%的丙酮

三、實驗步驟

(1)葉綠體制備

取菠菜、豌豆或小麥苗等新鮮葉片，洗凈后去除中脈，置于研缽或搗碎器中，

加人冰冷的提取液，每10g葉片約加20ml冰冷的STN溶液。用手工研磨或用電

動搗碎器搗碎，使葉片搗碎至碎米粒樣大小，經過4層紗布過濾，濾液先以200Xg

離心Imin,4℃,去除粗粒沉淀，上層液再以lOOOXg離心3min,4℃,倒掉上

層液，沉淀為葉綠體。用少量STN溶液懸浮葉綠體，懸浮時可用棉球分散沉淀，

并通過棉球吸取，以過濾葉綠體結塊，葉綠體懸浮液置于冰浴中備用。

(2)葉綠素濃度測定

注意事項

(1)提取葉綠體操作都在低溫下進行，所用器皿都需預冷。

(2)葉綠體活力會隨著離體時間延長而不斷下降，因此，操作盡可能迅速，

分離工作盡可能在短時間內完成。

(3)破碎的葉綠體制劑儲存在液氮中，其Hill反應活性可保持較長時間，儲

存時葉綠體的濃度宜濃些(約3-4mg葉綠素/ml),并加25%體積的甘油。

完整葉綠體的制備

分離方法一般有兩種，一是酶消化方法，把葉片表皮撕去后，用纖維素酶和

果膠酶消化細胞壁，得到原生質體，再把原生質體通過尼龍網小孔(孔徑20um),

使原生質體破裂而釋放出完整葉綠體，但此方法分離得到的葉綠體數量有限。另

一種是用機械方法，先用搗碎機破碎葉片，再分步離心，可以大量制備葉綠體。

這里主要介紹離心法分離完整葉綠體。

1.器材與試劑

(1)器材

普通離心機(需帶有水平離心頭)，或低溫離心機、電動搗碎器、照光裝置、

氧電極測氧裝置等。

(2)試劑

①2,2mmol/LEDTA-Na22P0?2mmol/L抗壞血酸鈉(抗壞血酸鈉宜在使用前

現配現加)

②2,10mmol/LNaCl,10mmol/LK:iFe(CN)6?10mmol/LNH“C1

③

④

Percoll濃度706050403020

(%)

比重g/ml

2.操作方法

(1)采摘新鮮菠菜或豌豆葉片

菠菜要選擇嫩而厚，無顯著皺紋的葉片，最好在早晨摘取，以免日照后在葉

綠體內積累淀粉，不利于完整葉綠體的分離。豌豆也要選擇嫩而厚的葉片，摘取

后應盡快使用。葉片先在強光下照射15-20min,用以激活葉綠體，尤其用在完整

葉綠體的以二氧化碳為底物放氧活性測定時，能使其縮短光合作用誘導期。為了

防止強光照射下的溫度上升，可把葉片鋪放在冰塊上，并在光源與葉片之間放隔

水層。

(2)葉綠體制備

葉片去除葉柄及中脈后，以每10g葉片約加20-30ml冰冷的提取液。在電動

搗碎器上高速搗碎，約2s/次，間隔搗碎3-4次，使葉片碎成綠豆粒樣大小，然

后經4層紗布過濾，去除殘渣。注意過濾時不可用力擠壓，以免葉綠體被膜破碎。

濾液以1000Xg離心，4℃,將離心管放人離心機后，使離心機的加速很快上升

到預定值，經約30s后再很快使其下降停止，整個離心程序大約用2-

(3)葉綠體被膜完整率的進一步提高

上述方法所得葉綠體被膜完整率一般約在60%左右，好的時候也可達到70%

以上。如果需要進一步提純，一種簡單的方法是再次用懸浮介質洗滌葉綠體，并

用同樣離心方法沉淀葉綠體，把破碎的葉綠體漂洗去，起著浮選作用，但用此方

法提高被膜完整率的程度有限，而且葉綠體損失也多。另一種方法是用Percoll

作為密度梯度介質，方法是將3ml含有80%Percoll(以原液為100%濃度，用水

稀釋)，鋪在10ml體積的離心管下層，再把3ml40%Percoll鋪在離心管的中層,

然后將1ml葉綠體懸浮液輕輕地鋪在離心管的上層，用水平離心頭的離心機在

1500Xg下離心2-3min,注意此時離心機的加速一定要緩慢上升，而下降時也要

緩慢停下，否則會破壞Percoll的濃度梯度層的形成，取出離心管可以看到有3

層綠色帶，最上層的為破碎葉綠體，沉在底層的為粗顆粒，而40%-80%Percoll

之間的界面上有一綠色層，是完整葉綠體，小心地將它吸取出來，轉移到葉綠體

懸浮介質里。此部分葉綠體的被膜完整率可達95%以上，有時甚至100虬Percoll

介質可以重復使用，把密度梯度離心用過以后的40%和80%Percoll,分別吸取

出來，存儲于冰箱中以備下次使用。如果制備完整葉綠體的目的只是為了供葉綠

體DNA的分離所用，則主要獲得被膜完整率高的葉綠體制劑即可，不必考慮葉綠

體同化二氧化碳的活性，因此提取介質可改用簡單的STN溶液，但是操作順序需

按照制備完整葉綠體的方法，再用Percoll作密度梯度離心提純。

葉綠體被膜完整率的測定：

被膜完整率（盼=［（被膜漲破葉綠體的Hill反應速率一完整葉綠體的Hill

反應速率）/被膜漲破葉綠體的Hill反應速率］X100

測定計算實例見下圖：

圖8用鐵氟化鉀作Hill氧化劑檢測葉綠體完整度記錄圖

四、實驗結果按照上述的圖表記錄實驗結果并計算。

五、思考題

1.被膜完整的葉綠體與破碎的葉綠體在功能上有什么區別？

2.在本實驗中山梨醇的作用？

3.本實驗中鐵氟化鉀的作用？

實驗十葉綠體色素的提取、分離和理化性質

I葉綠體色素的提取與分離

一、實驗原理

葉綠體中含有綠色素（包括葉綠素a和葉綠素b）和黃色素（包括胡蘿卜素

和葉黃素）兩大類。它們與類囊體膜相結合成為色素蛋白復合體。這兩類色素都

不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機溶劑提取。提取液可用色

譜分析的原理加以分離。因吸附劑對不同物質的吸附力不同，當用適當的溶劑推

動時，混合物中各種成分在兩相（固定相和流動相）間具有不同的分配系數，所

以移動速度不同，經過一定時間層析后，可將各種色素分開。

二、材料、儀器設備及試劑

（-）材料：菠菜葉片

（二）儀器設備：研缽、漏斗、100ml三角瓶、剪刀、滴管、培養皿（直

徑11cm）、康維皿或平底短玻管、圓形濾紙（直徑11cm）、濾紙條（）。

（三）試劑：95%乙醇、石英砂、碳酸鈣粉、推動劑：按石油酸：丙酮:

苯（10:2:1）比例配制（V/V）o

三、實驗步驟

1、葉綠體色素的提取

（1）取新鮮菠菜葉片4-5片（2g左右），洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放入

研缽中。

（2）研缽中加2-3ml95%乙醇，加入少許石英砂、碳酸鈣粉末，研磨至糊

狀，再加10T5ml95%乙醇，提取35min,上清液過濾于三角瓶中，殘渣用10ml

95%乙醇沖洗，一同濾于三角瓶中。

（3）如無新鮮葉片，也可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片（以菠菜

葉最好），先用105c殺青，再在80C下烘干，研成粉末，密閉貯存。用時稱葉

粉2g放入小燒杯中，加95%乙醇20-30口1浸提，并隨時攪動。待乙醇呈深綠色

時，濾出浸提液備用。

2、葉綠體色素的分離

（1）取圓形定性濾紙一張（直徑11cm）,在其中心戳一圓形小孔（直徑約2

（2）將紙捻帶有色素的一端插入圓形濾紙的小孔中，使與濾紙剛剛平齊（勿

突出）。

（3）在培養皿內放一康維皿，在康維皿中央小室中加入適量的推動劑，