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王海玲

2012.10.24轉基因技術原理與方法簡介轉基因研究技術的中心環節即為DNA重組技術，其最終目的是將DNA片段轉入為一個生物體，從而使該生物體具有表現某種性狀。轉基因通過獲取基因、重組基因和表達基因等過程來實現。轉基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實現對生物體的改造。轉基因技術原理與方法轉基因的方法和原理目的基因制備和載體系統幾種有效的轉基因方法轉基因生物的篩選與鑒定轉基因技術原理與方法基本步驟1.分離獲得目的基因；2.在體外進行DNA重組，將外源DNA連接到能自我復制又帶有選擇標記的載體上；3.將重組DNA轉移入受體細胞；4.篩選出含有目的DNA的受體細胞克??；轉基因技術原理與方法1、目的基因制備和載體系統目的基因來源：基因組DNA分離、化學合成、PCR擴增、cDNA文庫及DNA文庫中制得。載體：質粒、λ噬菌體、柯氏質粒、YAC載體等工具酶：限制性內切酶、連接酶、DNA聚合酶等轉基因技術原理與方法1.目的基因的分離（1）已知基因的獲得①化學合成法②PCR擴增（2）未知基因的獲得①構建基因組文庫，篩選目的基因②構建cDNA文庫，篩選目的基因③mRNA差異顯示技術篩選差異表達基因④差異蛋白質譜表達技術篩選功能基因……轉基因技術原理與方法

2.良好載體需要滿足的條件

1、必須有自身的復制子；2、載體分子上必須有限制性核酸內切酶的酶切位點，即多克隆位點，以供外源DNA的插入；3、載體應具有可供選擇的遺傳標志，以區別陽性重組子和陰性重組子；4、載體分子必須有足夠的容量；5、可通過特定的方法導入細胞；6、對于表達載體還應具備與宿主細胞相適應的啟動子、前導順序、增強子、加尾信號等DNA調控元件。轉基因技術原理與方法質粒載體質粒（plasmid）是能自我復制的雙鏈環狀DNA分子，它們在細菌中以獨立于染色體外的方式存在。每個質粒都有一段DNA復制起始位點的序列，它能幫助質粒DNA在宿主細胞中復制。高拷貝數的質粒，在宿主細胞中能達10～100個拷貝；低拷貝數的質粒，在宿主細胞中只有1－4個拷貝。質粒要成為克隆載體，就必須進行遺傳改造，使之成為一個具有單一的限制性內切酶識別位點、多個選擇性標記。轉基因技術原理與方法質粒載體pBR3221.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素和抗四環素這樣兩個抗生素抗性基因2.在四環素抗性基因內部，還具有BamHI、HindⅢ和SalI三個識別位點。3.PstI識別位點在氨芐青霉素抗性基因4.pBR322帶有一個復制起點，可以保證質粒只在大腸桿菌里進行復制功能。轉基因技術原理與方法pUC19質粒長2686bp，帶有pBR322的復制起始位點，一個氨芐青霉素抗性基因和一個大腸桿菌乳糖操縱子β－半乳糖苷酶基因（lacZ’）的調節片段，一個調節lacZ’基因表達的阻礙蛋白的基因lacI，還有多個單克隆位點。pUC19的篩選將轉化細胞涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和X－gal的固體培養基上，那些帶有自身環化質粒的細胞由于能夠形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是藍色，如果插入有目的DNA片段，無法形成雜合β－半乳糖苷酶，菌落時白色的。轉基因技術原理與方法λ噬菌體λ噬菌體染色體是長約49kb的雙鏈DNA，該DNA的兩個5’末端都是由12個bp組成的單鏈互補粘性末端，當λ噬菌體DNA進入宿主細胞后，這兩個粘性末端互相結合，在連接酶作用下封閉成環在λ噬菌體基因組中位于左邊的基因（A-J）編碼噬菌體頭部和尾部的蛋白質，中間的基因（J-N）與重組和生長過程有關，但與裂解生長過程無關，因此對裂解生長過程來說，中間區的DNA是非必需的，可以被缺失或置換，因此可以在這個區域克隆外源DNA，右邊的基因涉及λ基因的表達、調節、DNA合成晚期功能調節以及宿主細胞裂解等。轉基因技術原理與方法λ噬菌體載體分類：插入型載體和置換型載體。插入型載體：具有單一的酶切位點，可供外源DNA的插入。置換型載體：有成對的酶切位點，在兩個酶切位點之間的DNA片段，可被外源DNA片段置換。λ噬菌體載體可以克隆較大DNA片段，最大長度約為24kb，只需將λ噬菌體DNA、尾巴和純化的空的頭，混在一起就可以在體外產生具有侵染性的噬菌體顆粒。轉基因技術原理與方法柯氏質粒Cosmid柯氏質?？煽寺y帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復制保存，綜合了質粒載體和噬菌體載體二者的優點。柯氏質粒上帶有多個單克隆位（RE2），兩個cos位點，DNA復制起始位點和抗生素抗性基因，在兩個cos位點之間還有一個限制性內切酶位點（RE1）。轉基因技術原理與方法2、遺傳轉化的方法1、應用于植物轉基因技術的方法2、應用于動物轉基因技術的方法轉基因技術原理與方法

植物遺傳轉化的方法（1）間接轉化法——農桿菌介導轉化法

（2）直接轉化法

A、基因槍轉化法

B、電擊法

C、花粉管通道法

D、PEG介導基因轉化法轉基因技術原理與方法農桿菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti質粒

Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),

可以轉移進入植物基因組.TumorinducedbyA.tumefaciens轉基因技術原理與方法根癌農桿菌

(Agrobacteriumtumefaciens),是一種革蘭氏陰性土壤桿菌,它含有Ti質粒,能誘導被侵染的植物細胞形成腫瘤,即誘發冠癭瘤.Ti質粒(包括Ri質粒)上有一段轉移DNA,在農桿菌侵染宿主植物時,這段DNA可以轉移進植物細胞,并穩定地保留在植物細胞染色體中,變為植物細胞新增加的一群基因,最終能通過有性世代遺傳給子代。轉基因技術原理與方法TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知農桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工、剪切、復制，然后轉入植物細胞。auxin轉基因技術原理與方法農桿菌與植物細胞相互作用的機制

返回轉基因技術原理與方法基因槍轉化法由美國Cornell大學的Sanfor(1987)提出,它的主要原理是將包含目的基因的載體包被在微小的金屬微粒(鎢?；蚪鹆?表面,通過高壓驅動力加速微粒穿透植物細胞壁,導入受體組織細胞內,然后通過組織培養再生出完整的植株.微粒上的外源DNA進入細胞后,整合到染色體上并得到表達,從而實現基因的轉化.。返回轉基因技術原理與方法電擊法的主要原理是將原生質體在溶液中與DNA混合,然后利用高壓電脈沖作用,使原生質體膜的某些部位被擊穿而產生可回復的小孔,外源DNA可通過小孔進入原生質體內,而且不影響經電擊處理的原生質體再生植物的能力.返回轉基因技術原理與方法花粉管通道法是利用開花植物授粉后形成的花粉管通道,直接將外源目的基因導入尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞,實現目的基因轉化.返回轉基因技術原理與方法PEG介導基因轉化的主要原理是聚乙二醇(PEG)、多聚-L-鳥核苷酸(pLO)、磷酸鈣及高pH值條件下誘導原生質體攝取外源DNA分子.PEG可促使細胞膜與DNA間接觸與粘連,并通過引起膜表面電荷的紊亂及干擾細胞間的識別,利于細胞膜間的融合以及外源DNA進入原生質體.返回轉基因技術原理與方法

動物外源基因的導入方法

1）顯微注射法（microinjection）

轉基因技術原理與方法2）逆轉錄病毒介導法轉基因技術原理與方法3）胚胎干細胞法轉基因技術原理與方法4）精子載體法意大利Lavitrano等1989年首次報道利用精子作為載體獲得了轉基因小鼠。轉基因技術原理與方法5）細胞核移植法277次乳腺細胞核移植實驗；獲得29個發育為8細胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。轉基因技術原理與方法6）生殖細胞轉染法轉基因技術原理與方法基因轉移的方法1.細胞融合<10－62.微細胞介導的基因轉移≤10－63.染色體介導的基因轉移<10－6

4.脂質體介導的基因轉移≈2×10－4

5.磷酸鈣沉淀物介導的基因轉移10－3－10－7

6.顯微注射DNA≈1－10％7.電脈沖介導的基因轉移10～30％8.激光，超聲波介導的基因轉移10～50％9.重組RNA病毒感染≈10～100％10.重組DNA病毒感染≈100％轉基因技術原理與方法3、轉基因苗的篩選與鑒定培養過程中利用標記基因篩選標記基因選擇標記基因(Slectivegene)報告基因(Reportgene)抗生素類選擇基因抗除草劑類選擇基因生物安全性標記類選擇基因……β-D-葡萄糖酸苷酶基因(Gus)熒光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰轉移酶基因(Cat)綠色熒光蛋白基因(Gfp)……轉基因技術原理與方法例Gus檢測原理：β－Ｄ－葡萄糖酸苷酶基因（Gus），催化β－葡萄糖苷酯類物質水解。其中很多水解產物具有發色團或形成熒光物質。例：組織化學法測定Gus活性作用底物為X-gluc,產物是一種不可溶的5,5-二溴，4,4-二氯靛藍；轉基因技術原理與方法GFP（綠色熒光蛋白基因）;