課題一微生物的實驗室培養課題1微生物的實驗室培養專題2:微生物的培養與應用第2頁,共65頁，2024年2月25日，星期天微生物包括哪五類：病毒細菌放線菌真菌原生動物原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基礎知識第3頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（一）細菌細菌：單細胞不分枝的原核微生物。細菌細胞微小而透明，通常用適當染料染色后顯微鏡觀察圖1-1常見的三種細菌典型形態A.球菌

B.桿菌C.弧菌第4頁,共65頁，2024年2月25日，星期天細菌細胞由外向里依次有鞭毛、菌（纖）毛、莢膜、細胞壁、細胞膜、細胞質，細胞質中又有液泡、儲存性顆粒、核質等。細菌的構造圖1-3細菌的結構第5頁,共65頁，2024年2月25日，星期天細胞壁結構特點：堅韌且有彈性細胞壁有哪些功能？①固定細胞外形；

②保護細胞免受外力的損傷；

③阻攔大分子物質進人細胞；④使細胞具有致病性及對噬菌體的敏感性。傷寒桿菌細胞壁中含毒素第6頁,共65頁，2024年2月25日，星期天芽孢有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡。芽孢又小又輕，可以隨風飄散。當環境適宜（如溫度、水分適宜）的時候，芽孢又可以萌發，形成一個細菌.第7頁,共65頁，2024年2月25日，星期天菌落：單個或少數細菌在固體培養基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態結構的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據。第8頁,共65頁，2024年2月25日，星期天菌落細菌的菌落特征因種而異第9頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（二）放線菌1、結構：單細胞原核分支狀的菌絲（基內菌絲、氣生菌絲）第10頁,共65頁，2024年2月25日，星期天鏈霉素、土霉素、四環素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素

微生物中發現了幾千種抗生素，其中2/3是由放線菌產生的

應用:第11頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（三）病毒1病毒的結構第12頁,共65頁，2024年2月25日，星期天病毒

第13頁,共65頁，2024年2月25日，星期天SARS病毒、禽流感病毒第14頁,共65頁，2024年2月25日，星期天朊病毒（蛋白質病毒）第15頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2、病毒的增殖：第16頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（四）真菌第17頁,共65頁，2024年2月25日，星期天如圖是酵母菌電子顯微鏡下的形態結構酵母菌和霉菌青霉第18頁,共65頁，2024年2月25日，星期天生殖直立菌絲營養菌絲腐生生活孢子生殖第19頁,共65頁，2024年2月25日，星期天一、基礎知識：（一）培養基

培養基（培養液）是由人工方法配制而成的，專供微生物生長繁殖使用的混合營養液。（1）按物理狀態來分：培養基可分為固體培養基、液體培養基和半固體培養基。其中固體培養基用于菌種分離、鑒定等。（2）按功能來分，可分為選擇培養基和鑒別培養基。（3）按成分來分，可分為天然培養基和合成培養基。1.培養基的類型和用途第20頁,共65頁，2024年2月25日，星期天培養基的種類液體培養基半固體培養基固體培養基據物理性質分天然培養基合成培養基據化學成分分選擇培養基鑒別培養基據用途分常用于工業生產常用于觀察微生物的運動、鑒定菌種用于微生物的分離、計數常用于工業生產常用于分類、鑒定在培養基中加入某種化學物質，以抑制不需要的微生物的生長，促進所需要的微生物的生長。例如，在培養基中加入青霉素，以抑制細菌、放線菌的生長，從而分離到酵母菌和霉菌。又如，在培養基中加入高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長。根據微生物的代謝特點，在培養基中加入某種指示劑或化學藥品配制而成，用以鑒別不同種類的微生物。例如，在培養基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌等細菌：如果有大腸桿菌，其代謝產物就與伊紅和美藍結合，使菌落呈深紫色，并帶有金屬光澤。第21頁,共65頁，2024年2月25日，星期天標準培養基類型配制特點主要應用物理性質固體培養基加入瓊脂較多菌種分離,鑒定,計數半固體培養基加入瓊脂較少菌種保存液體培養基不加入瓊脂工業生產，連續培養化學組成合成培養基由已知成分配制而成，培養基成分明確菌種分類、鑒定天然培養基由天然成分配制而成，培養基成分不明確工業生，產降低成本目的用途鑒別培養基添加某種指示劑或化學藥劑菌種的鑒別選擇培養基添加（或缺少）某種化學成分菌種的分離第22頁,共65頁，2024年2月25日，星期天固體培養基：菌落第23頁,共65頁，2024年2月25日，星期天液體培養基：表面生長均勻混濁生長沉淀生長第24頁,共65頁，2024年2月25日，星期天半固體培養基：無動力有動力(彌散)(是否運動)

第25頁,共65頁，2024年2月25日，星期天選擇培養基加入青霉素的培養基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無氮培養基:

分離固氮菌不加含碳有機物的無碳培養基:

分離自養型微生物第26頁,共65頁，2024年2月25日，星期天大腸桿菌呈黑色中心,有金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍培養基上典型特征

鑒定培養基：鑒定所培養生物的類型第27頁,共65頁，2024年2月25日，星期天2、培養基配制原則：

（1）目的要明確：根據微生物的種類、培養目的等確定配制培養基的種類，因為不同的微生物對培養物質的需求不同。（2）營養要協調：注意各種營養物質的濃度和比例。（3）pH要適宜：各種微生物適宜生長的pH范圍不同。細菌pH為：6.5-7.5；放線菌pH為：7.5-8.5；真菌pH為：5.0-6.0。第28頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3、培養基的營養構成

不管哪種培養基，一般都含有水、碳源、和氮源、無機鹽等營養物質，另外還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質,例如:生長因子(即細菌生長必需，而自身不能合成的化合物,如維生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧氣、二氧化碳、滲透壓等的要求。

第29頁,共65頁，2024年2月25日，星期天碳源、氮源、生長因子的比較來源常用原料功能碳源CO2、NaHCO3、糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等糖類構成細胞物質和一些代謝產物，有些還是異養做生物的主要能源物質氮源N2、NH3、銨鹽、硝酸鹽、尿素、牛肉膏和蛋白胨等銨鹽、硝酸鹽等合成蛋白質、核酸以及含氮的代謝產物生長因子維生素、氨基酸、堿基酶、核酸等的組成成分第30頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（二）無菌技術1.無菌技術的概念

無菌操作泛指在培養微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。成功地培養微生物的關鍵。無菌技術包括：

（1）對實驗操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒；

（2）將培養器皿、接種用具和培養基等器具進行滅菌；

（3）為避免周圍微生物污染，實驗操作應在酒精燈火焰附近旁進行；

（4）避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品相接觸。

第31頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（１）消毒定義：

指使用較為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）2.消毒與滅菌的概念及兩者的區別

使用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而達到完全無菌之過程。

滅菌消毒技術是微生物有關工作中最普通也是最重要的技術。（2）滅菌的定義：第32頁,共65頁，2024年2月25日，星期天比較項理化因素的作用強度消滅微生物的數量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態的微生物不能滅菌強烈全部微生物能消毒與滅菌的比較第33頁,共65頁，2024年2月25日，星期天1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化學藥劑消毒法:用75%酒精、新潔爾滅等進行皮膚消毒;氯氣消毒水源4、紫外線消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒與滅菌的方法第34頁,共65頁，2024年2月25日，星期天1、灼燒滅菌接種環、接種針、試管口2、干熱滅菌：160-170℃下加熱1-2h。3、高壓蒸氣滅菌：100kPa、121℃下維持15-30min.(2)滅菌的方法：第35頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，包括最耐熱的某些微生物的休眠體，同時可以基本保持培養基的營養成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為了防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各種金屬、塑料及硅膠帽，它們只可讓空氣通過，而空氣中的其他微生物不能通過。培養微生物的培養皿是由正反兩平面板互扣而成，這種器具是專為防止空氣中微生物的污染而設計的。

第36頁,共65頁，2024年2月25日，星期天1.無菌技術除了用來防止實驗室的培養物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？2.請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。（1）培養細菌用的培養基與培養皿（2）玻棒、試管、燒瓶和吸管（3）實驗操作者的雙手答：無菌技術還能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要滅菌；（3）需要消毒。旁欄思考第37頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3.微生物實驗室培養的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養基的配制3、培養基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養7、菌種的保存第38頁,共65頁，2024年2月25日，星期天三、實驗操作（一.）制備牛肉膏蛋白胨培養基（用于培養細菌）第39頁,共65頁，2024年2月25日，星期天1．計算、稱量2．溶化3．調pH：pH7．6

4．過濾：這一步可以省去。5．分裝：分裝過程中注意不要使培養基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。6．加塞7．包扎操作步驟第40頁,共65頁，2024年2月25日，星期天8．滅菌:將50ml培養基用玻棒轉移至三角錐瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮紙，再放入高壓蒸氣滅菌鍋，在壓力為100kPa、溫度為121℃，滅菌15～30min。將培養皿用舊報紙包裹，放入干熱滅菌箱內，在160～170℃下滅菌2h。9．倒平板:待培養基冷卻到50℃左右時，在酒精燈附近倒平板。（倒平板操作見課本）2d后觀察平板，無雜菌污染才可用來接種.10．無菌檢查：將滅菌的培養基放入37℃的溫室中培養24—48小時，以檢查滅菌是否徹底。第41頁,共65頁，2024年2月25日，星期天倒平板技術第42頁,共65頁，2024年2月25日，星期天1.培養基滅菌后，需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養基的溫度？問題討論答：可以用手觸摸盛有培養基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答：通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基。第43頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？答：平板冷凝后，皿蓋上會凝結水珠，凝固后的培養基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養基表面的水分更好地揮發，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染。答：空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生，因此最好不要用這個平板培養微生物。第44頁,共65頁，2024年2月25日，星期天（二）、純化大腸桿菌接種方法有：平板劃線法和稀釋涂布平板法

平板劃線法:通過接種環在瓊脂固體培養基表面連續畫線的操作,將聚集的菌鐘逐步稀釋分散到培養基的表面.

在數次畫線后,可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體,這就是菌落.微生物的接種技術第45頁,共65頁，2024年2月25日，星期天菌落：單個或少數細菌在固體培養基上大量繁殖時，就會形成一個肉眼可見的，具有一定形態結構的子細胞群體，叫做菌落。菌落是鑒定菌種的重要依據。第46頁,共65頁，2024年2月25日，星期天菌落細菌的菌落特征因種而異第47頁,共65頁，2024年2月25日，星期天霉菌的菌落特征因種而異菌落第48頁,共65頁，2024年2月25日，星期天接種環接種針第49頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共65頁，2024年2月25日，星期天問題討論

1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環？在劃線操作結束時，仍然需要灼燒接種環嗎？為什么？

答：操作的第一步灼燒接種環是為了避免接種環上可能存在的微生物污染培養物；每次劃線前灼燒接種環是為了殺死上次劃線結束后，接種環上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數的增加，使每次劃線時菌種的數目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結束后灼燒接種環，能及時殺死接種環上殘留的菌種，避免細菌污染環境和感染操作者。第51頁,共65頁，2024年2月25日，星期天

2.在灼燒接種環之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答：以免接種環溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

答：劃線后，線條末端細菌的數目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數目隨著劃線次數的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。第52頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第53頁,共65頁，2024年2月25日，星期天涂布器第54頁,共65頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共65頁，2024年2月25日，星期天問題討論

涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？

應從操作的各個細節保證“無菌”。例如，酒精燈與培養皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。第56頁,共65頁，2024年2月25日，星期天微生物的恒溫培養微生物的恒溫培養第57頁,共65頁，2024年2月25日，星期天四、課題成果評價

（一）培養基的制作是否合格如果未接種的培養基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養基的制備是成功的，否則需要重新制備。（二）接種操作是否符合無菌要求如果培養基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合大腸桿菌菌落的特點，

(在肉湯培養基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊)則說明接種操作是符合要求的；如果培養基上出現了其他菌落，(在某培養基上出現了3種特征不同的菌落，原因有培養基滅菌不徹底或雜菌感染等。)則說明接種過程中，無菌操作還未達到要求，需要分析原因，再次練習。（三）是否進行了及時細致的觀察與記錄培養12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同，及時觀察記錄的同學會發現這一點，并能觀察到其他一些細微的變化。這一步的要求主要是培養學生良好的科學態度與習慣。第58頁,共65頁，2024年2月25日，星期天微生物的恒溫培養第59頁,共65頁，2024年2月25日，星期天3．1培養未接種培養基的作用是對照，若有菌落形成，說明培養基滅菌不徹底。3．2在肉湯培養基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊。3．3培養12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是時間越長，菌落中細菌繁殖越多，菌落體積越大；菌落的位置不動，但菌落數增多。3．4在某培養基上出現了3種特征不同的菌落，原因有培養基滅菌不徹底或雜菌感染等。結果分析與評價課題延伸（P20）第60頁,共65頁，2024年2月25日，星期天菌種的保存1、臨時保藏法對象：溫度：缺點：2、甘油管藏法：對象：溫度：頻繁使用的菌種4℃（冰箱）容易被污染或產生變異長期保存的菌種-20℃（冷凍箱）第61頁,共65頁，2024年2月25日，星期天本課題知識小結:第62頁,共65頁，2024年2月25日，星期天【典例解析】例1．關微生物營養物質的敘述中，正確的是A.是碳源的物質不可能同時是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無機物只提供無機鹽D.