ICS65.150

B51

DB32

江蘇地方標準

DB32/T3771—2020

漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測定

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

DeterminationofquinolonesinaquaculturewaterbyLC-MS/MS

2020-04-08發(fā)布2020-05-15實施

江蘇省市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB32/T3771—2020

漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本標準規(guī)定了漁業(yè)養(yǎng)殖用水中16種喹諾酮類抗生素殘留量的前處理和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方

法。

本標準適用于漁業(yè)養(yǎng)殖用水中恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、

依諾沙星、洛美沙星、萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、丹諾沙星、雙氟沙星、奧比沙星、司帕沙星、氟羅沙

星16種抗生素殘留量的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

3原理

水樣用混合纖維素濾膜過濾后，喹諾酮類抗生素經(jīng)固相萃取柱富集、洗脫和凈化后，供液相色譜-

串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。

4試劑和材料

4.1甲醇（CH3OH）。

4.2乙腈（CH3CN）。

4.3甲酸（HCOOH）。

4.4乙酸銨（CH3COONH4）。

4.5氨水（NH3·H2O）：優(yōu)級純。

4.65mmol/L乙酸銨緩沖液：稱取0.1925g乙酸銨（4.4），溶于500mL水中。用甲酸（4.3）調(diào)節(jié)

pH為3±0.05。

4.75%氨水甲醇溶液：量取5mL氨水（4.5），用甲醇稀釋并定容至100mL。

4.80.1%甲酸水溶液：量取1mL甲酸（4.3），用水稀釋至1000mL。

4.90.1%甲酸水-乙腈：（9+1，體積比），量取90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和10mL乙腈（4.2）混

合。

4.10標準物質(zhì)：恩諾沙星（Enrofloxacin）、諾氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、環(huán)

丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依諾沙星（Enoxacin）、

洛美沙星（Lomefloxacin）、萘啶酸（Nalidixicacid）、惡喹酸（Oxolinicacid）、氟甲喹（Flumequine）、

丹諾沙星（Danafloxacin）、雙氟沙星（Difloxacin）、奧比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、

氟羅沙星（Fleroxacin），純度≥97.0%。

1

DB32/TXXXX—2020

4.11內(nèi)標物質(zhì)：氘代諾氟沙星，氘代環(huán)丙沙星、氘代恩諾沙星，純度≥97.0%。

4.12喹諾酮類標準儲備溶液：分別稱取適量喹諾酮類標準品（4.10），用甲醇(4.1)溶解并定容至10mL，

使各種喹諾酮的濃度均為1.0mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6個月。

4.13內(nèi)標標準儲備溶液：分別稱取適量內(nèi)標標準品（4.11），用甲醇(4.1)溶解并定容至10mL，使各

種內(nèi)標濃度均為1.0mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6個月。

4.14混合標準中間溶液：分別量取適量標準儲備溶液(4.12)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋配制

成濃度為1μg/mL的混合標準中間溶液。-18℃以下避光保存，有效期3個月。

4.15混合標準工作溶液：根據(jù)需要用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）由混合標準中間液（4.14）稀釋成合適

的混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.16混合內(nèi)標標準工作溶液：分別量取適量標準儲備溶液(4.13)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋

配制成濃度為1μg/mL的混合內(nèi)標標準工作溶液。-18℃以下避光保存，有效期3個月。

注：除另有說明外，以下所用的試劑均為色譜純，試驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

5儀器和設(shè)備

5.1液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)。

5.2天平：感量0.01g。

5.3分析天平：感量0.00001g。

5.4渦旋混合器。

5.5氮吹儀。

5.6pH計：測量精度±0.05。

5.7刻度玻璃離心管：10mL。

5.8混合纖維素濾膜：0.45μm。

5.9水系濾膜：0.22μm。

5.10固相萃取柱：HLB固相萃取柱：500mg，6mL，或性能相當者。

5.11固相萃取裝置。

6樣品制備與保存

采集的漁業(yè)養(yǎng)殖水樣經(jīng)0.45μm混合纖維素濾膜過濾。如水樣較渾濁，可更換濾膜或過濾2次。過濾

后的水樣于4℃密封保存，24h內(nèi)進行檢測。

——取過濾后的供試樣品，作為供試試料。

——取過濾后的空白樣品，作為空白試料。

——取過濾后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。

7測定步驟

7.1提取和凈化

依次用6mL甲醇，6mL超純水，6mL5mmol/L乙酸銨緩沖液（4.6）活化小柱（5.10）。量取200mL

過濾后的試樣，加入適量甲酸調(diào)節(jié)水樣pH為3.0±0.05，準確加入1μg/mL混合內(nèi)標標準工作液50μL

（4.16）。然后以約3~5mL/min流速通過固相萃取柱（5.10）。過柱后用6mL超純水淋洗，再將小柱于

氮氣保護下干燥20min，最后用6mL5%氨水甲醇溶液（4.7）分兩次進行洗脫。洗脫液于40℃水浴用氮

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DB32/T3771—2020

氣吹至近干，用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）定容至1mL，渦旋混勻1min，過0.22μm水系濾膜，供液相色

譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

7.2標準曲線的制備

精確量取適量混合標準中間溶液(4.14)和適量1μg/mL混合內(nèi)標標準工作液（4.16），用0.1%甲酸

水-乙腈（4.9）配制成同位素內(nèi)標濃度為50ng/mL以及16種喹諾酮濃度為1、5、10、20、50、100和

200ng/mL系列標準溶液。以被測組分和相應(yīng)內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲

線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

7.3測定

7.3.1色譜參考條件

液相色譜參考條件如下：

a)色譜柱：EC-C18柱，(2.1mmx100mm，2.7μm)，或性能相當者。

b)流速：0.40mL/min。

c)柱溫：30℃。

d)進樣量：10μL。

e)A為0.1%甲酸水溶液(4.8)，B為乙腈(4.2)；梯度洗脫程序見表1。

表1流動相梯度洗脫程序

時間/minA相/%B相/%

0.00955

2.008515

10.004555

12.001090

13.00955

15.00955

7.3.2質(zhì)譜參考條件

質(zhì)譜參考條件如下：

a)離子化模式：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；

b)噴霧電壓：5500v；

c)氣簾氣流量：2L/min；

d)霧化氣流量：8L/min；

e)輔助加熱氣流量：8L/min；

f)離子源溫度：500℃；

g)掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，掃描參數(shù)見附錄A；

7.3.3定性測定

在同樣測試條件下，試樣溶液中各抗生素的保留時間與標準物質(zhì)保留時間相對偏差在±2.5%以內(nèi)，

且檢測到的定性離子的相對豐度，應(yīng)與濃度相當?shù)臉藴嗜芤褐卸ㄐ噪x子的相對豐度一致。基峰與次強

碎片離子豐度比應(yīng)符合表2要求。各抗生素的保留時間參考附錄B。

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DB32/TXXXX—2020

表2基峰與次強碎片離子豐度比要求

次強碎片離子相對豐度%＞50＞20～50＞10～20≤10

允許相對偏差%±20±25±30±50

7.3.4定量測定

將標準工作液和試樣溶液等體積進樣測定，按內(nèi)標法進行定量分析，在樣品中加入回收率指示物，

以此來保證整個樣品前處理過程的回收率。諾氟沙星、依諾沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標，環(huán)丙沙星、

洛美沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標，恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、

雙氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟羅沙星、奧比沙星以氘代恩諾沙星為內(nèi)標。

7.3.5空白試驗

除不加試樣外，均按上述測定條件和步驟進行。

8結(jié)果計算

試樣中喹諾酮類抗生素含量按公式(1)計算，計算結(jié)果需扣除空白值，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

ciV

Xi=

m………（1）

式中：

Xi—試樣中喹諾酮類抗生素含量，單位為納克每升(ng/L)；

ci—試樣溶液中喹諾酮類抗生素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；

V1—試樣溶液最終體積，單位為毫升(mL)；

m—試樣體積，單位為升(L)。

9方法靈敏度、準確度和精密度

9.1靈敏度

本方法的定量限為10ng/L。

9.2準確度

本方法回收率范圍為70%～120%。

9.3精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)≤15%，批間變異系數(shù)≤15%。

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附錄A

（資料性附錄）

掃描參數(shù)

表A.116種喹諾酮類抗生素及內(nèi)標物的母離子、子離子和碰撞能量

序號化合物母離子/(m/z)子離子/(m/z)碰撞能量/V

24538

1恩諾沙星360

316*26

23335

2諾氟沙星320

276*26

29027

3培氟沙星334

316*30

24532

4環(huán)丙沙星332

288*26

26126

5氧氟沙星362

318*38

29936

6沙拉沙星386

342*26

23244

7依諾沙星321

303*30

26533

8洛美沙星352

308*28

215.228

9萘啶酸233.3

187.4*44

21639

10惡喹酸262

244*26

20225

11氟甲喹262

244*40

28330

12丹諾沙星358

340*24

29938

13雙氟沙星400

356*30

29535

14奧比沙星396

352*26

29235

15司帕沙星393

349*27

26937

16氟羅沙星370

326*27

17氘代諾氟沙星32530730

18氘代環(huán)丙沙星34032228

19氘代恩諾沙星36532129

注：*為定量離子

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DB32/TXXXX—2020

附錄B

（資料性附錄）

標準溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜色譜圖和參考保留時間

XICof+MRM(35pairs):370.000/326.000DaID:FLE1fromSample2(STD20ng/mL)of20180523.wiff(TurboSpray)Max.6.7e5cps.

1.29e6

1.20e6

1.10e6

1.00e6

9.00e5

8.00e5

7.00e53.76

6.00e5

Intensity,cpsIntensity,

5.00e5

4.00e5

3.00e5

2.00e5

1.00e5

0.00

024681012141618202224

Time,min

圖B.116種喹諾酮標準工作溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜XIC色譜圖

圖B.216種喹諾酮標準工作溶液液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜TIC色譜圖

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DB32/T3771—2020

表B.116種喹諾酮標準工作溶液參考保留時間

化合物名稱保留時間/min化合物名稱保留時間/min

依諾沙星3.51恩諾沙星4.14

諾氟沙星3.71奧比沙星4.25

氧氟沙星3.72沙拉沙星4.75

氟羅沙星3.76司帕沙星4.77

培氟沙星3.78雙氟沙星4.84

環(huán)丙沙星3.82惡喹酸5.85

丹諾沙星3.93萘啶酸7.40

洛美沙星3.96氟甲喹7.99

_________________________________

7

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前言

本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標準由江蘇省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。

本標準由江蘇省漁業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。

本標準起草單位：江蘇省淡水水產(chǎn)研究所、江蘇省水產(chǎn)質(zhì)量檢測中心。

本標準主要起草人：孟勇、沈美芳、朱曉華、楊洪生、王靜、張美琴、譚秀慧、劉崇萬、王凱、朱

凜。

I

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漁業(yè)養(yǎng)殖用水中喹諾酮類抗生素測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

1范圍

本標準規(guī)定了漁業(yè)養(yǎng)殖用水中16種喹諾酮類抗生素殘留量的前處理和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方

法。

本標準適用于漁業(yè)養(yǎng)殖用水中恩諾沙星、諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、

依諾沙星、洛美沙星、萘啶酸、惡喹酸、氟甲喹、丹諾沙星、雙氟沙星、奧比沙星、司帕沙星、氟羅沙

星16種抗生素殘留量的測定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其有效版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。

3原理

水樣用混合纖維素濾膜過濾后，喹諾酮類抗生素經(jīng)固相萃取柱富集、洗脫和凈化后，供液相色譜-

串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，內(nèi)標法定量。

4試劑和材料

4.1甲醇（CH3OH）。

4.2乙腈（CH3CN）。

4.3甲酸（HCOOH）。

4.4乙酸銨（CH3COONH4）。

4.5氨水（NH3·H2O）：優(yōu)級純。

4.65mmol/L乙酸銨緩沖液：稱取0.1925g乙酸銨（4.4），溶于500mL水中。用甲酸（4.3）調(diào)節(jié)

pH為3±0.05。

4.75%氨水甲醇溶液：量取5mL氨水（4.5），用甲醇稀釋并定容至100mL。

4.80.1%甲酸水溶液：量取1mL甲酸（4.3），用水稀釋至1000mL。

4.90.1%甲酸水-乙腈：（9+1，體積比），量取90mL0.1%甲酸水溶液（4.8）和10mL乙腈（4.2）混

合。

4.10標準物質(zhì)：恩諾沙星（Enrofloxacin）、諾氟沙星（Norfloxacin）、培氟沙星（Pefloxacin）、環(huán)

丙沙星（Ciprofloxacin）、氧氟沙星（Ofloxacin）、沙拉沙星（Sarafloxacin）、依諾沙星（Enoxacin）、

洛美沙星（Lomefloxacin）、萘啶酸（Nalidixicacid）、惡喹酸（Oxolinicacid）、氟甲喹（Flumequine）、

丹諾沙星（Danafloxacin）、雙氟沙星（Difloxacin）、奧比沙星（Orbifloxacin）、司帕沙星（Sparfloxacin）、

氟羅沙星（Fleroxacin），純度≥97.0%。

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4.11內(nèi)標物質(zhì)：氘代諾氟沙星，氘代環(huán)丙沙星、氘代恩諾沙星，純度≥97.0%。

4.12喹諾酮類標準儲備溶液：分別稱取適量喹諾酮類標準品（4.10），用甲醇(4.1)溶解并定容至10mL，

使各種喹諾酮的濃度均為1.0mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6個月。

4.13內(nèi)標標準儲備溶液：分別稱取適量內(nèi)標標準品（4.11），用甲醇(4.1)溶解并定容至10mL，使各

種內(nèi)標濃度均為1.0mg/mL。-18℃以下避光保存，有效期6個月。

4.14混合標準中間溶液：分別量取適量標準儲備溶液(4.12)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋配制

成濃度為1μg/mL的混合標準中間溶液。-18℃以下避光保存，有效期3個月。

4.15混合標準工作溶液：根據(jù)需要用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）由混合標準中間液（4.14）稀釋成合適

的混合標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

4.16混合內(nèi)標標準工作溶液：分別量取適量標準儲備溶液(4.13)于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋

配制成濃度為1μg/mL的混合內(nèi)標標準工作溶液。-18℃以下避光保存，有效期3個月。

注：除另有說明外，以下所用的試劑均為色譜純，試驗用水為GB/T6682規(guī)定的一級水。

5儀器和設(shè)備

5.1液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源(ESI)。

5.2天平：感量0.01g。

5.3分析天平：感量0.00001g。

5.4渦旋混合器。

5.5氮吹儀。

5.6pH計：測量精度±0.05。

5.7刻度玻璃離心管：10mL。

5.8混合纖維素濾膜：0.45μm。

5.9水系濾膜：0.22μm。

5.10固相萃取柱：HLB固相萃取柱：500mg，6mL，或性能相當者。

5.11固相萃取裝置。

6樣品制備與保存

采集的漁業(yè)養(yǎng)殖水樣經(jīng)0.45μm混合纖維素濾膜過濾。如水樣較渾濁，可更換濾膜或過濾2次。過濾

后的水樣于4℃密封保存，24h內(nèi)進行檢測。

——取過濾后的供試樣品，作為供試試料。

——取過濾后的空白樣品，作為空白試料。

——取過濾后的空白樣品，添加適宜濃度的標準工作液，作為空白添加試料。

7測定步驟

7.1提取和凈化

依次用6mL甲醇，6mL超純水，6mL5mmol/L乙酸銨緩沖液（4.6）活化小柱（5.10）。量取200mL

過濾后的試樣，加入適量甲酸調(diào)節(jié)水樣pH為3.0±0.05，準確加入1μg/mL混合內(nèi)標標準工作液50μL

（4.16）。然后以約3~5mL/min流速通過固相萃取柱（5.10）。過柱后用6mL超純水淋洗，再將小柱于

氮氣保護下干燥20min，最后用6mL5%氨水甲醇溶液（4.7）分兩次進行洗脫。洗脫液于40℃水浴用氮

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氣吹至近干，用0.1%甲酸水-乙腈（4.9）定容至1mL，渦旋混勻1min，過0.22μm水系濾膜，供液相色

譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

7.2標準曲線的制備

精確量取適量混合標準中間溶液(4.14)和適量1μg/mL混合內(nèi)標標準工作液（4.16），用0.1%甲酸

水-乙腈（4.9）配制成同位素內(nèi)標濃度為50ng/mL以及16種喹諾酮濃度為1、5、10、20、50、100和

200ng/mL系列標準溶液。以被測組分和相應(yīng)內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲

線，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

7.3測定

7.3.1色譜參考條件

液相色譜參考條件如下：

a)色譜柱：EC-C18柱，(2.1mmx100mm，2.7μm)，或性能相當者。

b)流速：0.40mL/min。

c)柱溫：30℃。

d)進樣量：10μL。

e)A為0.1%甲酸水溶液(4.8)，B為乙腈(4.2)；梯度洗脫程序見表1。

表1流動相梯度洗脫程序

時間/minA相/%B相/%

0.00955

2.008515

10.004555

12.001090

13.00955

15.00955

7.3.2質(zhì)譜參考條件

質(zhì)譜參考條件如下：

a)離子化模式：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；

b)噴霧電壓：5500v；

c)氣簾氣流量：2L/min；

d)霧化氣流量：8L/min；

e)輔助加熱氣流量：8L/min；

f)離子源溫度：500℃；

g)掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，掃描參數(shù)見附錄A；

7.3.3定性測定

在同樣測試條件下，試樣溶液中各抗生素的保留時間與標準物質(zhì)保留時間相對偏差在±2.5%以內(nèi)，

且檢測到的定性離子的相對豐度，應(yīng)與濃度相當?shù)臉藴嗜芤褐卸ㄐ噪x子的相對豐度一致。基峰與次強

碎片離子豐度比應(yīng)符合表2要求。各抗生素的保留時間參考附錄B。

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DB32/TXXXX—2020

表2基峰與次強碎片離子豐度比要求

次強碎片離子相對豐度%＞50＞20～50＞10～20≤10

允許相對偏差%±20±25±30±50

7.3.4定量測定

將標準工作液和試樣溶液等體積進樣測定，按內(nèi)標法進行定量分析，在樣品中加入回收率指示物，

以此來保證整個樣品前處理過程的回收率。諾氟沙星、依諾沙星以氘代諾氟沙星為內(nèi)標，環(huán)丙沙星、

洛美沙星以氘代環(huán)丙沙星為內(nèi)標，恩諾沙星、氧氟沙星、培氟沙星、丹諾沙星、沙拉沙星、司帕沙星、

雙氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、萘啶酸、氟羅沙星、奧比沙星以氘代恩諾沙星為內(nèi)標。

7.3.5空白試驗

除不加試樣外，均按上述測定條件和步驟進行。

8結(jié)果計算

試樣中喹諾酮類抗生素含量按公式(1)計算，計算結(jié)果需扣除空白值，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

ciV

Xi=

m………（1）

式中：

Xi—試樣中喹諾酮類抗生素含量，單位為納克每升(ng/L)；

ci—試樣溶液中喹諾酮類抗生素的濃度，單位為納克每毫升(ng/mL)；

V1—試樣溶液最終體積，單位為毫升(mL)；

m—試樣體積，單位為升(L)。

9方法靈敏度、準確度和精密度

9.1靈敏度

本方法的定量限為10ng/L。

9.2準確度

本方法回收率范圍為70%～120%。

9.3精密度

本方法的批內(nèi)變異系數(shù)≤15%，批間變異系數(shù)≤15%。

4

DB32/T3771—2020

附錄A

（資料性附錄）

掃描參數(shù)

表A.116種喹諾酮類抗生素及內(nèi)標物的母離子、子離子和碰撞能量

序號化合物母離子/(m/z)子離子/(m/z)碰撞能量/V

24538

1恩諾沙星360

316*26

23335

2諾氟沙星320

276*26

29027

3培氟沙星334

316*30

24532

4環(huán)丙沙星332

288*26

26126

5氧氟沙星362

318*38

29936

6沙拉沙