關于植物表觀遺傳調節模式

經典遺傳學認為，核酸是遺傳的分子基礎，生命的遺傳信息儲存在核酸的堿基序列。如人類基因組（genome）有20000多個基因，但在成人體內的200種左右細胞中每種細胞內都只有一部分特定基因會表達。通俗地說，每個個體內雖然所有細胞都含相同的遺傳信息，但由于基因表達模式不同，這些本來由同一個受精卵分裂而成的細胞經過分化后成了具有不同功能和形態的細胞，從而組成了不同的組織和器官。這種DNA序列不發生改變的情況下，基因表達發生可遺傳改變的現象，就被定義為表觀遺傳（epigenetic）現象。第2頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

在經典遺傳學創立幾十年后，Waddington于1942年提出表觀遺傳學的概念，并將其定義為研究生物發育機制的學科。最初，人們認為表觀遺傳只是一種表型，但隨著生命科學研究的發展，基因組學不能解釋的問題越來越多，表觀遺傳學在這樣的情況下不斷發展。20世紀70年代中期，人們對表觀遺傳的理解開始變化，Holliday對其進行了系統表述，即現在廣為接受的表觀遺傳學概念———研究非DNA序列變化所致的可遺傳的基因表達變化。在分子生物學空前發展的形勢下，表觀遺傳學也在分子水平上得到了更為系統的研究，人們不僅發現了多種表觀遺傳修飾方式，而且探究了其錯綜復雜的生物學作用。表觀遺傳學現已成為生命科學領域的研究熱點之一，形成了獨立的分支學科。第3頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

表觀遺傳現象就是由環境因素引起的生物細胞內遺傳物質變化的結果。在相當長一段時間內，表觀遺傳學的研究集中在甲基化（methylation）、小RNA（smallRNA）和染色質重塑（chromatinremodeling）等方面。此外，許多論文中描述了副突變（paramutation）、親代印記（parentalimprinting）、性別相關的基因劑量補償效應（genedosagecompensationeffect）和轉基因沉默（transgenesilencing）等典型的表觀遺傳現象。第4頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

表觀遺傳學的調節機制主要包括:

（1）DNA甲基化（DNAmethylation）；（2）組蛋白修飾（histonemodification）；（3）非編碼RNA（noncodingRNA，ncRNA）作用等。

這些調節模式易受環境影響，因此表觀遺傳學更加關注環境誘導的表觀遺傳變異。第5頁,共45頁，2024年2月25日，星期天1表觀遺傳調節模式1.1DNA甲基化及其生理生化效應

DNA高度甲基化首先會影響DNA結構，進而阻遏基因轉錄，引起基因沉默。真核細胞內甲基化狀態有3種：持續的低甲基化狀態（如持家基因的甲基化）、誘導的去甲基化狀態（如一些發育階段特異性基因的修飾）和高度甲基化狀態（X染色體的甲基化修飾）。

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DNA甲基化的具體反應過程是DNA甲基轉移酶（DNAMethyltransferase，DNMT）將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基轉移到DNA雙鏈中胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。催化該反應的DNA甲基轉移酶主要有4種：DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L。在DNA復制完成后，DNMT1是催化甲基轉移至新合成的DNA鏈上的甲基化位點反應中最主要的酶，這一現象稱為維持甲基化（maintenancemethylation）；而DNMT3A和DNMT3B則負責催化核酸鏈上新的甲基化位點發生反應，稱為形成甲基化（denovomethylation）。DNMT3L在DNA甲基轉移酶家族中屬于不具有甲基轉移酶活性的調節酶，其主要作用是調節其他甲基轉移酶的活性。第7頁,共45頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

DNA甲基化主要發生在胞嘧啶和鳥苷酸（CpG）二核酸中的胞嘧啶（C）上，基因組中的CpG約有60%~90%會發生甲基化。在DNA雙鏈中5‘-CpG-3’及其互補鏈中的3‘-GpC-5’中的C都會被甲基化，這些CpG是基因組中的維持甲基化位點。

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在結構基因的啟動子或轉錄起始位點有大量未甲基化的CpG（在大約200bp堿基對中CpG含量超過60%），這些CpG簇被稱為CpG島（CpGisland）。如果CpG島發生高甲基化，基因表達就會被完全抑制。DNA甲基化對基因表達影響的機制已經研究得較為透徹，甲基化會使DNA雙鏈在三維結構上發生變化，阻滯甲基化敏感的轉錄因子（TFs，包括E2F、CREB、AP2、cMyc/Myn、NF-kB、cMyb和ETS等）的DNA結合活性。與此同時，甲基化不敏感的methyl-CpG結合蛋白（如Sp1、CTF和YY1等）會結合在DNA上，這些蛋白是轉錄抑制因子，它們都含有保守的甲基化DNA結合結構域（methylatedDNAbindingdomain，MBD）。DNA甲基化影響基因表達的方式如圖所示，選擇性地結合于甲基化DNA的特異轉錄抑制子MeCP2（methyl-CpGbindingprotein2），即甲基化CpG結合蛋白，與組蛋白去乙?；福╤istonedeacetylase，HDAC）共存于一個復合物中。第10頁,共45頁，2024年2月25日，星期天第11頁,共45頁，2024年2月25日，星期天第12頁,共45頁，2024年2月25日，星期天第13頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

DNA甲基化在生物體內有多方面的重要生理意義。正常的甲基化對于維持細胞的生長及代謝等是必需的，具體的體現如維持染色質結構、基因印記、X染色體失活、細胞分化和胚胎發育等。第14頁,共45頁，2024年2月25日，星期天1.2組蛋白修飾及其生理生化效應

由于被修飾，一些蛋白失去活性，一些蛋白獲得活性，一些蛋白改變功能，因此蛋白修飾是功能蛋白質庫的“擴增”因素。組蛋白修飾（histonemodifications）是表觀遺傳修飾的一種重要方式，具有特殊的生理生化功能。第15頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

在細胞的生長狀態下，DNA以染色質形式存在于細胞核當中。染色質的基本單位是核小體（nucleosome），核小體由145~147對DNA堿基纏繞在組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2個單位組成的八聚體核心周圍而形成，每個核小體間由長度約為60bp的DNA連接，組蛋白H1就結合在這些接頭DNA（linkerDNA）上。也就是說，染色質由DNA結合組蛋白形成的核小體串組成，組蛋白是染色質的基本結構蛋白。組蛋白折疊基序（foldingdomain）常位于C-端，參與組蛋白分子間互作并與DNA纏繞有關。組蛋白的另一個重要結構域稱為組蛋白尾（histonetail），約占組全長的25%，常位于N-端（但在組蛋白H2A則處于C-端），可與DNA、調節蛋白、酶和其他染色質蛋白相互作用，大部分的組蛋白翻譯后修飾都發生在這個結構域的第15~38個氨基酸殘基上。另外，組蛋白尾在染色質組裝和凝聚成高度有序結構的過程中發揮重要作用，而染色質的凝集程度會直接影響DNA復制、重組和轉錄。第16頁,共45頁，2024年2月25日，星期天組蛋白結構第17頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

組蛋白表觀遺傳修飾方式有甲基化（methylation）、乙?；╝cetylation）、磷酸化（phosphorylation）、泛素化（ubiquitination）、SUMO化（sumoylation）、腺苷酸化（adenylation）、ADP-核糖基化（ADP-ribosylation）、生物素化（biotinylation）和脯氨酸異構化（prolineisomerization）等，這些修飾方式靈活地影響著染色質的結構與功能，既可以阻遏也可以促進基因的轉錄。參與組蛋白修飾的酶主要有組蛋白甲基轉移酶（histonemethyltransferase，HMT）、組蛋白乙酰轉移酶（histoneacetyltransferase，HAT）、組蛋白激酶（histonekinase）和組蛋白泛素化酶（histoneubiquitylase）等，這些酶是催化相應的基團結合到組蛋白氨基殘基上所必需的酶。同時相應地，也有組蛋白去甲基化酶（histonedemethylase，HDM）、組蛋白脫乙?；福╤istonedeacetylase，HDAC）、組蛋白磷酸酶（histonephosphatase）和組蛋白去泛素化酶（histonedeubiquitylase），這些酶可去除結合在組蛋白端氨基殘基上的分子基團。第18頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

組蛋白翻譯后修飾類型多，且相互之間息息相關，彼此影響，形成一個錯綜復雜但井然有序的網絡來影響基因的表達。組蛋白翻譯后修飾影響基因表達的途徑有3種：（1）改變其周圍的環境（如電荷量和pH值等），增強或減弱轉錄因子或轉錄輔因子與DNA間的作用；

（2）直接改變染色質結構和凝集狀態，進而影響蛋白間和蛋白與DNA間的相互作用；（3）作為信號影響下游蛋白，進而調控基因表達。例如組蛋白乙酰化，當乙?；Y合在組蛋白上時，就會中和后者的正電荷，這樣組蛋白末端就能以比較弱的作用力結合在帶負電荷的DNA鏈上，這種寬松的染色質結構便可以使特異轉錄因子等相關蛋白與DNA結合。第19頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

組蛋白乙?；腿ヒ阴；^程第20頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

組蛋白甲基化通常發生在組蛋白H3和H4N-末端的精氨酸（Arg，R）和賴氨酸（Lys，K）殘基上，另外組蛋白的球狀結構域有時也會被甲基化。根據每一位點甲基化的程度不同，組蛋白甲基化形式可被分為單甲基化、二甲基化和三甲基化?；诩谆稽c和受作用基因的不同，組蛋白甲基化對基因表達的影響也不同。第21頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

組蛋白去甲基化第22頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

大量的研究證明組蛋白修飾是一個動態可逆的過程，基團的添加和去除就是由一系列的酶催化反應形成的。一般的組蛋白修飾需要一個或多個不同的共價修飾發生協同或拮抗作用，這些多樣性修飾及它們時間和空間上的組合形成大量的特異信號，這些信號類似于密碼并可被相應的調節蛋白識別，影響一系列蛋白質的活動，從而調控真核生物的基因表達，這就是“組蛋白密碼假說”（histonecodehypothesis）。組蛋白密碼的組合變化繁多，因此組蛋白共價修飾是精細、有序的基因表達和生理調控方式，研究清楚這樣的過程不論在理論上還是在實踐中都可能取得巨大的成果。第23頁,共45頁，2024年2月25日，星期天1.3非編碼RNA及其生理生化作用在復雜的生物體內，基因表達受到很多因素影響。在高通量基因組水平的分析中，越來越多的證據表明非編碼RNA在調控基因表達過程中發揮了很大作用。在所有輸出的轉錄本中，編碼蛋白的RNA數量不足1.5%，剩下的是非編碼RNA（noncodingRNA，ncRNA）。根據長度分類，介導表觀遺傳修飾的ncRNA可分為longncRNA（lncRNA）和smallncRNA（sncRNA）。第24頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

lncRNA指長度超過200nt的非編碼RNA，其長度范圍大概從50kb到幾百kb，其序列不具保守性，且不與任何目的基因同源，通過順式作用調節基因表達，使之沉默。目前認為lncRNA的來源途徑主要有：

（1）蛋白編碼基因受多種因素作用而斷裂，形成lncRNA；（2）染色質重排中兩分開區域緊密靠攏，形成lncRNA；（3）非編碼基因轉錄形成lncRNA；（4）小非編碼RNA中某段序列多次復制形成lncRNA；（5）轉錄因子中插入一段序列形成lncRNA等。這些lncRNAs雖不編碼蛋白，但可調節表觀遺傳過程。第25頁,共45頁，2024年2月25日，星期天sncRNA長度通常小于30nt，包括micro-RNA（miRNA）、smallinterferingRNA（siRNA）和piwi-interactingRNA（piRNA）。sncRNA一般是在2個水平上對基因表達進行調控：①轉錄水平，被稱為轉錄基因沉默（transcriptionalgenesilencing，TGS）；

②轉錄后水平，

即轉錄后基因沉默（post-TGS，PTGS）。

TGS抑制轉錄的發生是通過染色質修飾和異染色質化（heterochromatinization），而PTGS則通過降解mRNA或阻止mRNA翻譯來影響RNA的翻譯?？傊?，TGS和PTGS最終都是使基因沉默。sncRNA調控基因表達的機理相對于lncRNA來說簡單而且單一，因為不論是TGS和PTGS，其作用機制都是sncRNA的序列與目的基因相匹配，兩者配對、結合使基因不能發生轉錄，或mRNA不能發生翻譯。第26頁,共45頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2表觀遺傳調節的效應2.1基因組印記在一個基因或基因組域上發生雙親來源信息的生化標記的生物學現象，叫做基因組印記（genomicimprinting），或遺傳印記、基因印記。所發生的“印記”可以是共價標記（如DNA甲基化），也可以是非共價標記（如DNA-蛋白質互作、DNARNA互作和核基因組定位等），印記方式與整個細胞周期中維持雙親表觀記號的特定核內酶的作用有關。基因組印記使得基因依親代的不同而有不同的表達，還可能導致細胞中兩個等位基因的一個表達而（不同親源的）另一個不表達。第28頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2.2母性效應母性效應（maternaleffect），或稱母性影響，是指子代某一性狀的表型由母體核基因型決定，而不受本身基因型支配。有名的例子是椎實螺（pondsnail）的螺殼，有左旋和右旋之分，旋轉方向的遺傳符合母性效應。

母性效應常與印記效應相關，研究表明相關基因的差異性甲基化、磷酸化以及選擇性的蛋白互作與母性效應的形成和維持有很大關系。第29頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2.3基因沉默基因沉默（genesilencing）也稱基因沉寂，是真核生物細胞基因表達調節的重要手段之一。基因沉默常緣于異染色質（heterochromatin）形成，被沉默的基因區段高度濃縮。受控于ncRNA的RNAi（RNA干擾）與轉錄后基因沉默在分子層次上實際是同一現象。基因沉默的反應過程包括組蛋白N-端賴氨酸殘基的去乙?；⒓谆揎?、以及甲基化組蛋白與其結合蛋白（MBP）誘發異染色質形成等。第30頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

基因沉默一方面是遺傳修飾生物實用化、商品化的障礙，另一方面也是生物抗逆性（如植物抗病毒）的重要反應，為植物工程育種等提供了策略（例如RNA介導病毒抗性技術的發展）。第31頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2.4核仁顯性核仁顯性（nucleolardominance）指在動植物雜合體中，核糖體位點基因受到抑制，使染色體遺傳自父母中的一方，而表現出的顯性效應。其機理是，來自父或母方的RNA聚合酶I在核糖體RNA（rRNA）基因轉錄過程中呈現出可逆的沉默。由于rRNA基因跨越數百萬bp，成簇存在于核仁組織區，不難理解核仁顯性是染色體沉默中的一種主要機制，本質上是rRNA染色質因化學修飾而沉默的結果，但具體機制并沒有定論。由于核仁顯型，雜交動植物中整組親代rRNA基因可能被關閉。第32頁,共45頁，2024年2月25日，星期天2.5表觀遺傳修飾的其他效應

染色質重塑（chromosomeremodeling）：核小體在真核細胞DNA上重新定位的過程，引起染色質變化，與組蛋白修飾和核小體結構改變有關；

副突變（paramutation）：是指一個等位基因可以使其同源基因的轉錄產生穩定可遺傳變化的途徑，涉及配子與合子之間的RNA轉移；

RNA編輯（RNAediting）：基因轉錄產生的mRNA分子中，因核苷酸缺失、插入或置換，而造成轉錄物序列不與基因編碼序列互補，產生不同于基因編碼信息的蛋白質氨基酸組成的現象；

休眠轉座子激活（dormanttransposonactivation）：轉座子重新進行轉座，使插入位點失活。也是研究較多的表觀遺傳修飾效應。第33頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3植物表觀遺傳學研究在一定范圍內，植物表觀遺傳學的相關進展相當突出。表觀遺傳學的一些重要現象，如轉基因沉默、副突變等最初就是在植物體系中發現的。植物表觀遺傳學也有一些獨特之處，如DNA甲基化的種類和調控DNA甲基化的酶類等。植物表觀遺傳學特異性現象和機制的揭示是理解表觀遺傳學全貌的重要內容。第34頁,共45頁，2024年2月25日，星期天3.1植物轉基因沉默目前許多種轉基因植物已經問世，有的已經用于農業生產，但所轉入的目的基因沉默而不表達，或不穩定、不完全表達已經成為植物遺傳改良的突出障礙；沉默基因的消除是一個重要的課題。轉基因沉默就是轉基因失活，指的是當把外源基因導入生物體內時，相應序列內源基因被抑制而不能表達的基因調控現象。轉基因沉默屬于同源性決定的或重復序列誘導的基因失活。此時，其他基因并不受影響；沉默基因恢復表達活性的時機是所轉入外源基因與內源同源基因重組分離或減數分裂分離之后。

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植物轉基因沉默發現于1990年，研究人員在將查爾酮合成酶（chalconesynthase）基因向紫色矮牽牛（Petunia）中轉移時，發現外源基因與內源同源查爾酮合成酶基因一起發生了抑制（共抑制，co-suppression）。后來，人們發現植物受病毒侵染也會造成基因沉默，與上述轉基因沉默一樣屬于轉錄后基因沉默（post-transcriptiongenesilencing，PTGS）。第36頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

20世紀末到21世紀初的大量研究成果隨轉基因沉默的發現而產生。人們在反義基因誘導果蠅（Drosophila）pal-1基因沉默的研究中發現了雙鏈RNA（dsRNA）可致基因沉默，隨即又在線蟲（Caenorhabditiselegans）中發現dsRNA比單鏈的反義RNA（antisenseRNA）能更有效誘導基因失活，于是產生了RNA干擾（RNAinterference，RNAi；即RNA介導的基因沉默）的概念：這是一種PTGS式的基因調節模式，其中非編碼dsRNA分子（小干擾RNA,smallinterferingRNA，siRNA)介導靶mRNA的序列特異性降解。siRNAs是21~23個核苷酸的dsRNA，含有對稱的2~3個核苷酸的3'突出末端，并有5'和3'羥基端。第37頁,共45頁，2024年2月25日，星期天siRNA的結構第38頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

發生RNAi時，長的dsRNA分子被Dicer酶裂解，產生siRNA。隨即，siRNA分子摻入一個多蛋白因子的RNA誘導沉默復合體（multiproteinRNA-inducingsilencingcomplex，RISC）中；dsRNA解鏈，其中的反義鏈（anti-sensestrand）引導RISC到互補的mRNA上，執行后續的核酸內切裂解反應（endonucleolyticcleavage）。第39頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

植物的轉基因沉默可以發生在DNA水平（位置效應，positioneffect）、轉錄水平（轉錄失活，transcriptioninactivation）和轉錄后水平（轉錄后基因沉默，PTGS）。由于所轉入的外源基因向宿主基因組的插入具有隨機性，若插入到轉錄不活躍區，就會發生位置效應所致基因低表達或不表達。在染色質中，兩個核基質結合區（nuclearmatrixattachmentregion，MAR）間的基因片段被界定成一個獨立的染色質環，作為隔離子（insulator）阻止附近順式調控元件對環內基因表達的干擾。當轉基因在受體基因組內整合后，有可能在MAR作用下形成環形結構單元。這可以解釋DNA水平轉基因沉默的成因及提高轉基因表達水平的機理。第40頁,共45頁，2024年2月25日，星期天

轉基因所形成的DNA異位配對可造成異染色質化或從頭甲基化，進而抑制轉錄，這一效應也可由DNA-RNA協同作用造成。這就誘發了轉錄水平的基因沉默。甲基化是活細胞中最常見的DNA共價修飾形式，通常發生于GC和GNC序列的C上，幾乎所有植物轉基因沉默都與啟動子甲基化有關；GC和GNC序列的C上的甲基化雖不是轉錄水平的轉基因沉默的前提，但卻是維持這種沉默的必要方式。另外，多拷貝重復基因在宿主基因組內的整合，形成異位配對，引起基因組防