藥物分析實驗武漢大學藥學院第一章藥物分析實驗須知 2第一節藥物分析實驗的性質和基本要求 2第二節實驗室安全知識 第三節原始記錄與實驗報告 第四節實驗考核方式 5第二章藥物的鑒別試驗 6實驗一典型藥物的鑒別試驗 6第三章藥物的雜質檢查 實驗二藥物的一般雜質檢查 五種無機雜質的檢查………13實驗三藥物的一般雜質檢查 殘留溶劑的檢查……………18實驗四藥物的特殊雜質檢查 色譜分析法檢查藥物中的有關物質…………22第四章藥物制劑的常規檢查 實驗五藥物制劑的含量均勻度和溶出度檢查 第五章藥物的含量測定 實驗六雙相滴定法測定水溶性有機酸鹽類藥物的含量 實驗七亞硝酸鈉滴定法測定含芳伯氨基藥物的含量 實驗八非水溶液滴定法測定化學原料藥含量 實驗九旋光法、折光法和剩余滴定法測定葡萄糖注射液含量 實驗十紫外分光光度法測定復方磺胺嘧啶片含量 實驗十一高效液相色譜法測定復方磺胺甲噁唑片含量 實驗十二氣相色譜法測定維生素E膠丸含量 第六章綜合性實驗 實驗十三化學原料藥及其制劑的全質量檢驗 實驗十四中藥制劑的全質量檢驗 第七章設計性實驗 實驗十五藥物制劑的HPLC含量測定方法建立與驗證 實驗十六藥物制劑的毛細管電泳含量測定方法建立與驗證 實驗十七藥品質量標準的制訂 實驗十八血漿或尿液中藥物色譜分析方法的建立與驗證 參考文獻 2第一章藥物分析實驗須知第一節藥物分析實驗的性質和基本要求1.藥物分析實驗的性質方法和基本操作技能，熟練使用各種分析儀器，全面了解藥品檢驗工作的基本程責任意識、質量意識和安全意識，培養嚴肅認真、實事求是的科學態度和工作作風。(1)進入實驗室應穿白色工作服，保持實驗室安靜及室內衛生和整潔，不得將與實驗(2)實驗室禁止吃東西、吸煙。(3)實驗課前做好預習，明確每次實驗的目的要求，熟悉原理和操作要點，預先安排(4)認真掌握操作技術，細心觀察實驗現象。在嚴格按實驗規程操作、虛心接受教師(5)為防止試劑、藥品污染，取用時應仔細觀察標簽和取用工具上的標志，杜絕錯蓋瓶蓋或不隨手加蓋的現象發生。當不慎發生試劑污染時，應及時報告任課藥品應在指定位置取用。取出的試劑、藥品不能再倒回原瓶。未經允許不(6)愛護儀器和公物，節約試劑、藥品和水電；破損儀器應及時登記報損、補發。使(7)可回收利用的廢溶劑應回收至指定的容器中；有毒、腐蝕性等物質，按教師要求存放，不可任意丟棄；濾紙、火柴棒、碎玻璃等應投入廢物簍，切勿丟入水池內。(8)實驗完畢應認真清理實驗臺，儀器洗凈后放回原處，擦凈臺面，晾好抹布、毛刷、放齊凳子、鎖好柜子，經教師同意后，方可離開。值日生還應負責(9)認真處理數據、總結實驗結果，按要求撰寫實驗報告，并在規定時間內上交。3(10)各組及同學之間應相互協作，合理安排實驗時間、實驗內容和后續工作。在藥物分析實驗中常接觸到有腐蝕性、毒性、易燃燒或易爆炸的化學試劑和藥品，以及各種電器設備，如使用不慎易發生危險。劑的性質、儀器的性能和正確操作方法有充分的了解驗室的各種安全操作守則。要時刻注意防火、防自動手處理。下面介紹一般實驗室中可能發生的危險及預防處理措施。實驗室中失火原因通常是使用或蒸餾易燃液體不謹慎或電器電線有故障。下面是預防(1)易燃燒物質不宜大量存放于實驗室中，應貯存在密閉容器內并放于陰涼處。(2)加熱低沸點或中等沸點等易燃液體，例如乙醚、二硫化碳、丙酮、苯、酒精等最好是用水蒸氣加熱，至少用水浴加熱，并時時察看檢查，不得離開操作崗位。切不能用直火(3)在實驗中使用或傾倒易燃物質時，注意要遠離火源。(4)身上或手上沾有易燃物質時，應立即清洗干凈，不得靠近火源。(5)易燃液體的廢液應倒入專用貯存器，不得倒入下水道，以免引起燃燒、爆炸等事(6)磷與空氣接觸，易自發著火，宜貯存在水中；金屬鈉暴露于空氣中能自發著火，(1)乙醚在室溫時的蒸氣壓很高，乙醚和空氣或氧氣混合時能產生爆炸性極強的過氧(2)無水過氯酸與還原劑接觸能引起爆炸，無水過氯酸也能自發爆炸，常用的60%~70%濃度的過氯酸的水溶液，則沒有危險。(3)下列物質混合，都可能發生爆炸。4⑦磷與硝酸、硝酸鹽、氯酸鹽。(4)易發生爆炸的操作不得對著人進行。(5)使用可燃性氣體如氫氣、乙炔等作為儀器的氣源時，氣瓶及儀器管道的接頭處不能漏氣，以免漏氣后與空氣混合發生爆炸。3.有腐蝕性、毒性的試劑和藥品(1)硫酸、鹽酸、硝酸、冰醋酸、氫氟酸等酸類物質腐蝕性很強，能燙傷皮膚產生劇烈的疼痛，甚至發炎腐爛，酸也能損壞衣物。應特別注意勿使酸濺入眼中，嚴重的能使眼睛失明。鹽酸、硝酸、氫氟酸的蒸氣對呼吸道粘膜及眼睛有強烈的刺激作用，因此在傾倒上述酸類時應在毒氣櫥中進行，或戴上經水或蘇打溶液浸濕的口罩及防護眼鏡。稀釋硫酸時，應謹慎地將濃硫酸漸漸傾注水中，切不可把水傾注濃硫酸中。被酸燙傷時可用大量水沖洗，然后用20%蘇打溶液洗拭。被氫氟酸燙傷時，先用大量冷水沖洗，后用5%蘇打溶液洗拭，再以甘油與氧化鎂糊(2:1)的濕紗布包扎或到醫院處理。(2)氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿類物質，均能腐蝕皮膚及衣服，濃氨水的蒸氣能嚴重刺激粘膜及傷害眼睛，使流淚并可能引發各種眼疾。被堿類燙傷時，應立即用大量水沖洗，然后再用2%硼酸或醋酸溶液沖洗。(3)濃過氧化氫能引起燙傷，可用熱水或硫代硫酸鈉溶液敷治。苯酚有腐蝕性，使皮膚呈白色燙傷，應立即將其除去，否則引起局部糜爛，治愈極慢。(4)溴能刺激呼吸道、眼睛及燒傷皮膚。燒傷處用25%氨溶液-松節油-95%乙醇(1:1:10)的混合液涂敷處理。(5)氰化鉀、三氧化二砷、升汞、黃磷或白磷皆有劇毒，應嚴格按毒劇物有關規定保存、取用，切勿誤入口中，使用后應及時洗手。4.用電安全實驗室中由于電線、電氣設備損壞，或線路安裝不妥，或使用不慎，或實驗人員缺少用電常識，易發生觸電事故或火災。實驗室用電一般應注意：(1)定期檢查電線、電器設備有無損壞，絕緣是否良好，電線和接頭有無損壞。(2)使用電器時，先應認真閱讀使用說明書，明確使用方法，不可盲目地接入電源。(3)使用烘箱和高溫爐時，必須確認自動控制溫度裝置的可靠性，同時還需人工定時監測溫度。(4)不要將電器放在潮濕處，禁止濕手或沾有食鹽溶液和無機酸的手接觸電器，也不5宜站在潮濕的地方使用電器。(5)正確操作閘刀開關，使閘刀處于完全合上或完全拉斷的位置，不能若即若離，以防接觸不良造成漏電。禁止將電線頭直接插入插座內使用。5.玻璃儀器洗滌玻璃器皿，應注意安全，以防劃傷；破損的玻璃器皿和碎片應放入安全的地方，切第三節原始記錄與實驗報告進入實驗室要隨身攜帶一本預先編好頁碼的實驗記錄本，用于及時、完整、確切地記錄于實驗記錄本上，絕不允許記于紙條上、手上或其他地方再譽寫，也不允許暫記在腦子里等下一個數據一起記錄。原始記錄是實驗報告的一部分，尊重原始記錄是必要的科學作風。記錄本不準撕頁，如記錄有誤，只能將寫錯處用雙線劃去(但要求仍能看清原來寫錯的數值),在其旁寫上正確數據，千萬不得涂改，涂改的原始記錄無效。記錄內容一般包括供試藥品名稱、來源、批號、數量、規格、外觀性狀、包裝情況、實驗中觀察到的現象、檢驗數據等。記錄實驗數據時，保留幾位有效數字應和所用儀器的準確程度相適應。學生結束實驗時，應向教師出示有關實驗結果和原始記錄，教師在原始記錄本上簽字認可后，實驗才能真正完畢。應根據原始記錄，寫出實驗報告。實驗報告應包括實驗名稱、實驗日期、實驗目的、實驗原理、操作步驟、實驗數據的處理及結果、問題及討論、結論等。第四節實驗考核方式《藥物分析實驗》課程主要考核學生是否具有：(1)良好的實驗習慣，嚴謹求實的科學態度和工作作風，大膽創新和積極發現問題、提出問題、分析問題和解決問題的精神和能力；(2)團結協作精神；(3)良好的實驗動手能力；(4)數據處理與文字表達能力。平時成績占70%,期末考試成績占30%。平時成績根據多元素給定，包括實驗素養、實驗預習、實驗前回答問題、原始記錄、實驗操作能力、設計性實驗的設計方案、實驗報告等；期末考試包括筆試、口試、實際操作，采取學生隨機抽取實驗內容，當堂完成實驗并寫出實驗報告，當堂公布評分標準和實驗成績的方式。具體實施細則可參考《武漢大學藥學院實驗課考核規定》。6第二章藥物的鑒別試驗藥物的鑒別試驗是根據藥物的分子結構、理化性質，采用化學、物理化學或生物學方法來判斷藥物的真偽。它是藥品質量檢驗工作的首要任務，只有在藥物鑒別無誤的前提下，藥物的雜質檢查和含量測定才有意義。中國藥典和世界各國藥典所收載的各藥品項下的鑒別方法，均是用于證實貯藏在有標簽容器中的藥物是否為標簽所標示的藥物，而不是對未知藥物進行定性分析。類別藥物的共同化學結構為依據。根據其相同的物理化學性質來進行藥物真偽的鑒別，以區別不同類別的藥物。而專屬鑒別試驗，則是在一般鑒別試驗的基礎上，利用各種藥物的化學結構差異，來鑒別藥物，以區別同類藥物或具有相同化學結構部分的各個藥物單體，達到最終確認藥物真偽的目的。藥物的鑒別方法可以分為化學法、光譜法、色譜法和生物學法。前兩者最為常用，化學法主要包括呈色反應、沉淀生成反應、熒光反應、氣體生成反應等鑒別方法，而光譜法常用的是紫外光譜鑒別法和紅外光譜鑒別法。常常采用化學法與光譜法相結合來同時鑒別藥物。每種藥品一般選用2~4種方法進行鑒別，相互取長補短。實驗一典型藥物的鑒別試驗一、實驗目的1.了解藥物鑒別試驗的目的和特點。2.掌握藥物的常用化學鑒別方法及其影響因素。3.掌握紫外光譜鑒別法和紅外光譜鑒別法。4.判斷有標簽容器中的苯巴比妥、對氨基水楊酸鈉、維生素B?片和注射用硫酸鏈霉素二、基本原理(一)苯巴比妥的化學鑒別1.銀鹽反應：巴比妥類藥物在適當的堿性溶液中，遇過量硝酸銀試液，即產生白色的7橙黃色，其反應原理，可能是苯環上的亞硝基化反應。(二)對氨基水楊酸鈉的化學鑒別對氨基水楊酸鈉水溶液加稀鹽酸酸化后，在中性或弱酸性(pH4～6)條件下能與三氯8(三)維生素B1的化學鑒別(四)硫酸鏈霉素的化學鑒別1.坂口反應：系鏈霉素水解產物鏈霉胍的特征反應。硫酸鏈霉素水溶液加氫氧化鈉試液，水解生成鏈霉胍；鏈霉胍、8-羥基喹啉分別與次溴酸鈉的反應產物縮合生成橙紅色化合麥芽酚與三價鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。反應式如下：9鏈霉素麥芽酚紫紅色配位化合物(五)影響化學鑒別的因素影響化學鑒別反應的因素主要有溶液的濃度、試劑的用量、溶液的溫度、溶液的酸堿度、反應時間等，溶液的濃度主要是指被鑒別藥物的濃度。溶液的濃度和各種試劑的用量一般是過量的。溶液的酸堿度應使各反應物有足夠的濃度處于反應活化狀態，使反應生成物處于穩定和易于觀測的狀態。一般，溫度升高，化學反應速度會增加，但也可使生成物分解，導致實驗現象變得不明顯，甚至觀察不到陽性結果。有機反應的反應速度一般較慢，因此為使鑒別反應完成，需要一定時間。(六)紫外光譜鑒別法不同的有機藥物由于含有能吸收不同紫外光的基團而顯示特征紫外吸收光譜，可作為鑒別的依據。UV鑒別法簡便，但UV光譜的波長范圍較窄、光譜簡單、平坦，曲線形狀變化不大，尤其是有機分子的吸收波長和強度主要取決于分子中的發色團、助色團及其共軛情況，與精細結構無關。因此，結構完全相同的化合物應有完全相同的吸收光譜，而吸收光譜完全相同的化合物卻不一定是同一個化合物。UV鑒別法的專屬性遠不如IR鑒別法，不能單獨使用，應與其他方法配合，才能對藥物的真偽做出鑒別。常用的UV鑒別方法有：2.規定一定濃度供試液在λmx處的吸收度3.規定吸收波長和吸收系數法4.規定吸收波長和吸收度比值法5.經化學處理后，測定產物的UV特性(七)紅外光譜鑒別法不同的有機藥物由于含有能吸收不同紅外光的基團而顯示特征紅外吸收光譜，可作為鑒別的依據。IR光譜特征性強，專屬性高，凡化學結構明確、組分單一的有機原料藥物都可用IR鑒別，尤其是適合于結構復雜、且結構非常相似的藥物的區別。中國藥典和英國藥典采用標準圖譜對照法，美國藥典采用對照品法。在實際操作中，可根據實際條件選用其中任(一)苯巴比妥的鑒別1.取供試品約50mg,加碳酸鈉試液0.5ml與水5ml,振搖2min,濾過(如不渾濁可不必濾過),濾液中逐滴加入硝酸銀試液，即發生白色沉淀，振搖，沉淀即溶解，繼續滴加過2.取供試品約50mg,加吡啶溶液(1→10)5ml,溶解后，加銅吡啶試液1ml,即顯紫3.取本品約10mg,加硫酸2滴與亞硝酸鈉約5mg,混合，即顯橙黃色，隨即轉橙紅4.取本品約50mg,置試管中，加甲醛試液1ml,加熱煮沸，冷卻，沿管壁緩緩加硫酸0.5ml,使成兩液層，置水浴中加熱，接界面顯玫瑰紅色。5.本品的紅外吸收光譜應與對照圖譜一致。(二)對氨基水楊酸鈉的鑒別1.取本品約10mg,加水10ml溶解后，加稀鹽酸2滴使成酸性，加三氯化鐵試液1滴，2.本品250mg,加1mol/L氫氧化鈉溶液3ml溶解后，用水稀釋至500ml,混勻。精密吸取該液5ml置于內含12.5ml磷酸鹽緩沖液(pH7)的250ml量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻。以相同的緩沖液為空白溶液，測定UV,分別在265nm和299nm波長處有最大吸收，3.本品的紅外吸收光譜應與對照圖譜一致。(三)維生素B1片的鑒別1.取相當于5mg維生素B?的本品細粉適量，加水攪拌，濾過，濾液蒸干后，加氫氧化鈉試液2.5ml溶解，再加鐵氰化鉀試液0.5ml與正丁醇5ml,強力振搖2min,放置使分層，2.取相當于5mg維生素B?的本品細粉適量，加水攪拌，濾過，濾液蒸干后，先加氨試液使成堿性，將析出的沉淀濾過除去。取濾液，加稀硝酸使成酸性后，滴加硝酸銀試液，即生成白色凝乳狀沉淀；分離，沉淀加氨試液即溶解，再加稀硝酸酸化后，沉淀復生成。(四)注射用硫酸鏈霉素的鑒別1.取本品約0.5mg,加水4ml溶解后，加氫氧化鈉試液2.5ml與0.1%8-羥基喹啉的乙醇溶液1m1,放冷至約15℃,加次溴酸鈉試液3滴，即呈橙紅色。2.取本品約20mg,加水5ml溶解后，加氫氧化鈉試液0.3ml,置水浴上加熱5min,加硫酸鐵銨溶液(取硫酸鐵銨0.1g,加0.5mol/L硫酸溶液5m1使溶解)0.5ml,即呈紫紅色。3.本品的紅外吸收光譜應與對照圖譜一致。4.本品的水溶液顯硫酸鹽的鑒別反應。(1)取本品水溶液，滴加氯化鋇試液，即生成BaSO?白色沉淀；分離，沉淀在鹽酸或硝酸中均不溶解。(2)取供試品溶液，滴加醋酸鉛試液，即生成PbSO?白色沉淀；分離，沉淀在醋酸銨試液或氫氧化鈉試液中溶解。1.苯巴比妥的銅鹽反應中，樣品量要足夠50mg。亞硝酸鈉-硫酸反應中，應采用干燥試管或白色點滴板。甲醛-硫酸反應中，操作須細心，滴加硫酸時要慢，并且沿管壁加入，方能成兩液層；然后放入剛煮沸過的水浴中，靜置加熱，時間應足夠(約1～2min),則可(1)由于常需采用規定波長、吸收度、吸收系數等的比對，故測定時應注意儀器的波(2)對于吸收帶很窄的藥物，應考慮儀器狹縫對測定結果的影響。(3)根據藥物的溶解性，選擇合適的溶劑，不溶于水的藥物常采用甲醇、乙醇或水-醇混合溶劑；當采用有機溶劑時，要注意溶劑的吸收波長是否對該鑒別波長產生干擾。(4)為了增加藥物的溶解度或穩定性，或需要其在一定pH條件下產生相應的特征吸收，常常在溶劑中加入一定濃度的酸、堿或緩沖液。(1)樣品的純度應大于98%,應不含水分。(2)空白片光譜圖的基線應大于75%透光率；除在3440cm-1及1630cm-1附近因殘留或附著水而呈現一定吸收峰外，其他區域不應出現大于基線3%透光率的吸收譜帶。(3)有機堿鹽酸鹽采用溴化鉀壓片時，可能發生復分解反應(B·HCl+KBr→B·HBr+KCl),此時可采用氯化鉀壓片，并比較氯化鉀壓片和溴化鉀壓片法的光譜，若二者沒有區(4)供試品研磨應適度，以粒度2～5μm為宜。過度研磨可能導致晶格結構被破壞或晶型轉化。粒度不夠細則易引起光散射能量損失，整個光譜基線傾斜，甚至嚴重變形。(5)壓片法制成的片厚宜在0.5mm以下，否則可觀察到干涉條紋，干擾供試品光譜。(6)樣品掃描速度應與波長校正的條件一致，因為快速掃描將使波長滯后。制成圖譜的最強吸收峰透光率應在10%以下。(7)藥物制劑采用IR法鑒別時，應對供試品進行前處理，以除去輔料的干擾。五、思考題1.藥物鑒別試驗的目的和特點分別是什么?2.影響化學鑒別反應的因素主要有哪些?3.紫外光譜鑒別法、紅外光譜鑒別法各有什么特點?第三章藥物的雜質檢查藥物的檢查包括四大方面，分別是有效性、均一性、安全性和純度要求。藥物的純度是指藥物的純凈程度，藥物中的雜質是影響藥物純度的主要因素。因此，藥物的純度檢查即是指藥物的雜質檢查。根據藥物中雜質存在的廣泛程度可分為一般雜質檢查及特殊雜質檢查。一般雜質是在大多數藥物的生產和貯藏過程中都容易引入的雜質，如氯化物、硫酸鹽、鐵鹽、重金屬、砷鹽、熾灼殘渣、殘留溶劑等，而特殊雜質是各個藥物中可能存在的原料、中間體、降解物、異構體、副反應產物等，是該藥在生產和貯藏過程中有可能引入的僅屬該藥特有的對于藥物中所存在的雜質，在不影響療效、不產生毒性和保證藥物質量的前提下，允許藥物中含有一定量的雜質。雜質的限量一般根據雜質的安全性、生產的可行性、產品的穩定性等綜合考慮而定。藥物中雜質限量的控制方法一般分兩種：一種為限量檢查法(limittest),另一種是對雜質進行含量測定。限量檢查法通常不要求測定其準確含量，只需檢查雜質是否超過限量。進行限量檢查時，多數采用標準溶液對照法，此外，還可采用靈敏度法和比較法。標準溶液對照法系指取一定量的被檢雜質標準溶液和一定量供試品溶液，在相同的條件下試驗，比較結果，以確定雜質含量是否超過限量。由于供試品(S)中所含雜質的最大允許量可以通過雜質標準溶液的濃度(C)和體積(V)的乘積表達，所以，雜質限量(L)的計算公式為：采用對照法須注意平行操作原則，即供試溶液和對照溶液應在完全相同的條件下反應，如加入的試劑、反應的溫度、放置的時間等均應相同，這樣檢查結果才有可比性。出現，從而判斷供試品中所含雜質是否符合限量規定乳酸(lacticacid)中枸櫞酸、草酸、磷酸或酒石酸的檢查：取本品0.5g加水適量使成5ml,混勻，用氨試液調至微堿性，加氯化鈣試液1ml,至水浴中加熱5min,不得產生渾濁。比較法系指取供試品一定量依法檢查，測定特定待檢雜質的特征參數(如：吸光度等)與規定的限量比較，不得更大。如利巴韋林(ribovirin)中吸光度的檢查：取本品1.0g,加水25ml溶解后，在430nm波長處測定吸光度，不得大于0.02。又如維生素B?中檢查感光黃素，利用維生素B?幾乎不溶于氯仿，而感光黃素溶于氯仿的性質，用無醇氯仿提取供試品中的感光黃素，在440nm波長處測定氯仿液的吸光度，不得超過0.016。實驗二藥物的一般雜質檢查--—-五種無機雜質的檢查一、實驗目的1.掌握氯化物、硫酸鹽、鐵鹽、重金屬和砷鹽限量檢查的基本原理和方法。二、基本原理無機雜質可能來源于生產過程，如生產過程中使用的儀器、原料、干器，反應試劑、催化劑、助濾劑、活性炭等，它們一般是已知的和確定的。由存在狀況對評價藥品的生產工藝、保證藥品安全、穩定具有重要意義。1.氯化物檢查渾濁，與一定量標準氯化鈉溶液(10μgCI/ml)與硝酸銀在同樣條件下生成的氯化銀渾濁程度相比較，判定供試品中氯化物是否符合限量規定。2.硫酸鹽檢查藥物中微量的硫酸鹽在稀鹽酸酸性溶液中與氯化鋇反應，生成的硫酸鋇微粒顯白色渾濁，與一定量標準硫酸鉀溶液(100μgSO?2/ml)在相同條件下產生的硫酸鋇渾濁程度比較，3.鐵鹽檢查中國藥典和美國藥典均采用硫氰酸鹽法。鐵鹽在鹽酸酸性溶液中與硫氰酸鹽作用生成紅色可溶性的硫氰酸鐵配離子，與一定量標準鐵溶液(硫酸鐵銨，FeNH?(SO?)z·12H?O)用Fe3++nSCN'→[Fe(SCN)nJ"-3(n=1～6)在酸性條件下反應，可防止Fe3+的水解。加入氧化劑過硫酸銨既可氧化供試品中Fe2+成Fe3+,同時可防止由于光線使硫氰酸鐵還原或分解褪色。某些藥物(如葡萄糖、糊精、硫酸鎂等)在檢查過程中需加硝酸處理，硝酸也可將Fe2+氧化成Fe3+,因此這些藥物的鐵鹽檢查可在硝酸酸性溶液中進行。因硝酸中可能含亞硝酸，HNO?+SCN-+H+→NO·SCN+H?O4.重金屬檢查重金屬系指在實驗條件下能與硫代乙酰胺或硫代鈉作用而顯色的金屬雜質，如銀、鉛、易積蓄中毒，故作為重金屬的代表，以鉛的限量表示重金屬限度。中國藥典(2005)收載了四種重金屬檢查方法。其中，硫代乙酰胺法的原理如下：硫代乙酰胺在弱酸性條件下(pH3.0～3.5)水解，產生硫化氫，與重金屬離子生成黃色CH?CSNH?+H?O→CH?CONH?+H?SPb2?+H?S→PbS↓中國藥典(2005)收載的古蔡氏(Gutzeit)法檢查砷鹽的原理是：金屬鋅與酸作用產生新生態的氫，與藥物中微量砷鹽反應生成具揮發性的AsO3-+3Zn+9H+→3Zn2++3H?O+AsH?個AsH?+3HgBr?→3HBr+As(HgBr)?(黃色)在反應液中加入碘化鉀及氯化亞錫將五價砷化亞錫還原為碘離子，后者與反應中產生的鋅I?+Sn2+→2I-+Sn?+4I+Zn2+→[Znl?]2-氯化亞錫與碘化鉀還可抑制銻化氫的生成，因銻化氫也能與溴化汞試紙作用生成銻斑。錫齊，起去極化作用，從而使氫氣均勻而連續地發生。成硫化汞的色斑，干擾試驗結果，故用醋酸鉛棉花吸收硫化氫。用醋酸鉛棉花60mg,裝管高度約60mm～80mm,以控制醋酸鉛棉花填充的松緊度，使既能免除硫化氫的干擾(100μgs2存在也不干擾測定),又可使砷化氫以適宜的速度通過。取本品0.30g,加水溶解使成12.5ml(溶液如顯堿性，可滴加硝酸使成中性),再加稀硝酸5ml;溶液如不澄清，應濾過；置25ml納氏比色管中，加水使成約20ml,搖勻，即得供試溶液。另取標準氯化鈉溶液(10μgCI/ml)3.0ml,置25ml納氏比色管中，加稀硝酸5ml,加水使成約20ml,搖勻，即得對照溶液。于供試溶液與對照溶液中，分別加入硝酸銀試液0.5ml,用水稀釋使成25ml,搖勻，在暗處放置5分鐘，同置黑色背景上，從比色管上方向下觀察、比較、供試溶液不得比對照溶液更濃(0.010%)。取本品1.0g,加水溶解使成約20ml(溶液如顯堿性，可滴加鹽酸使成為中性);溶液如不澄清，應濾過；置25ml納氏比色管中，加稀鹽酸1ml,搖勻，即得供試溶液。另取標準硫酸鉀溶液(100μgSO?2/ml)1.0ml,置25ml納氏比色管中，加水使成約20ml,加稀鹽酸1ml,搖勻，即得對照溶液，于供試溶液與對照溶液中，分別加入25%氯化鋇溶液2.5ml,用水稀釋使成25ml,充分搖勻，放置10分鐘，同置黑色背景上，從比色管上方向下觀察、比較、供試溶液不得比對照溶液更濃(0.010%)。取本品1.0g,加水10ml溶解后，加稀硝酸2滴，緩緩煮沸5分鐘，放冷，加水稀釋使成23ml,加硫氰酸銨溶液(30→100)2ml,搖勻，如顯色、與標準鐵溶液(10μgFe3*/ml)1.0ml經相同方法制成的對照溶液比較，不得更深(0.001%)。4.重金屬取25ml納氏比色管兩支，甲管中加一定量的標準鉛溶液(10μgPb2+/ml)與醋酸鹽緩沖液(pH3.5)1ml后，加水稀釋成12.5ml。取本品2.0g,置于乙管中，加水11.5ml溶解后，加醋酸鹽緩沖液(Ph3.5)1ml;若供試液帶顏色，可在甲管中滴加少量的稀焦糖溶液或其它各1ml,搖勻，放置2分鐘，同置白紙上，自上向下透視，乙管中顯出的顏色與甲管比較，不得更深(含重金屬不得過百萬分之五)。取本品2.0g置試砷瓶中，加水5ml溶解后，加稀硫酸5ml與溴化鉀溴試液0.5ml,置水浴上加熱約20分鐘，使保持稍過量的溴存在，必要時，再補加溴化鉀溴試液適量，并隨時(可改為加稀鹽酸(1:1)10ml)與水適量使成28ml,加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴。在室溫放置10分鐘后，加鋅粒2g(鋅粒和鋅粉各1g),迅速用試砷管塞緊瓶塞(試砷管上已置裝有醋酸鉛棉花及溴化汞試紙),并在25～40℃的水浴中反應45分鐘，取出溴化汞試紙，將生成的砷斑與一定量標準砷溶液制成的標準砷斑進行比較，顏色不得更深，應符合規定(0.0001%)。標準砷斑的制備：精密量取標準砷溶液(1μg/ml)2ml,置試砷瓶中，加濃鹽酸5ml與蒸餾水21ml(可改為：加稀鹽酸(1:1)10ml和蒸餾水16ml),再加碘化鉀試液5ml與酸性氯化亞錫試液5滴，在室溫放置10分鐘后，加鋅粒2g(鋅粒和鋅粉各1g),迅速用試砷管塞緊瓶塞(試砷管上已置裝有醋酸鉛棉花及溴化汞試紙),并在25～40℃的水浴中反應45分鐘，取出溴化汞試紙，觀察標準砷斑。1.納氏比色管的選擇與洗滌：比色或比濁操作，一般均在納氏比色管中進行，因此在選用比色管時，必須注意使樣品管與標準管的體積相等，玻璃色質一致，最好不帶任何顏色，管上的刻度均勻，如有差別，不得相差2mm。比色管洗滌時避免用毛刷或去污粉等洗刷，以免管壁劃出條痕影響比色或比濁。2.平行原則：比色、比濁、砷鹽檢查時，樣品液與標準液的實驗條件應盡可能一致，3.嚴格按操作步驟進行實驗，注意各種試劑的加入次序。如氯化物檢查時，加適量蒸餾水使成約20ml后，再加AgNO?試液。4.比色、比濁前應使比色管內試劑充分混勻，主要利用手腕轉動360的旋搖操作來完成；比色方法是將兩管同置于白色背景上，從側面觀察；比濁方法是將兩管同置于黑色或白色背景上，自上而下觀察。5.重金屬檢查中，應注意：(1)根據雜質限量計算公式，計算出標準鉛溶液的取用量。(2)樣品管中“加水11.5ml溶解后，加醋酸鹽緩沖液(pH3.5)1ml”,實驗時應采用“加水適量溶解后，加醋酸鹽緩沖液”(pH3.5)1ml,再加水使成12.5ml,更便于操作。加醋酸鹽緩沖液前，注意比較樣品管與標準管的溶液顏色，若樣品管帶色，應在標準管中滴加少量稀焦糖溶液，使兩管的顏色一致，然后依法操作。如在標準管(甲管)中滴加稀焦糖溶液仍不能使顏色一致時，可取該藥品項下規定的二倍量的供試品和試液，加水使成15ml,將溶液分成甲乙二等分，乙管中加水稀釋成12.5ml;甲管中加入硫代乙酰胺試液1ml,搖勻，放置2分鐘，經濾膜(孔徑3μm)濾過，然后甲管中加入一定量的標準鉛溶液，加水使成12.5ml,再分別在乙管加硫代乙酰胺試液1ml,甲管中加水1ml,依法比較，即得。(3)標準鉛溶液應在臨用前精密量取標準鉛貯備液新鮮配制，以防止鉛的水解而造成6.砷鹽檢查中，應注意：(1)所用的標準管與樣品管應力求一致，試砷管的長短、內徑一定要相同，以免生成的色斑大小不同，影響比色。(2)預先安裝好試砷管。醋酸鉛棉花用于吸收硫化氫(鋅粒及供試品中可能含有少量硫化物，在酸性溶液中即產生硫化氫),從而免除了與溴化汞作用生成硫化汞色斑的干擾。(3)鋅粒的大小以通過20目篩為宜，過細則作用太快，過粗則作用太慢，為此可采用鋅粒與鋅粉各一半加入的方式。(4)加鋅粒后，應立即將試砷管蓋上，塞緊，以免AsH?氣體逸出。1.比色、比濁操作應遵循的原則是什么?2.試計算葡萄糖重金屬檢查中標準鉛溶液的取用量。3.古蔡氏試砷法中所加各試劑的作用是什么?4.根據樣品取用量、雜質限量及標準砷溶液的濃度，計算標準砷溶液的取用量。實驗三藥物的一般雜質檢查--—-殘留溶劑的檢查1.掌握藥品中殘留有機溶劑的分類和檢查方法。2.熟悉殘留有機溶劑檢查的一般操作要求。二、基本原理(一)殘留溶劑及其分類藥品中的殘留溶劑是指在原料藥或輔料的生產中，以及在制劑的制備過程中使用，但在工藝過程中未能完全除去的有機溶劑，屬于一般雜質。中國藥典(2005)按有機溶劑毒性的程度將殘留溶劑分為三類：一類有機溶劑毒性較大，且具有致癌并對環境有害，應盡量避免使用；二類有機溶劑對人有一定毒性，應限量使用；三類有機溶劑對人的健康危險性較小，因此推薦使用。除另有規定外，第一、二、三類溶劑的殘留量應符合中國藥典的規定；對其它溶劑，應根據生產工藝的特點，制定相應的限度，使其符合產品規范、GMP或其它基(二)殘留溶劑的檢查方法ChP(2005年版)規定殘留溶劑的檢查方法為GC法。既可采用填充柱，也可采用毛細管柱，檢測器通常使用火焰離子化檢測器(FID),對含鹵素元素的殘留溶劑如氯仿等，采用電子捕獲檢測器(ECD),可得到高的靈敏度。采用FID時需加尾吹氣，因為毛細管柱的柱內載氣流量太低(常規柱為1～5ml/min),不能滿足檢測器的最佳操作條件，所以使用毛細管柱時要采用輔助氣(尾吹氣),在色譜柱后增加一路載氣直接進入檢測器(圖3-1),就可保證檢測器在高靈敏度狀態下工作，尾吹氣的另一個重要作用是消除檢外效應。一般情況下，氮氣(尾吹氣+載氣)、氫氣和空氣三者的比例接近或等于1:1:10(1)用待測物的色譜峰計算，填充柱法的理論板數一般應大于1000/柱；毛細管色譜柱(2)色譜圖中，待測物色譜峰與其相鄰的色譜峰的分離度應大于1.5;(3)以內標法測定時，對照品溶液連續進樣5次，所得待測物與內標物峰面積之比的RSD應不大于5%;若以外標法測定，所得待測物峰面積的RSD應不大于10%。(1)頂空進樣：精密稱取供試品0.1-1g。通常以水為溶劑；對于非水溶性藥物，可采用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基甲砜(DMSO)或其他適宜溶劑；根據供試品和待限度規定，配制供試品溶液，使其濃度滿足系統定量測定的需要。(2)溶液直接進樣：精密稱取供試品適量，用水或合適的有機溶劑使溶解；根據品種正文中殘留溶劑的限度規定，配制供試品溶液，使其濃度滿足系統定量測定的需要。3.對照品溶液的制備精密稱取各品種項下規定檢查的有機溶劑適量，采用與制備供試品溶液相同的方法和溶劑制備對照品溶液。若為限度測定時，根據殘留溶劑的限度規定來確定對照品溶液的濃度；若為定量測定，應根據供試品中殘留溶劑的實際殘留量確定對照品溶液的濃度溶液的色譜峰面積與供試品溶液中對應的殘留溶劑的色譜峰面積以不超過2倍為宜。必要時頂空進樣法測定的殘留溶劑有甲酰胺、2一甲氧基乙醇、2-乙氧基乙醇、乙二醇、N-甲基咯烷酮(在酸性環境中)。(1)第一法毛細管柱頂空進樣等溫法本法適用于被檢查的有機溶劑數量不多，并頂空瓶平衡溫度為70～85℃,頂空瓶平衡時間30～60min;進樣口溫度為200℃;如采用FID測定：取對照品溶液和供試品溶液，分別連續進樣不少于2次，測定待測峰的峰面積。(2)第二法毛細管柱頂空進樣程序升溫法本法適用于所需要檢查的有機溶劑數量色譜條件：如為非極性色譜系統，柱溫先在30℃維持7min,再以8℃/min的速度升至120℃,維持15min;如為極性色譜系統，柱溫先在60℃維持6min,再以8℃/min的速度升溫速率升至100℃,維持20min;以氮氣為載氣，流速為2.0ml/min;以水為溶劑時，頂空瓶平衡溫度70～85℃,頂空瓶平衡時間30～60min;進樣口溫度為200℃;如采用FID檢測器，溫具體到單個藥品的殘留溶劑檢查時，可根據該品種項下的殘留溶劑種類調整程序升溫程測定：取對照品溶液和供試品溶液，分別連續進樣不少于2次，測定待測峰的峰面積。(3)第三法溶液直接進樣法可采用填充柱，亦可采用適宜極性的毛細管柱。測定：取對照品溶液和供試品溶液，分別連續進樣2-3次，每次2μl,測定待測峰的峰面限度檢查：以內標法測定時，供試品溶液所得被測溶劑峰面積與內標峰面積的平均值不得大于對照品溶液的相應峰面積的平均值。定量測定：按內標法或外標法計算各殘留溶劑的量。除按正丙醇計算的理論板數應大于700外，其他系統適用性試驗應滿足規定要求。取本品約0.16g,精密稱定，置10ml量瓶中，精密加0.1%(ml/ml)正丙醇(內標物質)溶液2ml,加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密量取甲醇10μl(相當于7.9mg)與丙酮100μl(相當于79mg),置10ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻；精密量取1ml,置10ml量瓶中，精密加內標溶液2ml,加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取供試品溶液和對照品溶液，照第三法，用直徑為0.25mm～0.18mm的二乙烯苯一乙基乙烯苯型高分子多孔小球色譜柱(填充柱)在柱溫150℃測定。含丙酮不得過0.5%(g/g),甲醇不得過0.3%(g/g)。供試品中的未知雜質或其揮發性熱降解物易對殘留溶劑的測定產生干擾。干擾作用包括在測定的色譜系統中未知雜質或其揮發性熱降解物與待測物的保留值相同(共出峰);或熱降解產物與待測物的結構相同(如甲氧基熱裂解產生甲醇)。當測定的有機溶劑殘留量超出限度，但未能確定供試品中是否有未知雜質或其揮發性熱降解物對測定有干擾作用時，應通過試驗排除干擾作用的存在。對第一類干擾作用，通常采用在另一種極性相反的色譜系統中對相同樣品再進行測定，比較不同色譜系統中測定結果的方法。如二者結果一致，則可以排除測定中有共出峰的干擾；如二者結果不一致，則表明測定中有共出峰的干擾。對第二類干擾作用，通常要通過測定已知不含該溶劑的對照樣品來加以判斷。若殘留溶劑為含氮堿性化合物，由于普通氣相色譜儀的不銹鋼管路、進樣器的襯管等對含氮堿性化合物具有較強的吸附作用，致使其檢出靈敏度降低。因此，當采用頂空進樣法測定此類化合物時，應采用惰性的硅鋼材料或鎳鋼材料管路；或采用溶液直接進樣法測定；供試品溶液應不呈酸性，以免含氮堿性化合物與酸反應后不易氣化。通常采用弱極性的色譜柱或經堿處理過的色譜柱分析含氮堿性化合物，如果采用胺分析專用柱進行分析，效果更好。對不宜采用氣相色譜法測定的含氮堿性化合物，可采用其它方法如離子色譜法等測定。五、思考題1.中國藥典規定檢查殘留溶劑時色譜系統適用性試驗應符合哪些要求?2.檢查殘留溶劑時可采用哪幾種進樣方法?測定時應注意哪些問題?實驗四藥物的特殊雜質檢查---色譜分析法檢查藥物中的有關物質一、實驗目的1.掌握薄層色譜法(TLC)檢查藥物中特殊雜質的常用方法和基本操作。2.掌握高效液相色譜法(HPLC)檢查藥物中特殊雜質的常用方法及基本操作。二、基本原理(一)薄層色譜雜質檢查法TLC法常用于藥物中雜質的檢查，具有設備簡單、操作方便、分離速度快，靈敏度和分辨率較高等優點，并且可以同時采用多種檢視斑點的方法來獲得更多的雜質信息。常用的1.供試品溶液自身稀釋對照法適用于雜質的結構不能確定，或無雜質對照品的情況。僅限于雜質斑點的顏色與主成分斑點顏色相同或相近的情況下使用。方法為配制一定濃度的供試品溶液，然后將供試品溶液按限量要求稀釋至一定濃度作為對照溶液，將供試品溶液和對照溶液分別點樣于同一薄層板上，展開、斑點定位。結果判斷：供試品溶液所顯雜質斑點與自身稀釋對照溶液或系列自身稀釋對照溶液所顯主斑點比較，不得更深。2.雜質對照品法適用于已知雜質并能獲得雜質對照品的情況。根據雜質限量，取供試品溶液和一定濃度的雜質對照品溶液，分別點樣于同一薄層板上，展開、斑點定位，將供試品溶液中相應于雜質對照品的斑點與雜質對照品溶液或系列濃度的雜質對照品溶液的主斑點進行比較，判斷藥物中雜質限量是否合格。3.雜質對照品法與供試品溶液自身稀釋對照法并用當藥物中存在多個雜質時，其中已知雜質有對照品時，采用雜質對照品法檢查；共存的未知雜質或沒有對照品的雜質，可采用供試品溶液自身稀釋對照法檢查。4.母體藥物對照法當無合適的雜質對照品，或者是供試品顯示的雜質斑點顏色與主成分斑點顏色有差異，難以判斷限量時，可用母體藥物作為對照品，此母體藥物中所含待檢雜質需符合限量要求，且穩定性好。(二)高效液相色譜雜質檢查法高效液相色譜法(HPLC)因其分離選擇性好、專屬性強和靈敏度高，可以準確地測定各組分的峰面積，在雜質檢查中的應用日益增多。對于使用HPLC法測定含量的藥物，可采用同一色譜條件進行雜質檢查。采用HPLC法檢查雜質，中國藥典規定應按各品種項下要求，進行色譜系統適用性試驗。HPLC檢查雜質有五種方法：1.不加校正因子的主成分自身對照法適用于缺少雜質對照品的情況。該法以供試品規定外，供試品溶液的分析時間應為主成分色譜峰保留時間的2倍。供試品溶液中各雜質的峰面積與對照溶液主成分的峰面積比較，來控制雜質的限量。下，如雜質與主成分的分子結構相似，其響2.加校正因子的主成分自身對照法適用于測定時不用雜質對照品的情況。但在建立方法時，需要利用雜質對照品和藥物對照品，按內標法求出雜質相對于藥物的校正因子。Cg為雜質對照品的濃度。此校正因子可直接載入各品種質量標準中，在常規檢驗時用以校節檢測靈敏度，使對照溶液中主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%～25%。然后，分別進樣供試品溶液和對照品溶液，除另有規定外，供試品溶液的留時間的2倍。供試品溶液中各雜質的峰面積分別乘以相應的校正因子后，與對照品溶液中用相對保留時間，所以在建立方法時需記載雜質相對于藥物的相對保留時間。3.內標校正因子法適用于有雜質對照品，能夠測定雜質校正因子的情況。先以雜質為供試品溶液中雜質的濃度。4.外標法適用于有雜質對照品，而且進樣量能夠精確控制(以定量環或自動進樣器進樣)的情況。雜質含量計算如下：濃度；Cx為供試品溶液中雜質的濃度。5.峰面積歸一化法適用于粗略測定供試品中雜質的含量。取供試品溶液進樣分析，計算各雜質峰面積總和雜總峰面積的百分率，應不得超過限量。該法簡便快捷，但在雜質結構與主成分結構相差較大時可能會有較大的定量誤差，因此中國藥典(2005)特別強調“本法通常只能用于粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定(三)有關物質特殊雜質是指在特定藥物的生產和貯藏過程中引入的雜質，這類雜質隨藥物的不同而改變。有關物質通常是在某藥物的生產和貯藏過程中，有可能引入的特殊雜質，包括起始物、中間體、異構體、聚合體、副產物、降解產物等，而這些特殊雜質的化學結構往往與主藥相似，但結構不甚明確或雖結構明確，卻難以獲得對照品。色譜分析法是檢查有關物質的首選方法，其中TLC法和HPLC法應用最廣。采用TLC法時，多以供試品溶液自身稀釋對照法進行有關物質的限量檢查；而采用HPLC法時，常以不加校正因子的主成分自身對照法進行有關物質的限量檢查。三、實驗方法(一)TLC法檢查醋酸氫化可的松中有關物質取本品，加氯仿-甲醇(9:1)制成每1ml中含3.0mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加氯仿-甲醇(9:1)稀釋成每1ml中含60μg的溶液，作為對照溶液。照薄層色譜法(中國藥典2005年版二部附錄VB)試驗，吸取上述兩種溶液各10μl,分別點于同一硅膠G薄層板上，以1,2-二氯乙烷-甲醇-水(95:5:0.3)為展開劑，展開后，晾干，在105℃干燥10min,放冷，噴以堿性四氮唑藍試液，立即檢視。供試品溶液如顯雜質斑點其顏色與對照溶液的主斑點比較，不得更深。(二)HPLC法檢查醋酸氫化可的松中有關物質色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(38:62)為流動相，檢測波長為254nm。取醋酸氫化可的松與醋酸可的松對照品適量，精密稱定，用流動相溶解并制成每1ml中含3.5μg的混合溶液，進行測試。理論板數按醋酸氫化可的松峰計算一般為6000,醋酸氫化可的松峰與醋酸可的松峰的分離度應大于5.5。取本品約17mg,精密稱定，置50ml量瓶中，加乙腈20ml,超聲處理使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液；精密量取1ml,置100ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。取對照溶液20μl注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使醋酸氫化可的松色譜峰的峰高約為滿量程的40%。再精密量取供試品溶液與對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的3倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰，最大單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積，其他單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1/2倍，各雜質峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積的2倍。四、實驗指導(一)TLC法檢查醋酸氫化可的松中有關物質1.限量檢查方法甾體激素藥物多由其它甾體化合物經結構改造而來，其中的有關物質主要包括起始物、中間體、副產物、降解產物等。這些雜質一般具有甾體的母核，與藥物的結構相似，但多數雜質的結構是未知的。因此，TLC法是檢查甾體激素藥物中有關物質的常用方法之一，并且各國藥典多采用供試品溶液自身稀釋對照法進行有關物質的限量控制。2.顯色原理醋酸氫化可的松的化學結構中，C17位的α--醇酮基(-CO-CH2OH)具有還原性，在強堿性溶液中能將四氮唑鹽定量地還原為有色甲膦(formazan),生成的顏色隨所用試劑和條件的不同而不同，多為紅色或藍色。本實驗以堿性四氮唑藍(BT)試液顯色。若BT試液過量，只能還原為紅色單甲膜；若BT試劑不過量，則醋酸氫化可的松可將BT還原為雙甲膜，得藍色斑點。3.薄層板的制備取層析用硅膠G2～2.5g,按1:3(W:V)比例加0.5%羧甲基纖維素鈉上清液，研磨均勻，鋪于一塊8cm×20cm玻璃板上，于室溫下，置水平臺上晾干，在110℃烘半小時，即置于有干燥劑的干燥箱中備用(可供1～2日內使用，層析效果均良好)。一定量的吸附劑糊，這樣可得厚度一致的薄層(1)吸附劑糊可在燒杯中用玻棒充分攪和均勻，也可置于研缽中研勻制得。均勻而粘稠度適宜的吸附劑糊有利于薄層的光滑均勻。(2)0.5%羧甲基纖維素鈉應取上清液，以保證制成的板光滑均勻。(3)薄層板所用的玻璃必須仔細清洗，不得附著油污，否則易引起薄層的剝落。(1)點樣溶液濃度不準，則檢查結果不可靠。若供試品溶液及對照溶液的瓶塞不嚴密或多次取用后溶劑揮發，致使濃度改變，則應重新配制點樣液。(2)在距薄層板底邊2.0~2.5cm處劃點樣基線，在基線上分別點出供試品溶液及對照溶液原點位置。兩點間一般距離1.5~2.0cm,距邊緣一側1.5~2.5cm。(3)可用10μl微量注射器或色譜用10μl微量吸管手動或采用自動點樣儀少量多次點將溶劑揮干后再滴上第二滴，以免原點過于擴散。(4)點樣完畢，風干放冷。(5)每天實驗結束后，點樣用微量注射器或微量吸管需用溶劑洗干凈。底邊1.0cm左右(切勿將樣點浸入展開劑中),加蓋，密封，等展開至規定距離(一般為為節約展開劑的用量，可用50～60ml展開劑，展開缸下面墊以楔形木板使缸底傾斜，仍能達到浸入1cm高度的要求。展開過程中，層析缸應密封良好，否則展開劑不斷揮發，使R;值增大，甚至使斑點到6.顯色(1)堿性四氮唑藍試液應在噴霧前臨時配制(取0.2%四氮唑藍的甲醇溶液10ml與12%氫氧化鈉的甲醇溶液30ml,臨用時混合，即得),以免影響顯色靈敏度。新鮮配制者應呈(2)噴顯色劑時，宜在通風櫥內進行，以避免試劑對人體的刺激。(3)顯色后，立即檢視斑點，并用針頭或鉛筆定位，以便記錄薄層圖譜。(二)HPLC法檢查醋酸氫化可的松中有關物質1.醋酸氫化可的松中可能含有少量醋酸可的松，二者結構非常相似，如果能夠將二者故系統適用性試驗中考察了醋酸氫化可的松和醋酸可的松之間的分離度。2.檢測器的選擇：醋酸氫化可的松峰及其結構類似的有關物質在紫外光區均有吸收，故選用UV檢測器。3.檢測波長的選擇：應選用對各雜質均有較強吸收的波長作為檢測波長，當一個測定五、思考題1.TLC法檢查藥物中特殊雜質的三種方法(雜質對照品法、供試品溶液自身稀釋對照法、母體藥物對照法)各有何特點?2.按TLC法，醋酸氫化可的松中有關物質的限量為多少?3.甾體激素結構中的何種基團可與四氮唑藍產生反應?4.HPLC法檢查藥物中特殊雜質有哪幾種方法?各有何特點?5.按HPLC法，醋酸氫化可的松中最大單個雜質、其他單個雜質及總雜質的限量分別藥物制劑除需檢查雜質外，還需進行劑型方面的常規檢查，以確保藥物制劑的安全性、實驗五藥物制劑的含量均勻度和溶出度檢查一、實驗目的1.掌握含量均勻度、溶出度檢查的目的和判斷標準。2.熟悉含量均勻度、溶出度檢查的一般操作要求。(一)含量均勻度檢查含量均勻度(contentuniformity)系指小劑量或單劑量的固體制劑、半固體制劑和非均相液體制劑的每片(個)含量符合標示量的程度。在制劑的實際生產中，由于采用混合法不可能制造出含量完全相同的單個制劑，特別是當制程度更難以控制，此時僅靠重(裝)量差異的檢查并不能完全反映藥物含量的均勻程度。為含量均勻度檢查結果的判定方法分為計數型和計量型。計數型是基于規定數量各樣本的含量測定值與參考值(標示量或平均含量)的一定限度比較，根據超出限度的樣本個數進行判定；計量型是根據各樣本含量測定值的均值(X)和標準差(S)進行判定。在判定的可ChP(2005)采用計量型判定法。取供試品10片(個),照各品種項下規定的方法，分別測定每片(個)以標示量為100的相對含量X,求其均值X和標準差S以及標示量與均值之差的絕對值A(A=|100—X|):如A+1.80S≤15.0,則供試品的含量均勻度符合規定；若A+S>15.0,則不符合規定；若A+1.80S>15.0,且A+S≤15.0,則應另取20片(個)復試。根據初、復試結果，計算30片(個)的均值X、標準差S和標示量與均值之差的絕對值A:如A+1.45S≤15.0,則供試品的含量均勻度符合規定；若A+1.45S>15.0,則不符合規定。如該品種項下規定含量均勻度的限度為±20%或其它數值時，應將上述各判斷式中的15.0改為20.0或其它相應的數值，但各判斷式中的系數不變。ChP(2005)對含量均勻度應用的指導原則是：①片劑、膠囊劑或注射用無菌粉末每片 (個)標示量不大于10mg或主藥含量小于每片(個)重量5%者，其它制劑每個標示量小于2mg或主藥含量小于每個重量2%者，以及透皮貼劑，均應檢查。②對于治療量與中毒量比較接近的品種或混勻工藝較困難的品種，每片(個)標示量不大于25mg者，應檢查。③急救藥品、毒劇藥品應檢查。④復方制劑僅檢查符合上述條件的組分。⑤主要適用于口服固體藥物制劑。⑥凡檢查含量均勻度的制劑，一般不再檢查重(裝)量差異。(二)溶出度檢查1.溶出度和釋放度溶出度(dissolution)系指藥物從片劑、膠囊劑或顆粒劑等固體制劑在規定條件下溶出的速率和程度。釋放度(drugrelease)系指藥物從緩釋制劑、控釋制劑、腸溶制劑及透皮貼劑等在規定條件下釋放的速率和程度。兩者本質上是相同的，均表達藥物從固體制劑進入介質中的速率和程度。測定固體藥物制劑溶出度或釋放度的過程稱溶出度試驗(dissolutiontest),它是一種模擬口服固體制劑在胃腸道中崩解和溶出的體外試驗方法。目前，溶出度試驗已成為評價口服固體制劑處方和生產工藝的極其重要的體外方法，溶出度數據不僅是口服固體制劑質量控制的重要衡量指標，而且可以在一定程度上反映口服固體制劑的體內生物利用度。2.藥物溶出理論固體制劑中的藥物在溶出介質中的溶出速率可用Noyes-Whiteney方dW/dt=KS(Csar—Csol)3.影響固體制劑中藥物溶出的因素主要有固體藥物表面積、藥物的理化性質、制劑處方和工藝等。一般顆粒越細，與溶出介質接觸的固體藥物表面積則越大，固體制劑的藥物溶出就越快；但對崩解型制劑而言，并非所有品種崩解的顆粒越細，溶出越快。藥物的一些理化性質如溶解度、水合狀態、晶型等，會對藥物的溶出速率產生較大影響：藥物在溶出介質中的溶解度越大，則藥物的飽和溶液濃度越大，藥物溶出加快；藥物分子的水合狀態會影響藥物的某些理化性質，其中受影響較明顯的是藥物在水中的溶解度，一般無水藥物比水合藥物有更大的溶解度；有些藥物存在多種晶型，而不同的晶型往往有不同的溶解度，故而導致不同的溶出速率。制劑處方中所用輔料的種類、性質和用量都會影響藥物的溶出。如處方中加入太多的潤滑劑(硬脂酸鎂等)會使藥物的溶出減慢；羥丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等包衣材料一般不影響藥物的溶出，但蟲膠則是藥物水溶性的阻滯材料；加入一高藥物的溶出度；崩解劑、粘合劑的種類和用量選用不當，也會產生溶出度問題。制備如壓片時所用的壓力、制粒方法、相關制劑技術等都會影響藥物的溶出度。4.溶出度測定中國藥典(2005)采用轉籃法、槳法和小杯法測定溶出度。一般情況下，轉籃法適用于膠囊劑和易于漂浮的藥物劑型；槳法適用于片粒沉積在溶出杯底部，而使藥物的溶出可能變慢，此時轉籃法可能轉籃法調試溶出儀，使轉籃底部距溶出杯的內底部25mm±2mm。分別量取經脫氣處理的溶出介質900ml,置1000ml的各溶出杯內，加溫，待溶出介質溫度恒定在37℃±0.5℃后，取供試品6片(粒、袋),分別投入6個干燥的轉籃內，按各品種項下的規定調節轉速，間，在規定的取樣位置吸取溶出液適量，立即用適當的微孔濾膜(濾孔應不大于0.8μm)濾過，自取樣至濾過應在30s內完成，并及時補充所耗的介質。取澄清濾液，照該品種項下規定的方法測定，計算每片(粒、袋)的溶出量。槳法以攪拌槳代替轉籃。測定時，取供試品6片(粒、袋),分別投入6個溶出杯內(如片劑或膠囊劑浮于液面，應先裝入沉降籃內)。其余同轉籃法。小杯法調試溶出儀，使槳葉底部距溶出杯的內底部15mm±2mm。分別量取經脫氣處理的溶出介質100~250ml,置250ml的各溶出杯內(用于膠囊劑測定時，如膠囊上浮，可用一小段耐腐蝕的細金屬絲輕繞于膠囊外殼)。以下操作同槳法。結果判定符合下述條件之一者，可判為符合規定：①6片(粒、袋)中，每片(粒、袋)的溶出量按標示量計算，均不低于規定限度(Q)。②6片(粒、袋)中，如有1~2片 (粒、袋)低于Q,但不低于Q-10%,且其平均溶出量不低于Q。③6片(粒、袋)中，有1~2片(粒、袋)低于Q,其中僅有1片(粒、袋)低于Q-10%,但不低于Q-20%,且其平均溶出量不低于Q時，應另取6片(粒、袋)復試；初、復試的12片(粒、袋)中有1~3片(粒、袋)低于Q,其中僅有1片(粒、袋)低于Q-10%,但不低于Q-20%,且其平均溶出量不低于Q。5.釋放度測定除另有規定外，儀器裝置同溶出度測定法。樣。在規定取樣時間點，吸取溶液適量，濾過。取濾液，照各品種項算每片(個)的釋放量。三個取樣時間點分布在釋放度測定的早期(一般在開始后的0.5～2h內)、中期和晚期(累積釋放率一般應為75%以上),三個時間點的釋放量分別用于考察藥物是否有突釋、藥物的釋放特性和制劑釋藥是否完全。結果判定符合下述條件之一者，可判為符合規定：①6片(粒)中，每片(粒)在每個時間點測得的釋放量按標示量計算，均未超出規定范圍。②6片(粒)中，在每個時間點測得的釋放量，如有1~2片(粒)超出規定范圍，但未超出規定范圍的10%,且在每個時間點測得的平均釋放量未超出規定范圍。③6片(粒)中，在每個時間點測得的釋放量，如有1~2片(粒)超出規定范圍，其中僅有1片(粒)超出規定范圍的10%,但未超出規定范圍的20%,且其平均釋放量未超出規定范圍，應另取6片(粒)復試；初、復試的12片 (粒)中，在每個時間點測得的釋放量，如有1~3片(粒)超出規定范圍，其中僅有1片(粒超出規定范圍的10%,但未超出規定范圍的20%,且其平均釋放量未超出規定范圍。第二法用于腸溶制劑。方法1:酸中釋放量量取0.1mol/L鹽酸溶液750ml,注入每個溶出杯，加溫使溶液溫度保持在37℃±0.5℃,調整轉速并保持穩定，取6片(個)分別投入轉籃或溶出杯中，按各品種項下規定的方法，開動儀器運轉2h,立即在規定取樣點吸取溶液適量，濾過，濾液按各品種項下規定的方法測定，計算每片(個)的酸中釋放量。緩沖液中釋放量上述酸液中加入0.2mol/L磷酸鈉溶液250ml(必要時用2mol/L鹽酸溶液或2mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8±0.05),繼續運轉45min,或按各品種項下規定的時間，在規定取樣點吸取溶液適量，濾過，濾液按各品種項下規定的方法測定，計算每片(個)的緩沖液中釋放量。方法2:酸中釋放量量取0.1mol/L鹽酸溶液900ml,注入每個溶出杯中，照方法1酸中釋放量項下進行測定。緩沖液中釋放量棄去上述各溶出杯中酸液，立即加入磷酸鹽緩沖液(pH6.8)(取0.1mol/L鹽酸溶液和0.2mol/L磷酸鈉溶液，按3:1混合均勻，必要時用2mol/L鹽酸溶液或2mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至6.8±0.05)900ml,或將每片(個)轉移入另一盛有磷酸鹽緩沖液(pH6.8)900ml的溶出杯中，照方法1緩沖液中釋放量項下進行測定。結果判定符合下述條件之一者，可判為符合規定。酸中釋放量：①6片(粒)中，每片(粒)的釋放量均不大于標示量的10%。②6片(粒)中，有1~2片(粒)大于10%,但其平均釋放量不大于10%。緩沖液中釋放量：①6片(粒)中，每片(粒)的釋放量按標示量計算均不低于規定限度(Q);Q應為標示量的70%。②6片(粒)中僅有1~2片(粒)低于Q,但不低于Q-10%,且其平均釋放量不低于Q。③6片(粒)中如有1~2片(粒)低于Q,其中僅有1片(粒)低于Q-10%,但不低于Q-20%,且其平均釋放量不低于Q時，應另取6片(粒)復試；初、復試的12片(粒)中有1~3片(粒)低于Q,其中僅有1片(粒)低于Q-10%,但不低于Q-20%,且其平均釋放量不低于Q。第三法用于透皮貼劑儀器裝置同溶出度測定法中的槳法，但另用網碟固定透皮貼劑。將釋放介質加入溶出杯內，預溫至32℃±0.5℃;將透皮貼劑面朝上，再將網碟置于燒杯下部，并使貼劑與槳底旋轉面平行，兩者相距25mm±2mm,開始攪拌并定時定位取樣，取樣方法及余下操作同第一法。結果判定同第一法。6.中國藥典溶出度試驗的指導原則ChP(2005)對溶出度應用的主要指導原則是： (1)重點用于難溶性的藥品品種，一般指在水中微溶或不溶的。用于因制劑處方與生產工藝造成臨床療效不穩定的品種以及治療量與中毒量相接近的口服固體制劑(包括易溶性藥品),對后一種情況應控制兩個時間點的溶出量(第一點不應溶出過多)。(2)凡檢查溶出度或釋放度的制劑，不再檢查崩解時限。(3)轉速的設定，轉籃法以100r/min為主，槳溶出量至少為標示量的70%。(4)溶出介質應以水、0.1mol/L鹽酸、緩沖液(pH值3-8)為主；若介質中加適量有機溶劑如異丙醇、乙醇等或加分散助溶劑如十二烷基硫酸鈉(0.5%以下),應有文獻數據，并盡量選用低濃度，必要時應與生物利用度比對。(5)測定時，每個溶出杯中只允許投入供試品1片(粒、袋),不得多投。三、實驗方法含量均勻度取本品1片(10mg規格),置100ml量瓶中，加pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液(取磷酸二氫鉀13.6g,加適量水溶解并稀釋至1000ml,搖勻，調節pH值至4.5)40ml,振搖使溶解，用pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液適量，加pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液定量稀釋制成每1ml中含法莫替丁10μg的溶液，在266nm波長處測定吸光度；另精密稱取法莫替丁對照品適量，加pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液溶解，并定量稀釋制成每1ml中含10μg的溶液，同法測定，計算含量，共測定10片，應符合規定。溶出度取本品6片，照溶出度測定法(第一法),以pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液900ml為溶出介質，轉速為每分鐘100轉，依法操作，經30min時，取溶液10ml,濾過，精密量另精密稱取法莫替丁對照品適量，加pH4.5磷酸二氫鉀緩沖液溶解，并定量稀釋制成每1ml中含10μg的溶液，同法測定，計算出每片的溶出量。限度為標示量的80%,應符合規定。影響溶出度測定的因素有很多，主要包括儀器因素和試驗操作因素。采用溶出度校正片可確定溶出儀的性能狀態以及試驗操作是否規范，從而減少儀器因素和試驗操作因素的影響，測得供試品的真實溶出。(一)儀器因素溶出儀運轉時整套裝置應保持平穩，不能產生明顯的晃動或振動；試驗時，最好使用同一型號的儀器，以減小系統誤差。攪拌軸、槳葉、網籃以及溶出杯的內壁均不應有吸附反應或干擾供試品有效成分的測定。攪拌軸與溶出杯的中心度和垂直度應符合規定。各溶出杯大小一致、厚薄均勻。水浴溫度應均勻恒定，攪拌軸轉速應穩定。(二)試驗操作因素主要有溶出介質、轉速設置、過濾方法、取樣位置、轉籃干濕、儀器工作環境等。攪拌軸的轉速應比較溫和，以盡量模擬人體胃部和小腸的蠕動，人為地增加轉速，雖能使溶出加快，但并不能反映藥物在體內的真實溶出情況。絕大部分藥物制劑，由于不溶性輔料顆粒混懸在溶出介質中，必須過濾后才能測定；應使用惰性材料制成的濾器過濾，以免吸附藥物或干擾測定；如果過濾材料與藥物不發生相互作用，可反復濾過藥物的溶出液，使吸附飽和，然后取續濾液測定，也可避免因可能的吸附而造成的測定誤差。應采用標準介質量配套取樣器，在取樣孔內取樣，以保證取樣位置在轉籃或槳葉頂端至液面的中點，距溶出杯內壁10mm處(小杯法為6mm處)。采用轉籃法時，藥品應投入干燥的轉籃中。試驗時應排除外界的振動因素，保持環境溫度和濕度的相對恒定，避免強光照射，對光不穩定的藥物應避光操作。溶出介質對溶出度測定結果的影響如下：1.溶出介質的種類常用溶出介質有水、0.1mol/L鹽酸、緩沖液(pH值3～6.8,最高可達8.0)、人工胃液(pH1.2)和人工腸液(pH6.8);也可在介質中加適量有機溶劑(如異丙醇、乙醇)、表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉，一般小于0.5%)、酶(如胃蛋白酶、胰蛋白酶)等物質。溶出介質的種類對溶出度試驗結果的影響較大。通常，溶出介質首選水，因為只要制劑在水中的溶出度達到藥典規定標準，則該制劑的生物利用度和生物等效性一般不會有問題。USP(29)收載的700多個品種的溶出度試驗中，絕大部分以水為溶出介質。選擇溶出介質，還應考慮藥物本身的理化性質及制劑口服后在胃腸道中吸收的部位。大多數弱酸性藥物在胃中易于吸收，可選擇酸性溶液或人工胃液為溶出介質；對水溶性較差的藥物，可選用加有適量表面活性劑或有機溶劑的溶出介質。2.溶出介質的體積體積應盡可能大，以使藥物的溶出符合漏槽條件。一般一個劑量單位以900ml或1000ml溶出介質最為普遍，制劑規格較小時可使用常用體積的1/2～3/4。小杯法體積一般為100～250ml,以方便小劑量制劑在溶出度試驗中的定量分析，減小試驗試驗過程中，溶出介質的體積應保持不變。所以，不僅應對取樣時移出的介質量據實予以補充，并列入計算[ChP(2005)規定：多次取樣時，所量取溶出介質的體積之和應在溶出介質總體積的±1%之內，如超過總體積的1%,應及時補充溶出介質或在計算時加以校正],而且應注意溶出過程中的介質蒸(揮)發量，特別是在溶出時間較長、溶出介質體積較小時更應注意。試驗時為溶出杯配上適宜的蓋子，可防止介質蒸(揮)發。3.溶出介質中的氣體介質中溶解的氣體可產生化學干擾或物理干擾。(1)化學干擾主要包括改變溶出介質的pH值和藥物被氧化。在緩沖介質中，溶解的氣體對pH值影響較小，但當用水作介質時，影響較大，這主要由于空氣中的CO?溶于水后，形成H和HCO?而導致pH值下降。若藥物的溶解度受pH影響較大，則藥物的溶出度就會因介質中溶解的氣體而產生明顯差異。另外，某些輔料(特別是粘合劑)可能受pH值影響，致使制劑的崩解和解聚時間縮短或延長，影響藥物的溶出速率。因此，當用水作為溶出介質時，必須認真檢查、控制pH值。空氣中含有一定量的氧氣，當空氣溶入介質后，一些易氧化的藥物往往因氧化而明顯影響溶出度試驗結果。因此，對易氧化的藥物，溶出介質更應嚴格脫氣，必要時可通入惰性氣體(如N?)盡可能除去氧氣后，再進行脫氣處理。(2)物理干擾主要包括影響制劑的崩解、解聚和溶出，改變溶出介質的流型以及減小篩網的孔隙率。溶出介質中溶解的氣體由于減少了制劑與介質的接觸表面積，而使制劑的崩解和藥物的溶出受到影響；當制劑崩解成顆粒后，小氣泡能比較容易地附著在粗糙的顆粒表面，阻礙顆粒解聚，從而影響藥物的溶出速率。當溶出介質的溫度升高時，氣體在介質中的溶解度變小，此時氣體會以小氣泡形式從介質中逸出。小氣泡從下向上逸出的過程中，會影響溶出介質的流體動力學性質，使介質的流動類型發生改變而影響溶出度試驗結果(圖4-1)。另外，氣體受熱逸出時，一部分氣泡往往吸附在溶出杯壁、攪拌軸、槳葉、轉籃等固體表面。吸附在溶出杯壁上的氣泡會改變溶出介質在杯壁層的流型。吸附在攪拌軸及槳葉上的氣泡一般對溶出度測定影響較小；但吸附在轉籃上的氣泡會產生一層氣體屏障，阻礙藥物或小顆粒從轉籃內擴散出來，從總體上減少了轉籃的孔隙率，使藥物溶出減慢(圖4-2)。下下基于以上原因，ChP(2005)規定溶出介質應經脫氣處理。脫氣方法為：取溶出介質，在緩緩攪拌下加熱至約41℃,并在真空條件下不斷攪拌5min以上；或煮沸15min(約5000ml);或超聲、抽濾等其它有效脫氣方法。4.溶出介質的溫度ChP(2005)規定溶出介質的溫度為37℃±0.5℃,是指溶出杯內溶出介質的溫度，而不是指水浴的指示溫度。為使溶出介質的溫度均勻恒定，除儀器水浴溫度必須均勻恒定外，通常要給溶出杯加蓋，以防止溶出介質蒸(揮)發的冷卻作用。溫度對溶出速率的影響取決于藥物的溫度-溶解度曲線，有時溫度改變1℃,溶出速率的變化就可能大于5%,若每個杯內溶出介質的溫度均超出±0.5℃范圍，則誤差更明顯。5.溶出介質的流型變化流型的一致性是溶出度數據重復性和可靠性的保證。影響流型的因素較多，有攪拌軸的幾何形狀、垂直度和中心度、外部振動、轉速、氣泡、溶出杯規格、取樣位置等。此外，取樣后補加溶出介質亦會影響流型，這包括：加入介質時沖擊力對流型的影響；補充介質的溫度低于溶出杯內介質溫度時，介質的熱交換對流型的影響。為保證溶出介質的流型一致，應嚴格控制溶出度試驗條件。五、思考題1.什么是溶出度?什么是釋放度?溶出度試驗有何意義?2.影響固體制劑中藥物溶出的因素主要有哪些?影響溶出度測定結果的因素主要有哪3.什么是含量均勻度?含量均勻度檢查有什么意義?第五章藥物的含量測定藥物的含量是評價藥物質量優劣的主要指標之一。藥