分子標記技術分子標記簡介

主要內容分子標記相關概念分子標記的類型與發展幾種分子標記的應用一

分子標記相關概念

所謂分子標記是根據基因組DNA存在豐富的多態性而發展起來的可直接反映生物個體在DNA水平上的差異的一類新型的遺傳標記,它是繼形態學標記、細胞學標記、生化標記之后最為可靠的遺傳標記技術。1.廣義的分子標記(molecularmarker)是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質。蛋白質標記包括種子貯藏蛋白和同工酶（指由一個以上基因位點編碼的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位點的不同等位基因編碼的酶的不同分子形式）。分子標記的概念有廣義和狹義之分2.狹義的分子標記概念只是指DNA標記

能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，它直接反映基因組DNA間的差異。通常所說的分子標記是指以DNA多態性為基礎的遺傳標記。

分子標記技術本質上都是以檢測生物個體在基因或基因型上所產生的變異來反映基因組之間的差異。

1

分子標記發展簡史

1.1869年，瑞士醫生Miescher就開始了

核酸的研究。2.1930年提出兩種核酸(RNA和DNA)的概

念。3.1953年Waston和Crick提出了DNA雙螺旋結構及其半保留復制模型之后，對基因的DNA序列及其表達和調控等方面的研究取得了很大進展。4.20世紀60年代中期,從細胞中分離基因的工作拉開了基因工程的序幕。5.60年代末和70年代初,主要致力于研究基因的體外分離技術。6.1980年Bostern將生物個體之間DNA序列的差異作為標記用于遺傳作圖，從此開創了在DNA水平上研究遺傳變異的新階段。7.近10年來，在人類基因組研究計劃的推動下，分子標記的研究與應用得到迅速的發展。分子標記的歷史第一代分子標記技術RFLP（RestrictionFragmentLengthPolymorphism，限制性片段長度多態性）第二代分子標記技術

RAPD（RandomAmplifiedPolymorphicDNA，隨機擴增多態性DNA）AFLP（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，擴增片斷長度多態性）事實上，還有很多分子標記技術像SSR、ISSR、SRAP（相關序列擴增多態性）另外，還有現在號稱為第三代分子標記的SNP（單核苷酸多態性)

2

分子標記來源于DNA水平的突變突變(Mutation)是指DNA水平的可遺傳的變異，不管這種DNA變異能不能導致可檢測的表型或生化改變，突變產生的變異是自然選擇的基礎，可遺傳的突變在群體中擴散從而產生多態性。多態性(Polymorphism)－群體內同一DNA序列的兩種或多種變異形式，統計表明：群體內任何兩個生物個體平均每1000～10000個堿基對有一對有差別，這種差別就是多態性。3

分子標記的特點

(相對形態，細胞，生化標記具有的優點)：

（1）直接以DNA的形式表現，在生物體的各個組織、各個發育階段均可檢測到，不受季節、環境限制，不存在表達與否等問題；（2）數量極多，遍布整個基因組，可檢測座位幾乎無限；（3）多態性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創造；（4）表現為中性，不影響目標性狀的表達；（5）許多標記表現為共顯性的特點，能區別純合體和雜合體。理想的分子標記必須達以下要求：具有高的多態性共顯性遺傳，即利用分子標記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型能明確辨別等位基因遍布整個基因組除特殊位點的標記外，要求分子標記均勻分布于整個基因組選擇中性(即無基因多效性)檢測手段簡單、快速(如實驗程序易自動化)開發成本和使用成本盡量低廉在實驗室內和實驗室間重復性好(便于數據交換)。但是，目前發現的任何一種分子標記均不能滿足以所有要求二類型及原理

現已出現的分子標記技術有幾十種，部分分子標記技術所屬類型如下：建立在Southern雜交基礎上的分子標記技術限制性內切酶片段長度多態性標記(RFLP)；染色體原位雜交(CISH)。以重復序列為基礎的分子標記技術衛星DNA(SatelliteDNA)；小衛星DNA(MinisatelliteDNA)；簡單序列重復SSR(SimpleSequenceRepeat)，即微衛星DNA。以PCR為基礎的分子標記技術隨機擴增多態性DNA(RAPD)；擴增片段長度多態性(AFLP)；單鏈構象多態性(SSCP)；cDNA-擴增片段長度多態性(cDNA-AFLP

)；靶位區域擴增多態性(TRAP)；序列特征化擴增區域(SCAR)；相關序列擴增多態性(SRAP)。以mRNA為基礎的分子標記技術表達序列標簽(ESTs)；差異顯示(DD)；逆轉錄PCR(RT-PCR)；差異顯示逆轉錄PCR(DDRT-PCR)；特征性差異分析(RAD)；基因表達系列分析(SAGE)。以單個核甘酸的變異為核心的分子標記技術

單核苷酸多態性標記(SNP)以特定序列為核心的分子標記技術

線粒體DNA分子標記(mtDNA)三.幾種分子標記介紹

1.限制性片段長度多態性標記

RestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP：限制性片段長度多態性，為第一代多態性記。原理：限制性內切酶能識別并切割基因組DNA分子中特定的位點，如果因堿基的突變、插入或缺失，或者染色體結構的變化而導致生物個體或種群間該酶切位點的消失或新的酶切位點的產生，

那么利用特定的限制性內切酶切割不同個體的基因組DNA，

就可以得到長短、數量、種類不同的限制性DNA片段，通過電泳和Southern雜交轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜上,選用一定的DNA標記探針與之雜交，放射自顯影后就可得到反映個體特異性的DNA限制性片段多態性圖譜。RFLP原理：DNA限制性內切酶酶切電泳轉移到硝酸纖維素濾膜同位素或非放射標記（如地高辛等）的探針雜交膠片放射自顯影，顯示酶切片段大小RFLP的應用1.遺傳學圖的構建結合RFLP連鎖圖，任何能用RFLP探針檢測出的基因及其DNA片段都可以通過回交，快速有效地進行轉移。2.基因定位利用RFLP技術能夠準確地標記定位種質中的目標基因，結合雜交，回交及組織培養等技術就可以快速有效的將所需目標基因的DNA片段引入栽培品種中，實現品種改良。

3.遺傳多態性分析運用RFLP技術可以盡可能多地保存那些在已知位點上有異態的品系，以求最大程度地保持品種的多樣性。4.細胞質遺傳研究RFLP技術是對DNA序列自然變異的直接檢測，只需選擇適當的限制性內切酶或DNA探針作分子標記，因而對植物不同種屬或雜種后的細胞質遺傳變異及基因型的鑒定具有較高的靈活性和靈敏性，從而能較好地應用于細胞質遺傳的研究。限制性片段長度多態性(RFLP)優點標記廣泛存在于生物體內，不受組織、環境和發育階段的影響。RFLP標記的等位基因是共顯性的，不受雜交的影響，可區分純合基因與雜合基因。可產生的標記數目很多，可覆蓋整個基因組。缺點標記技術需要酶切,對DNA質量要求高；RFLP

的多態性程度偏低；分子雜交時會用到放射性同位素，對人體和環境

都有害；探針的制備、保存和發放也很不方便；分析程序復雜、技術難度大、費時、成本高。限制性片段長度多態性(RFLP)2.隨意擴增多態性DNA標記—RAPDRandomAmplifiedPolymorphismicDNA概念：RAPD技術建立于PCR技術的基礎之上，它是利用一系列不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈為引物，對所研究的基因組DNA進行PCR擴增，這些引物在一定的退火條件下，

與基因組DNA中的互不順序配對，通過DNA聚合酶的作用，能啟動DNA的合成，擴增產物經過聚丙酰胺或瓊脂糖凝膠電泳分析，經EB染色或放射線自顯影檢測。這些擴增產物（DNA片段）的多態性可以反映基因組相應區域的多態性。原理：1.利用一個隨機引物(一般為10個堿基)通過PCR反應非定點地擴增DNA片段；2.擴增片段經瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺電泳分離；3.溴化乙錠染色或銀染等專一性染色技術即可記錄RAPD指紋；

4.進行DNA多態性分析。隨機擴增多態性DNA(RAPD)RAPD技術流程：RAPD分子標記的應用RAPD技術已在苜蓿，豆類，番茄，遼東櫟，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花，月季，牡丹，錦雞兒，野大豆，桉樹，玉米，水稻等多種植物中廣泛應用。目前主要用于以下4個方面的研究：a：研究種質資源的親緣關系和遺傳背景。b：種質資源（含親本材料）的分類。c：種質的遺傳變異評價。d:核心種質篩選?；蜻B鎖圖的構建：Tulsieram等最早利用RAPD標記在胚乳組織進行白石杉的遺傳學圖構建，而后用相同的策略又相繼構建了濕地松、歐洲赤松、火炬松等的遺傳學圖。新遺傳資源的鑒定：李松濤等對抗銹病的兩個小冰麥進行RAPD分析，從40個引物中篩選到一個與抗銹基因連鎖的RAPD標記。分析結果有力地說明，小冰麥是從冰草獲得抗銹基因的易位系。優點：技術簡單，實驗周期短，信息量大，檢測速度快；DNA用量少；實驗設備簡單，不需DNA探針，設計引物也不需要預先克隆標記或進行序列分析；不依賴于種屬特異性和基因組的結構，合成一套引物可以用于不同生物基因組分析；用一個引物就可擴增出許多片段，幾乎覆蓋整個基因組，而且不需要同位素，安全性好。隨機擴增多態性DNA(RAPD)缺點：實驗的穩定性和重復性差顯性遺傳，不能識別雜合子位點，這使得遺傳分析相對復雜，在基因定位、作連鎖遺傳圖時，會因顯性遮蓋作用而使計算位點間遺傳距離的準確性下降；RAPD對反應條件相當敏感，包括模板濃度、Mg2+濃度，所以實驗的重復性差。隨機擴增多態性DNA(RAPD)3、簡單重復序列標記—SSR

（simplesequenceRepeats）

簡單序列重復(SSR)即微衛星DNA

微衛星是指以少數幾個核苷酸(1~6個)為單位

多次串聯重復的DNA序列。

微衛星由核心序列和兩側的保守側翼序列構成。保守的側翼序列使微衛星特異地定位于染色體某一區域，核心序列重復數的差異則形成微衛星的高度多態性。原理：由于重復次數的不同及重復程度的不完全造成了每個位點的多態性。根據其兩端的保守序列設計一對特異性引物，PCR擴增，再經聚丙烯酰胺凝膠電泳即可顯示不同基因型個體在這個SSR位點的多態性。簡單序列重復(SSR)

SSR基本步驟：(1)構建小片段或大片段的基因組。(2)篩選陽性克隆。通過傳統的影印或挑單菌落點膜的方法，把克隆轉移到尼龍膜上，經過固定后，用標記過的序列重復寡核苷酸或含微衛星序列的探針與尼龍膜上的克隆點雜交，篩選出其中的陽性克隆。(3)測序、設計引物、優化PCR反應條件，獲得的陽性克隆經過確認后，全部或經過隨機挑選后測序，然后根據微衛星序列兩側保守區域的序列設計引物，優化PCR擴增的條件，獲得穩定、可靠的SSR標記。應用是種群研究和進化生物學最常用的分子標記之一，廣泛地應用于生物雜交育種、遺傳連鎖圖譜、種群遺傳多樣性、系統發生等研究領域。簡單序列重復(SSR)微衛星標記的優缺點：

分布廣泛、多態性豐富、雜合度高、通用性好以及擴增反應所需模板量少、重復性好，共顯性遺傳、檢測方便、結果穩定。優點：缺點：SSR標記的建立首先要對為微衛星側翼序列進行克隆、測序、人工合成設計引物以及標記的定位、作圖等基礎性究，因而其開發有一定的困難，費用也很高。

4.擴增片段長度多態性標記—AFLP

AmplifiedFragmentLengthPolymorphism

1992年由荷蘭科學家Zabeau和Vos發展起來的一種檢測DNA多態性的新方法。定義由于單核甘酸突變或插入及缺失突變導致增加或減少限制性酶切位點，這種差異可通過選擇性的PCR擴增而檢測。AFLP是在RFLP的基礎上發展起來的，差別在于檢測手段。

AFLP的關鍵是設計選擇性擴增引物以及不同引物組合。原理：AFLP是建立在基因組限制性片段基礎上的PCR擴增。由于單核甘酸突變或插入及缺失突變導致增加或減少限制性酶切位點，這種差異可通過選擇性的PCR擴增而檢測使用特定的雙鏈接頭與酶切DNA片段連接作為擴增反應的模板,用含有選擇性堿基的引物對摸板DNA進行擴增,選擇性堿基的種類、數目和順序決定了擴增片段的特殊性,只有那些限制性位點側翼的核苷酸與引物的選擇性堿基相匹配的限制性片段才可被擴增。擴增產物經放射性同位素標記、聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,然后根據凝膠上DNA指紋的有無來檢出多態性.AFLP技術路線1.基因組DNA被酶切成小片段：通常用一個四個堿基識別位點的限制性內切酶如MseI和一個六個堿基識別位點的酶如EcoRI，其中MseI確保產生合適大小的DNA片段，這些片段能在序列膠上進行有效的分離；而六個堿基識別位點酶EcoRI能夠限制擴增片段數目，確保DNA多態性的正常檢測；2.接頭與酶切片段的連接：接頭序列包括：一個核心序列和酶切位點特異序列，MSE接頭和ECORI接頭，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；3.預擴增：應用一對引物對酶切片段進行第一輪擴增，目的是富聚目標片段，減少本底，擴增引物序列為接頭序列加一個選擇核甘酸。只有一端為EcoRI切點，一端為MseI切點的DNA酶切片段，同時也與選擇核甘酸配對的DNA序列才能被擴增。1～3步的產物可以通過Agarose膠檢測。4.選擇擴增：應用含有接頭序列和三個選擇核甘酸序列的引物進行選擇擴增。通過這一輪擴增，進一步降低擴增片段數量，同時一個引物被同位素或熒光染料標記（也可用銀染），電泳后壓片檢測。優點

1）非常高的基因型分析效率；

2）不需要標記開發成本，但是需要優化特異引物及引物組合；

3）不需要基因組DNA序列信息；

4）AFLP分析只需要很少量的DNA；(typically0.2to2.5μgperindividual).5）AFLP可應用于任何生物。缺點1）需要高質量的DNA，以確保酶切完全；2）從單個多態性DNA片段開發位點特異性標記相當困難；3）多數情況下采用的是同位素標記；4）在染色體上不均勻分布，AFLP標記經常在著絲粒附近區域高度聚集AFLP標記技術的應用遺傳連鎖圖譜的構建親緣關系和遺傳多樣性的研究種質資源鑒定分子標記輔助選擇育種基因表達和基因克隆SNP主要是指在基因組水平上由于單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。也即SNP是同一物種不同個體間染色體上遺傳密碼單個堿基的變化。

主要表現為基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態性，包括單堿基的轉換或顛換、以及單堿基的插入或缺失等。5.單核苷酸多態性標記(SNP)單核苷酸多態性標記(SNP)原理：

SNP與RFLP及SSR標記的不同有2個方面：其一，SNP不再以DNA片段的長度變化作為檢測手段，而直接以序列變異作為標記；其二，SNP

標記分析完全摒棄了經典的凝膠電泳，代之以最新的DNA

芯片技術。對成千上萬個克隆測序，用計算機分析數據和顯示最終結果。檢測DNA芯片技術，最新報道的微芯片電泳(Microchipelectrophoresis)，可以高速度地檢測臨床樣品的SNP。雜交型芯片將等位基因特異寡核苷酸共價固定在載體表面，用熒光標記引物擴增基因組DNA，再與芯片上的寡核苷酸雜交形成信號，并行讀取芯片上不同SNP熒光信號，獲得SNP信息。單核苷酸多態性標記(SNP)應用種群生物學特征、遺傳性疾病檢測、疾病關聯分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基因組作圖和數量性狀定位等方面也有越來越多的應用。單核苷酸多態性標記(SNP)優點

數量多，分布廣泛，檢測快速、

易于實現自動化，遺傳穩定性高。缺點成本高，錯誤信號多。四作物育種中分子標記技術的應用

一、品種、品系鑒定和雜交種純度分析

指紋圖譜是鑒別品種、品系的有利工具，具有快速、準確等優點。在市場經濟的條件下，指紋圖譜在檢測良種質量（真偽、純度），防止偽劣種子流入市場，保護名、優、特種質及育成品種的知識產權和育種家的權益等方面有重要意義。在國外，指紋圖譜用來鑒定作物品種的DUS（Distinctness，Unformity，Stability），為品種審定、保存、保護提供依據。

雜種優勢利用正成為許多作物提高產量和改善品質的重要途徑。對遺傳差異與雜種優勢關系的評價方法經歷了從形態性狀遺傳距離，到生化標記遺傳差異，親緣系數，以及分子標記遺傳差異等各種嘗試。

雜種優勢預測及機理研究DNA分子標記的應用，使得能夠在整個基因組范圍內對大量親本材料間的遺傳距離進行估測，并在此基礎上有效地預測具有強優勢的組合（Smith等，1992；Bernardo，1994）。結果：既有相關性很高的報道，又有完全相反的結果。分子標記雜合度與雜種優勢的相關性因遺傳材料而異，在經過改良的優良種質中，兩者之間高度相關，而在一些未經改良的優良種質中，相關程度很低。提出了“上位性是雜種優勢的主要遺傳基礎”的重要觀點。應用cDNA－AFLP技術進行雜種優勢機理的研究表明，強優勢與弱優勢組合間基因表達有明顯差異，有增強型、減弱型和沉默型。雜種優勢表現與單親沉默、雙單親沉默有密切關系。大量研究表明，雖然分子標記揭示的遺傳距離與雜種優勢的關系比較復雜，但親本之間的遺傳差異是產生的主要原因。通過對與雜種優勢相關QTLs效應的研究，可以加深對雜種優勢機理的了解。二、親緣關系分析

1.DNA標記所檢測的是作物DNA水平的差異，因而非常穩定，在分子圖譜幫助下對品種之間的比較可覆蓋，大大提高了結果的可靠性?？捎糜谄贩N資源的鑒定與保存，研究作物的起源與發展進化，雜交親本的選擇等。2.利用分子標記可以確定親本之間的遺傳差異和親緣關系，從而確定親本間遺傳距離，指導雜交育種親本選配，減少雜交組合數，有效劃分雜種優勢群，為提高育種效率提供依據。3.通過親緣關系分析，可以糾正形態分類中一些不恰當的結論以及目前育種工作中存在的一些問題。孟祥棟通過對洋蔥、胡蔥、大蔥的RAPD遺傳分析，否定了“胡蔥親緣關系與大蔥相近”的觀點，而發現胡蔥與洋蔥親緣關系較近，并推斷胡蔥可能是洋蔥與大蔥雜交后代逐漸進化而來的。大蔥洋蔥胡蔥

三、基因標記及標記輔助育種（Marker-assistedSelection，MAS）

許多性狀重要農藝性狀表現為質量遺傳特點，如抗病、抗蟲、雄性不育、自交不親和性等。質量性狀雖然受少數主基因控制，但其中的許多性狀仍受遺傳背景、微效基因及環境因素影響，表現為數量性狀特點。利用與目標性狀緊密連鎖的分子標記，是進行質量性狀選擇的有效途徑。標記目標性狀的方法主要有兩個：

（一）Young等人提出近等基因系法（Near-isog