一、任務來源

本國家標準的制定任務列入國家標準化管理委員會《國家標準委關于下達2018年第

二批國家標準制修訂計劃的通知》（國標委綜合〔2018〕41號），項目編號“20181041-T-424”。

該標準由中國標準化研究院提出并歸口，由清華大學等單位承擔該標準的制定任務。

二、標準制定目的和意義

數字PCR（dPCR）作為第三代PCR的技術代表，由Vogelstein等提出。dPCR是把一

個樣本的反應體系均勻分配到大量反應單元中，每個反應單元中不包含或包含一個到多個

目的核酸序列，獨立地進行PCR擴增，檢測每個反應單元的熒光信號，最終根據泊松分布

以及熒光信號陽性的反應單元數量占所有反應單元的比例，來計算目的核酸序列的拷貝

數，dPCR反應中熒光信號的產生過程基本與qPCR相同。目前，該技術已經在稀有突變檢

測、CNV分析和復雜樣本基因表達檢測等方面有著廣泛的應用。

本標準擬將dPCR技術應用到常見污染菌和致病菌的檢測體系構建中，為生產企業的

過程控制提供必要的技術保障，也為dPCR技術在其它污染菌和致病菌的檢測上的推廣奠

定基礎。

三、標準制定原則和依據

（一）標準編制原則

本標準以現有國內外相關標準規范為基礎，與現行國家標準和行業標準相銜接，主要

對微生物痕量基因殘留測定有關微滴數字PCR法的標準方法和流程進行規范，旨在對不同

工業微生物菌株的質量評價具有實用性和統一性。

（二）標準制訂主要依據

1、標準編寫遵循GB1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫規則》

的有關要求。

2、標準編寫內容參考的相關標準，包括：

GB/T14926.43-2001實驗動物細菌學檢測染色法、培養基和試劑

GB/T6682-2008分析實驗室用水規格和試驗方法

1

GB/T27403實驗室質量檢測規范食品分子生物學檢測

GB/T10092-2009數據的統計處理和解釋.測試結果的多重比較

ISO2602-1980測試結果的統計解釋均值的估計和置信區間

3、法律、法規及文件

《中華人民共和國標準化法》

《中華人民共和國標準化法實施條例》

《國家標準化體系建設發展規劃（2016—2020年）》

《深化標準化工作改革方案》

四、主要工作過程

1、組成標準起草小組

標準制定任務下達后，2018年6月，組成了標準起草工作組，明確了任務要求，安排

了工作進度，成立了標準起草工作小組，會議研究討論了工作小組的工作目標、任務分解、

可量化的考核指標，以及通過召開調研會、行業需求征集會、專家論證會和行業用戶推廣

會等，旨在制定微生物痕量基因殘留測定的微滴數字PCR法，且可以有效推行的國家標準。

2、開展相關調研情況

為了更好地制定標準，進行了方法調研、可行性調研，以及用戶需求調研等活動，從

行業需求層面、科學理論層面、方法學角度，以及實際可操作性等方面，對該標準進行了

多角度論證。

3、標準起草完善過程

依據GB/T1.1—2000《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫規則》、GB/T

1.2—2002《標準化工作導則第2部分：標準中規范性技術要素內容的確定方法》等標

準編制要求，對《微生物痕量基因殘留測定微滴數字PCR法》標準開展了研制工作，2018

年起草工作小組完成了《微生物痕量基因殘留測定微滴數字PCR法》國家標準（草案）。

并針對草案中的具體條件進行優化和擴展，2018年12月征求了專家意見，起草組按照專

家意見對標準內容進行了修改完善，形成了標準征求意見稿。

五、主要技術內容

數字PCR是將原始的擴增體系進行分割，對每個分割體系進行擴增和檢測，之后進行

數據分析，最終根據泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可直接給出待檢靶分子

的拷貝數濃度。全新的數字化終點檢測方式和分子計數的定量手段，賦予了數字PCR卓越

2

的性能，即無需標準曲線和參照，對影響PCR效率的抑制物不敏感，大大提高了檢測靈

敏度、精確度、準確度和重復性，并實現了真正意義上的絕對定量。

目前應用比較多的數字PCR是微滴式數字PCR和芯片式數字PCR。芯片式數字PCR是

應用的微流控芯片實現反映的分割，但芯片式數字PCR由于價格昂貴目前應用還比較少。

微滴式數字PCR是形成的油包水的微小液滴，該方法成本較低，應用較為普遍。

驗證實驗一

驗證材料：Lactobacillusplantarum提取的基因組；Saccharomycescerevisiae提

取的基因組。

方法驗證1：S.ce的引物和L.pl的引物特異性驗證

驗證過程：在PCR儀中用S.ce的引物分別擴增S.ce和C.al的基因組，用L.pl的引物

分別擴增L.pl和E.fa的基因組。對其產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。

驗證結果：如圖1所示，S.ce的引物擴增S.ce的基因組，獲得105bp的產物；S.ce的

引物擴增C.al的基因組，無擴增產物；L.pl的引物擴增L.pl的基因組，獲得71bp的產物；

L.pl的引物擴增E.fa的基因組，無擴增產物。驗證S.ce的引物和L.pl的引物特異性良好。

圖1S.ce的引物和L.pl的引物特異性驗證

方法驗證2：S.ce的探針優化

驗證過程：設計了3條不同的S.ce的探針，稱為SC-1，SC-2，SC-3。在實時熒光定

量PCR（qPCR）中分別使用3種不同的探針進行擴增。并通過數字PCR測得SC-1和SC-2

的陽性率進行對比。

驗證結果：qPCR結果如圖2所示，SC-2的信號更強，但SC-1的高本底熒光使得陰

性液滴信號更強，便于分析。數字PCR結果如表1所示，SC-1的陽性率對比SC-2沒有降

3

低。因此采用SC-1進行后續實驗。

圖2S.ce的探針優化

表1數字PCR中SC-1和SC-2的陽性率

樣品陽性液滴數陰性液滴數陽性率拷貝數

Sce-5x-SC-11410180000.07831.63*103

Sce-5x-SC-21261180000.07011.45*103

方法驗證3：L.pl核酸qPCR和dPCR檢測線性

驗證過程：在qPCR儀中對不同濃度的L.pl待測核酸樣品進行擴增，獲得相應的Ct

值數據；在dPCR儀中對不同濃度的L.pl待測核酸樣品進行擴增，獲得相應的拷貝數數據。

驗證結果：qPCR的結果如表2所示；dPCR的結果如表3所示；對數據進行整理分析，

以對應濃度的Ct值為橫坐標，拷貝數以10為底的對數為縱坐標繪圖，結果如圖3所示。

可以看出dPCR結果與qPCR結果展現出極高的線性關系，R2＞0.99，dPCR的檢測限可達

到2.22拷貝/微升。

表2不同濃度的L.pl核酸的qPCR檢測結果

濃度

26ng2.6ng260pg26pg2.6pg260fg26fg2.6fg

/μL

拷貝數

7.41*1067.41*1057.41*1047.41*1037.41*10274.17.410.741

copies/μL

Ct值15.518.522.526.529.733.5無法確定無法確定

表3不同濃度的L.pl核酸的dPCR檢測結果

濃度260pg26pg2.6pg260fg26fg2.6fg

4

ng/μL

拷貝數

7.41*1047.41*1037.41*10274.17.410.741

copies/μL

dPCR結果

4.55*1044.55*10246.719.94.442.22

copies/μL

圖3不同濃度的L.pl核酸的dPCR結果和qPCR結果的線性關系

方法驗證4：S.ce核酸qPCR和dPCR檢測

驗證過程：對不同濃度的S.ce核酸分別進行qPCR和dPCR驗證。

驗證結果：對qPCR和dPCR結果數據進行整理分析，如表4所示。dPCR可以達到

12.8拷貝/微升。

表4S.ce核酸qPCR和dPCR檢測結果

單菌落

濃度/μL57.1ng11.42ng5.71ng570pg0

菌液

Ct值--2629無法確定32.6

dPCR結果2.76*103

1.3*10457.512.80-

copies/μL1.63*103

驗證試驗二

驗證材料：目標基因1；目標基因2；目標基因3。

方法驗證1：目標基因1的ddPCR法檢測的溫度優化

驗證過程：對目標基因1的普通PCR反應程序中的退火溫度進行優化，設置退火溫度

5

為55℃，梯度差異為5℃，擴增反應結束后，將96孔板轉移到微滴檢測儀中進行檢測。

驗證結果：如圖4所示，從50℃~56.8℃的擴增反應效率差距不大，54℃時微滴數量

較多，且微滴比較密集，特異性較好，所以目標基因1的ddPCR反應的最佳退火溫度為

54℃。

1234567891011

圖4目標基因1的ddPCR法檢測的溫度優化結果

Fig.4TheoptimizationtemperatureresultofSalmonellabyddPCR

1:50.0℃;2:50.2℃;3:50.7℃;4:51.6℃;5:52.7℃;6:54.0℃;7:55.4℃;8:56.8℃;9:58.1℃;

10:59.2℃;11:60.0℃;

方法驗證2：目標基因2的ddPCR法檢測的溫度優化結果

驗證過程：設置目標基因2的PCR反應程序的退火溫度為55℃，梯度差異為5℃，擴

增反應結束后，將96孔板轉移到微滴檢測儀中進行檢測。

驗證結果：如圖5所示，50.2℃時微滴數量和質量都較好，所以目標基因2的ddPCR

反應的最佳退火溫度為50.2℃。

6

1234567891011

圖5目標基因2的ddPCR法檢測的溫度優化結果

Fig.5TheoptimizationtemperatureresultofStaphyloccocusaureusbyddPCR

1:50.0℃;2:50.2℃;3:50.7℃;4:51.6℃;5:52.7℃;6:54.0℃;7:55.4℃;8:56.8℃;9:58.1℃;10:59.2℃;11:60.0℃;

方法驗證3：目標基因