ICS65.150

B51

中華人民共和國國家標準

GB/TXXXXX—XXXX

螺旋藻種質資源鑒定評價技術規(guī)范

TheidentificationofArthrospiramaximaandArthrospiraplatensis

在提交反饋意見時，請講您知道的相關專利連同支持性文件一并附上

（征求意見稿）

（本稿完成日期：2018年11月2日）

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

GB/TXXXXX—XXXX

螺旋藻種質資源鑒定評價技術規(guī)范

1范圍

本標準規(guī)定了螺旋藻種質資源鑒定評價術語與定義、評價要求、試驗方法和結果判定。

本標準適用于鈍頂螺旋藻（Arthrospiraplatensis）和極大螺旋藻（Arthrospiramaxima）種質資源鑒

定。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

3術語與定義

下列術語和定義適用于本文件：

3.1

螺旋藻spirulina

一種光合放氧、呈規(guī)則螺旋形的原核絲狀微藻。

4要求

4.1樣本采集

應采集培養(yǎng)成熟的新鮮螺旋藻。樣本量分別按各類試驗項目的標準規(guī)定執(zhí)行。

4.2評價內容

4.2.1應包括螺旋藻的形態(tài)學特征和分子遺傳學特征。

4.2.2鈍頂螺旋藻藻絲應呈螺旋狀，無橫隔壁，在橫隔處有明顯的收縊，藍綠色，藻絲寬4~5微米，長

400~600微米，藻絲的頂端細胞鈍圓，無異形胞。

4.2.3極大螺旋藻藻絲應呈灰綠色，細胞寬7～9μm，長小于寬，螺間距70～80μm，頂端微尖，橫

壁不收縊，橫壁兩邊有顆粒。

4.2.3鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻應具有數(shù)目可變串聯(lián)重復序列（見附錄A）。

5試驗方法

5.1形態(tài)學特征

采用目視法和顯微鏡檢測。

1

GB/TXXXXX—XXXX

5.2分子遺傳學特征

5.2.1DNA提取

DNA提取步驟如下：

1）取0.5g鮮重的絲狀體或葉狀體，用蒸餾水洗滌3遍，液氮研磨后分別轉入含有5倍于藻體積

的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）緩沖液（含2%（v/w）CTAB，1.4MNaCL，20mMEDTA，100mMTris-HCL

（pH8.0），2%巰基乙醇）的離心管中；

2）65℃溫浴2h，期間每10min顛倒混勻2-3次；

3）離心管用臺式高速離心機12000rpm離心10min，把上清液加入到另一離心管中；

4）冷卻至室溫后，輕柔加入等體積的氯仿:異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻，重復3次；

5）用離心機12000rpm離心10min，取上清液至另一離心管中；

6）加入等體積的-20℃預冷異丙醇，輕輕顛倒混勻，于-20℃冰箱放置1h；

7）用離心機12000rpm離心10min；

8）棄上清液后，加入1mL的70％乙醇，洗兩次，再用無水乙醇洗一次；

9）倒去乙醇，再將DNA沉淀在超凈工作臺上吹干后；

10）加入100μL的TE緩沖液，完全溶解后，加5μLRNaseA（10mg/mL）至50μg/mL，37℃

溫浴1h；

11）加入等體積的酚:氯仿:異戊醇（25:24:1），顛倒混勻；

12）用離心機12000rpm離心10min，取上清液至另一離心管中；

13）重復步驟（11）和（12）；加蛋白酶K至200μg/mL，37℃溫浴1h；

14）重復步驟11、12；加2倍體積的無水乙醇、1/2體積的NaCl，混勻后在-20℃放置1h；

15）重復步驟（7）～（9），加100μL的TE緩沖液，室溫下放置1h～2h，直至DNA完全溶解；

16)取2μLDNA溶液，稀釋50倍，用核酸蛋白分析儀檢測其濃度與純度；

17)用0.8％的瓊脂糖凝膠檢測所提取的基因組DNA片段的完整性；將DNA溶液用TE緩沖液稀釋至100

ng/μL的濃度，置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

5.2.2PCR擴增與檢測

擴增正向引物為5’-GAACATTTACGGTTTTAC-3’，反向引物為5’-CCTTACCAGTCCCACACC-3’。

PCR擴增反應體系為25μL，含2.5μL10×PCRBuffer，10ng模板DNA，2.5mmol/LMg2+，1.5UTaq

酶，200nmol/L引物，200μmol/LdNTP，最后添加無菌ddH2O至總體積為25μL。

PCR擴增具體程序為94℃預變性5min，94℃變性30s，60℃復性30s，72℃延伸1min，35個

循環(huán)后，72℃延伸10min，PCR擴增結束后對PCR產物進行電泳檢測。

5.2.3測序

PCR擴增完畢，取7μL擴增產物加3μL溴酚藍后在1%瓊脂糖凝膠中電泳1h，經EB染色后在紫外燈

下觀察結果。使用DNA片段膠回收試劑盒回收并純化目的片段。

2

GB/TXXXXX—XXXX

將回收的目的片段同PMD18-T載體進行連接（目的片段和載體的摩爾比為5:1，所用的連接酶為高

活性的T4連接酶），然后通過熱激轉化法進行細菌轉化。

用質粒純化試劑盒從細菌克隆中提取和純化質粒DNA。

純化后的質粒DNA在DNA測序儀上采用Sanger雙脫氧鏈終止法原理在兩端同時進行測序。

6結果判定

具備形態(tài)學特征和分子遺傳學特征的樣品為合格種質資源。

3

GB/TXXXXX—XXXX

AA

4

GB/TXXXXX—XXXX

BB

附錄A

（規(guī)范性附錄）

數(shù)目可變串聯(lián)重復序列

A.1鈍頂螺旋藻VNTR序列

AAGCGATCGCATCTCAACTTCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTTCCGTCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACT

TCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTTCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCG

CATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGTGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGT

CAAGTGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGTGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAATCCCA

ATTGCTATCACGCCTAGAATCCCAGGTAGAAGCGATCGCATTTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAATCCCAATTGC

TATCACGCCTAGAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCCGTCCCAGAGT

CAAGCGATCGCATCTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCC

ATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCGACGAGTCGATAACTGAAGCCGTGGCAGACATTACTTCCATCGTGTC

A.2極大螺旋藻VNTR序列

AAGCGATCGCATCTCAGCTTCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAAATCCAATCCCAGAGTCAAGCGATACGCATCTCAAC

TCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATC

ACATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAATCCCAATTGCTATCACGCCTAGAATCCCAGGTAGAAGCGATCGCATC

TCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATCTCAACTCCAATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATTTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAG

CGATCGCATCTCAACTCCCATCCCAGAGTCAAGCGATCGCATC