論文免疫抑制模型的建立及其免疫功能檢測學院：臨床醫學院專業：臨床醫學七年制學號：姓名：小鼠免疫抑制模型的建立及其免疫功能檢測摘要：目的利用環磷酰胺（CTX）構建小鼠的免疫抑制模型，并檢測其免疫功能。方法用OVA作為抗原免疫小鼠，再用CTX進行免疫抑制，加強免疫后，進行免疫功能檢測。結果OVA抗原刺激的小鼠均有免疫反應，注射了CTX的小鼠出現免疫功能下降，但抑制效果不佳，仍可檢測到免疫功能。結論小鼠免疫抑制模型未建立成功，但是可證實給正常小鼠注射CTX可以減弱其免疫功能。關鍵詞：環磷酰胺免疫抑制模型免疫功能檢測TheestablishmentofimmunosuppressivemodelandimmunefunctiontestingWenXingguiAbstract：ObjectiveUsingcyclophosphamide(CTX)constructsamodelofimmunosuppressivemice,andtesttheimmunefunction.MethodUsingOVAasantigenstimulatemice,andinhibitthefunctionofimmunesystem,afterstrengthentheimmuneresponse,testtheimmunefunction.ResultThereareimmuneresponsesinmicewhicharestimulatedbyOVA,butthere’snoimmuneresponseinthemiceinjectedCTX.ConclusionInjectingCTXtonormalmicecanconstructimmunosuppressivemodel.Keywords：CTX，Immunosuppressivemodel，Immunefunctiontesting環磷酰胺(cyclophosphamideCTX)作為一種細胞毒化療藥物，同時也屬于烷化劑類免疫抑制劑，其作用主要是破壞DNA的結構，從而阻斷其復制，導致細胞死亡。而在免疫毒理學中，環磷酰胺是制備免疫抑制模型的常用藥物[1]。本實驗利用環磷酰胺的免疫抑制作用，對ICR小鼠進行免疫抑制，然后通過檢測其細胞免疫功能、體液免疫功能、吞噬細胞功能檢測其免疫功能，檢驗免疫抑制模型是否建立成功。1.材料與方法1.1材料1.1.1實驗動物：ICR小鼠，♀，20-22g，清潔級，購于吉林大學實驗動物中心。1.1.2主要試劑：CTX（山西普德藥業有限公司）、生理鹽水、以氫氧化鋁為佐劑的卵清蛋白（OVA）抗原活性物質、5%FCS-IMDM培養液、刀豆蛋白（ConA）（10μg/ml)、白細胞計數液（2%冰醋酸）、MTT（5mg/ml)、二甲亞砜（DMSO)、磷酸鹽緩沖液（PBS）、PBS-Tween20洗液、BSA封閉液、酶標抗體（HRP-GaM）、顯色底物、終止液（H2SO4）、3%淀粉溶液、印度墨汁1.1.3主要儀器：無菌96孔培養板、細胞計數板、顯微鏡、細胞培養箱（37℃5%CO2)、酶標儀、離心機、超凈臺、水浴箱、稀釋板、酶標板、培養箱43℃1.2方法1.2.1免疫抑制模型的建立將清潔級ICR小鼠按圖1隨機分為四組。初次免疫，第1天，NS-NS、CTX-NS組按0.5ml/只注射生理鹽水（NS），NS-OVA、CTX-OVA組按0.5ml/只注射OVA-AL(OH)3。分別在第8、10、12、14天給CTX-OVA、CTX-NS組按100mg/kg注射CTX進行免疫抑制。第15天，給注射NS-NS、CTX-NS組按0.5ml/只注射NS；NS-OVA、CTX-OVA組按0.5ml/只注射OVA-AL(OH)3進行加強免疫。（以上注射方法均以頭頸部皮下三點注射0.25ml，腹部注射0.25ml。）NSNSNSOVACTXNSOVA圖1小鼠分組示意圖1.2.2細胞免疫功能檢測（淋巴細胞轉化試驗）單細胞懸液的制備：小鼠摘眼球取血，室溫放置2h后，離心分離血清，4℃保存備用。小鼠脫臼處死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。于超凈臺內取出脾和胸腺組織(各1/2)，分別放入預先盛有3mlIMDM培養液的平皿內。將3-4層紗布覆蓋到組織上，用直頭鑷子固定組織，用彎頭鑷子輕壓組織，將其搗碎。然后用1000μl加樣器隔著紗布將細胞懸液吸出，放入1.5mlEP管中，做好標記。細胞計數：分別取上述制備好的細胞懸液混勻后取出20μl加到EP管中，加入980μl計數液，混勻后在顯微鏡下計數。調細胞濃度至1×107/ml，所需量為1ml。設原細胞濃度為X，需要的細胞懸液體積為Aml,可按公式：X/ml×Aml=1ml×1×107/ml計算出配比體積。在稀釋前一定將原細胞懸液混勻，否則細胞長時間沉淀使細胞數不準。細胞培養：按圖2所示在96孔培養板上加樣，將板做好標記，在倒置顯微鏡下觀察細胞，然后放于37℃5%C02培養箱中，培養48小時。MTT摻入：（48-72h后）：在終止培養前2小時，在顯微鏡下觀察細胞轉化情況。每孔內加入MTT（5mg/ml)10μl，加完后輕輕搕板，使MTT和細胞混勻。在37℃5%C02培養箱中繼續培養2小時后，輕輕吸棄上清，（注意不要將孔底部的顆粒物棄出）。加入100μl二甲亞砜（DMSO)，將顆粒溶解。結果測定：結果測量：用酶標儀測定光密度值A570nm（用空白孔調零），記錄結果。結果判定：SI（刺激指數）=ConA刺激孔A值/對照孔A值。1-34-67-910-12Cspleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10μg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10μg/mlD

spleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10μg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10μg/mlEspleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10μg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10μg/mlF

spleen

cell+

5%

IMDMspleen

cell+

ConA

10μg/mlthymus

cell+

5%

IMDMthymus

Cell+

ConA

10μg/mlNSNS-NSNS-OVAACTX-NSCTX-OVA圖2細胞培養加樣示意圖（所加細胞懸液、IMDM、ConA體積均為100μl）1.2.3體液免疫功能—B細胞功能檢測1.2.3.1雙向免疫擴散試驗（檢測抗OVA抗體）①標記：用玻璃筆在載玻片正面標記好小鼠所屬組別。②制備瓊脂凝膠：1.5%瓊脂在微波爐內加熱至完全溶解。③鋪膠：將刻度吸管預熱后，用刻度吸管吸取5ml瓊脂加在載玻片表面，冷卻15min后形成均勻的瓊脂凝膠。④倍比稀釋抗血清：取4個酶聯管，做好標記；先加入生理鹽水50ul/管；在第一管中加入50ul抗血清（為之前4℃冷藏的分離血清），混勻后吸出50ul加入第二管，依次類推，進行倍比稀釋，稀釋度依次為1:2，1:4，1:8及1:16。⑤打孔：待瓊脂凝固后，按照打孔紙樣打孔，每張載玻片打兩組梅花孔。⑥加樣：按圖3所示加樣，Ag和Ab每孔加滿為止（將加樣器頭插入孔底，緩慢加入液體，直到孔滿）。⑦孵育：放入濕盒，37℃擴散24小時。生理鹽水1:1生理鹽水1:1Ag(OVA0.1mg/ml）1:161:2待測血清（不同稀釋度）1:81:4圖3雙向免疫擴散加樣示意圖1.2.3.2酶聯免疫吸附試驗（ELISA）①包被：用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原(OVA）稀釋（10μg/ml)。100μl/孔加入聚苯乙烯酶標板中。②封閉：棄去孔內溶液，加入150μl/孔2%BSA（封閉液），43℃，60mins。③加樣：棄去封閉液，按圖4加倍比稀釋的待測免疫血清100μl/孔，43℃孵育40mins；孵育結束后，用PBS-T洗液加滿孔，每次3min，洗三次，在吸水紙上排干液體。④酶抗：酶標抗體(HRP-羊抗鼠IgG)，100μl/孔，置43℃孵育40mins，用PBS-T洗三次，每次3min，在吸水紙上排干液體。⑤顯色：于各反應孔中加入新鮮配制的底物溶液100μl/孔，室溫下避光顯色。⑥終止：加50μl/孔2M硫酸(終止液)。⑦判定：肉眼觀察：與陰性對照孔相比有明顯呈色反應的為陽性孔，相對應的最高抗體稀釋度為該抗體的效價。酶標儀測量：490nm濾光片下測光吸收值(A)，與陰性對照孔A值相比其比值≥2，相對應的最高抗體稀釋度為該抗體的效價。（操作中只采用了肉眼觀察方法。）圖4酶聯免疫吸附試驗加樣示意圖1.2.4吞噬細胞功能檢測（小鼠腹腔巨噬細胞吞噬印度墨汁試驗）實驗前2天，給全部小鼠腹腔注射5％淀粉溶液1ml。頸椎脫臼處死小鼠，剪開小鼠腹部皮膚，用鑷子提起腹膜，用剪刀剪開一小口，用1000μl加樣器向腹腔打入2ml培養液，反復沖洗腹腔，吸出腹腔液放入EP管中。每組樣品取1張載玻片，做好標記。分別加兩滴100ul腹腔液，其中一滴加5ul墨汁，置濕盒中，37℃孵育1h。用生理鹽水洗掉未貼壁細胞和墨汁，蓋好蓋玻片后，顯微鏡下觀察，用40倍鏡查找觀察100個巨噬細胞，計數其中未吞噬墨汁的巨噬細胞數、吞噬了墨汁的巨噬細胞數，計算吞噬百分率。吞噬百分率:有吞噬作用的巨噬細胞數／100×100％。小鼠腹腔液小鼠腹腔液+印度墨汁小鼠腹腔液小鼠腹腔液+印度墨汁圖5小鼠腹腔巨噬細胞吞噬印度墨汁試驗加樣示意圖 結果2.1淋巴細胞轉化試驗結果用酶標儀測定96孔培養板光密度值A570nm（用空白孔調零），記錄結果并計算刺激指數，SI（刺激指數）=ConA刺激孔A值/對照孔A值，所得結果如表1所示。由所得數據計算平均值得：脾淋巴細胞：SI（NS-NS）為=average(B3:B6)1.32125，SI(NS-CTX)為=average(C3:C6)0.97275，SI(NS-OVA)為=average(D3:D6)1.3885，SI(CTX-OVA)為=average(E3:E6)1.05525；胸腺淋巴細胞：SI（NS-NS）為=average(F3:F6)1.11825，SI(NS-CTX)為=average(G3:G6)0.9845，SI(NS-OVA)為=average(H3:H6)1.13875，SI(CTX-OVA)為=average(I3:I6)1.02225。由數據結果可得，抑制組的抑制效果雖然不好但是與對照組相比值明顯小了，說明CTX對淋巴細胞功能有抑制作用。SpleenThymusNS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVANS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA11.7551.0431.6151.1751.1340.7441.2681.20821.020.951.451.011.0691.0631.0240.99631.230.961.241.151.1811.1211.1381.04441.2800.9381.2490.8861.0891.0101.1250.841平均值=average(B3:B6)1.32125=average(C3:C6)0.97275=average(D3:D6)1.3885=average(E3:E6)1.05525=average(F3:F6)1.11825=average(G3:G6)0.9845=average(H3:H6)1.13875=average(I3:I6)1.02225表1淋巴細胞轉化試驗結果2.2體液免疫功能檢測2.2.1雙向免疫試驗結果抗原抗體在瓊脂凝膠中濕盒37℃擴散48h后檢查結果，結果如表2，NS-NS組、NS-CTX組結果均為陰性，NS-OVA組最高稀釋倍數為1:16，而CTX-OVA組出現兩個陽性數據，與理論結果不符，說明免疫抑制模型建立為成功，但從所得數據結果可知免疫功能減弱。NS-OVA組結果如圖6所示。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA1陰性陰性1:16陰性2陰性陰性1:41:23陰性陰性1:81:14陰性陰性1:8陰性表2雙向免疫擴散結果NS1:1NS1:11:161:21:161:21:81:41:81:4NS-OVACTX-OVA圖6組1雙向免疫擴散結果示意圖2.2.2酶聯免疫吸附實驗結果酶標板顯色結果如表3所示僅兩個數據組有抑制效應，但并不理想。而從抗體效價的數據看，各組稀釋倍數均較高，說明各對照組實驗較成功。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA11:160陰性1:20480陰性2陰性1:1601:819201:128031:6401:6401:102401:16041:12801:801:20480陰性表3酶聯免疫吸附試驗結果2.3吞噬細胞功能檢測顯微鏡下觀察結果，計數并計算吞噬細胞吞噬率所得結果如表5所示，雖然有幾組異常數據，且抑制組數據結果也提示一直模型沒有建立成功，但由平均值可以看出與對照組相比，抑制組的巨噬細胞吞噬百分比顯然低，可以說明雖然沒有得到抑制效果，但是巨噬細胞功能被明顯減弱。NS-NSNS-CTXNS-OVACTX-OVA1100%100%無細胞0265%50%59%53%331%8%25%23%476%35%72%43%平均值=average(B2:B5)68%=average(C2:C5)48.25%=average(D3:D5)52%=average(E2:E5)29.75%表4吞噬細胞功能檢測結果3.討論環磷酰胺作為一種免疫抑制劑，已有大量研究表明其能抑制動物的體液和細胞免疫應答，造成動物的免疫抑制[2-4]。構建免疫抑制模型時，環磷酰胺可抑制各種動物的體液與細胞免疫應答，機體免疫功能下降可表現在諸多方面[5]。本實驗利用其免疫抑制作用多小鼠進行免疫抑制建立免疫抑制模型，并通過對淋巴細胞功能、體液免疫功能及吞噬細胞功能的檢測來檢驗免疫抑制模型的建立是否成功。有研究表明，環磷酰胺可引起小鼠脾T淋巴細胞和B淋巴細胞增值能力下降[6]。本實驗中淋巴細胞轉化試驗結果顯示抑制組脾淋巴細胞的刺激指數小于對照組，提示環磷酰胺對脾淋巴細胞的增殖有抑制作用，結果與研究相符，且胸腺中抑制組淋巴細胞的刺激指數也小于對照組，共同提示淋巴細胞的增值能力被抑制。由體液免疫功能的檢測結果可得雖然在抑制組中仍可檢測到抗體效價，但與對照組相比較，可檢測到的抗體稀釋倍數遠小于對照組，提示B細胞增殖被抑制，產生抗體的能力降低。因此環磷酰胺對小鼠淋巴細胞確有毒性作用，可抑制其增殖。雖此次實驗的抑制模型未建立成功，但證實了環磷酰胺對免疫功能有抑制作用。有實驗證明，以20mg/kg體重的CP每日給荷瘤鼠，連續7次，巨噬細胞吞噬率和吞噬指數沒有明顯變化[7],本實驗中小鼠腹腔巨噬細胞功能檢測結果中，抑制組小鼠巨噬細胞的吞噬百分比明顯低于對照組，且有數據表明吞噬百分比為0，提示巨噬細胞功能降低，此結果與相關研究相符。此次試驗的免疫抑制模型歲構建不成功，但是仍從各細胞免疫功能、體液免疫功能及固有免疫功能三個方面證實了環磷酰胺對免疫系統具有抑制作用。對于此次試驗失敗的原因，可能有幾點原因，一是實驗規模有限，數據不具有統計意義；二是操作不夠嚴格規范，過程中可能有污染，丟失等造成實驗結果與理論結果偏離；三是由于條件有限，各實驗儀器、試劑等規格不夠精確，造成實驗測量、本身反應等有誤差，造成實驗結果的不符。本次實驗雖未能成功建立小鼠免疫抑制模型，但在一定程度上證實了環磷酰胺對小鼠免疫功能起到了一定抑制作用。4.參考文獻：[1]PELAEZB,CAMPILLOJA,LOPEZ一ASENJOJA,etal.Cyclophosphamideinduces