第十一章分子生物學實驗技術

TechniquesofMolecularBiology

111.1

基因組DNA的抽提與檢測ExtractionanddetectionofgenomicDNA11.2總RNA的抽提與檢測ExtractionanddetectionoftotalRNA11.3聚合酶鏈式反應（PCR）Polymerasechainreaction11.4DNA重組技術DNARecombinanttechnology311.5重組質粒DNA的提取與酶切鑒定ExtractionandenzymaticidentificationofrecombinantplasmidDNA11.6外源基因在大腸桿菌中的誘導表達和鑒定InducedexpressionandidentificationofexogenousgenesinE.coli11.1

基因組DNA的抽提與檢測ExtractionanddetectionofgenomicDNA一、基本原理和應用真核生物的一切有核細胞（包括培養細胞）都能用來制備基因組DNA真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細胞核內的，因此制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質、脂類和糖類分離，又要保持DNA分子的完整性制備基因組DNA是開展基因結構和功能研究的基礎5DNA抽提方法酚抽提法CTAB（十六烷基三乙基溴化銨）法異硫氰酸胍法Chelex-100法……6二、主要儀器7三、主要試劑及其作用8試劑作用原理功能SDS(十二烷基磺酸鈉)破壞細胞膜、核膜，并使組織蛋白變性釋放DNA

(fromnucleusandproteins)蛋白酶K降解細胞膜及核小體中的蛋白RNase消化RNA去除組織中的RNAEDTA螯合DNase所需輔助因子的Ca2+保持DNA分子的完整酚/氯仿/異戊醇使蛋白質變性去除蛋白質乙醇沉淀DNA使DNA從溶液中析出三、實驗步驟（以動物組織為例）制備組織勻漿細胞裂解與蛋白消化酚抽提沉淀DNA洗脫、干燥溶解9核酸電泳檢測樣品制備提取DNA檢測微量分光光度計測定DNA濃度四、DNA的檢測

定性檢測：核酸電泳檢測10四、DNA的檢測定量檢測：微量核酸蛋白測定儀測定DNA的濃度11Q1.核酸電泳檢測不到DNAA：1）實驗材料不新鮮，導致DNA降解2）試劑失效3）DNA沉淀洗脫等步驟操作不當4）核酸染料未添加Q2.核酸電泳條帶彌散A：1）實驗材料不新鮮，導致DNA降解2）實驗操作動作較大，DNA斷裂

3）電泳時電壓不穩12五、常見問題及注意事項Q3.OD260/OD280

比值＜1.8A：提取的過程中發生蛋白質污染Q4.

OD260/OD280

比值>2.0A：提取的過程中發生有機溶劑污染13五、常見問題及注意事項傾斜吸取DNA溶液1411.2總RNA的抽提與檢測ExtractionanddetectionoftotalRNA15一、RNA提取方法及原理

異硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）胍鹽/β-巰基乙醇法以及一些其他方法一、提取方法及原理異硫氰酸胍－苯酚法（Trizol法）Trizol是一種總RNA抽提試劑，能夠直接從細胞或組織中提取總RNA。Trizol內含異硫氰酸胍(

Guanidinethiocyante)等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶，使RNA與蛋白質分離，加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA進入水相，離心后RNA保留在水相中，DNA和蛋白質則在有機相中，轉移水相，加入異丙醇沉淀RNA，得到純化的總RNA。提取RNA是進行基因表達分析的基礎二、主要試劑17試劑作用原理功能Trizol使蛋白質變性，裂解細胞釋放細胞中的核酸物質氯仿抽提酸性苯酚分離有機相和無機相異丙醇通過-OH的疏水作用使得RNA鏈中的親水基團受到保護沉淀RNA75%乙醇去除鹽分DEPCH2O（diethylpyrocarbonate），焦碳酸二乙酯處理的一級水通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性抑制RNA酶的活性三、實驗步驟（以動物組織為例）18組織勻漿化分離階段RNA的沉淀RNA的漂洗RNA的溶解電泳分析總RNAOD值分析總RNA19檢測OD值電泳高質量RNA定義:濃度，純度完整度四、實驗結果分析四、實驗結果分析濃度測定樣品在260nm和280nm處的光吸收值，確定RNA的濃度純度OD260/OD280在1.8~2.0視為抽提的RNA純度很高OD260/OD280小于1.8，說明有蛋白或者苯酚污染OD260/OD280大于2.0，可能被異硫氰酸胍污染20四、實驗結果分析RNA電泳普通瓊脂糖凝膠電泳：可分開不同的RNA條帶，能快速檢測所提RNA的完整度，但是無法判定其分子量變性瓊脂糖凝膠電泳:可判定RNA的完整度，也能測定RNA的分子量21五、注意事項及有效措施RNA易降解、RNA酶穩定，并廣泛存在1）、嚴格戴好口罩，手套

2）、實驗所涉及的離心管，Tip頭，移液器桿，電泳槽，實驗臺面等要徹底處理。

3）、實驗所涉及的試劑/溶液，必須確保RNase-Free4）、實驗全過程在低溫環境下操作

222311.3聚合酶鏈式反應（PCR）Polymerasechainreaction24

1985年KaryMullis創立了PCR技術1987年完成了自動化操作裝置1993年獲得諾貝爾化學獎

一、PCR技術的來源聚合酶鏈式反應（PCR）是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的方法。以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶作用下，以dNTPs為底物，按照半保留復制原理，通過變性、退火、延伸三個步驟不斷重復完成新DNA合成。25二、PCR技術的原理26科學研究Scientificresearch疾病診斷Diseasediagnosis人類基因組工程HumanGenomeProject法醫Forensic腫瘤Thetumor檢疫Quarantine其他……

other...27三、PCR技術的應用四、PCR反應系統DNA模板DNATemplate引物primer脫氧核糖核苷三磷酸

deoxy-ribonucleosidetriphosphateTaqDNA聚合酶TaqDNApolymerase緩沖液buffer28DNA模板DNATemplate單、雙鏈DNA模板RNA模板，需先逆轉錄成cDNA質粒模板高分子量的DNA（如基因組DNA）模板DNA模板的用量，應用ng級的DNA樣本29引物primer兩段與待擴增靶DNA序列互補的寡核苷酸片段決定PCR擴增片段長度、位置和結果30堿基互補配對原則引物的最佳長度為20～24個核苷酸兩個引物之間不應發生互補，避免產生“引物二聚體”兩條引物的(G+C）%含量組成應均勻引物內部應避免形成明顯的次級結構31引物設計要點是指引物和模板結合時候的溫度參數引物的退火溫度決定PCR特異性與產量合理的退火溫度從55℃到70℃32引物退火溫度Ta=Tm-5℃=4(G+C)+2(A+T)-5℃A，T，G，C分別表示相應堿基的個數引物設計常用軟件33單機版軟件：PrimerPremier系列、Oligo系列、Omiga、DNastar在線軟件：Primer-Blast、Primer3脫氧核糖核苷三磷酸

deoxy-ribonucleosidetriphosphatedNTP的質量與濃度和PCR擴增效率密切相關常用的濃度為50～200μM，不能低于10～15μM四種dNTP的濃度應相同34TaqDNA聚合酶

TaqDNApolymerase最早來自于嗜熱水生菌催化PCR反應常用的分為rTaq酶和LTaq酶兩類35PCR緩沖液PCRbuffer10～50mM的Tris–HCl緩沖液（pH8.3）+1.5mMMgCl二價陽離子的存在至關重要，影響PCR的特異性和產量Mg2+過量易生成非特異性擴增產物，Mg2+不足易使產量降低Mg2+其濃度變化范圍為1～10mmol/L36PCR循環次數37一般為25～40個循環循環次數過多，非特異性背景嚴重循環次數太少，產率偏低38五、PCR反應體系及步驟PCRMixtur：TemplateDNA1

l(10ng)Primer11

l(10M)Primer21

l(10M)dNTPs2

l(10mMeach)TaqDNApolymerase0.5

l(5U/l)10×buffer2.5

lddH2O17

lTotal25

l將PCR反應