第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術及應用本節(jié)聚焦什么是培養(yǎng)基？如何配制？什么是無菌技術？怎樣進行酵母菌的純培養(yǎng)？

向經(jīng)過殺菌處理的牛奶中添加對人體有益的乳酸菌，再經(jīng)過發(fā)酵就可以制成酸奶，在家里自制酸奶雖然方便，但是食用自制酸奶導致腸胃不適的事件屢見不鮮，主要原因是在制作過程中有雜菌混入。

怎樣才能保證無處不在的

雜菌

不混入發(fā)酵物中呢？從社會中來討論：（微生物）

難以用肉眼觀察的微小生物的統(tǒng)稱，包括

及一些

等。

本章提及的微生物主要指用于發(fā)酵的

。微生物概述（P9右下角相關信息）細菌、真菌、病毒原生生物細菌和真菌實驗室培養(yǎng)微生物有什么要求呢？微生物的純培養(yǎng)無菌技術培養(yǎng)基的配制

一方面要為人們需要的微生物提供

；另一方面要確保

，并將需要的

。實驗室培養(yǎng)微生物有什么要求呢？合適的營養(yǎng)和環(huán)境條件其他微生物無法混入微生物分離出來研究和應用微生物的前提

（發(fā)酵工程的重要基礎）——防止雜菌污染，獲得純凈的微生物培養(yǎng)物實驗室培養(yǎng)微生物有什么要求呢？實驗室培養(yǎng)微生物確保其它微生物無法混入分離需要的微生物提供微生物生長繁殖所需營養(yǎng)和環(huán)境條件微生物的純培養(yǎng)無菌技術培養(yǎng)基的配制Part1培養(yǎng)基的配置Mediumconfiguration【自主探究】請結(jié)合教材P9-10，思考這些問題。1.什么是培養(yǎng)基？2.培養(yǎng)基的用途有哪些？3.培養(yǎng)基的種類有哪些？4.培養(yǎng)基的必備營養(yǎng)成分有哪些？5.配制培養(yǎng)基時，如何滿足不同微生物的特殊需求？舉例說明。1.概念：人們按照微生物對

的不同需求，配制出供其_________的營養(yǎng)基質(zhì)。2.作用：用以

微生物或

。3.類型：固體培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)生長繁殖培養(yǎng)、分離、鑒定、保存積累其代謝物課本P9液體培養(yǎng)基按物理性質(zhì)：液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基（半固體培養(yǎng)基）微生物在固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部生長，可以形成肉眼可見的菌落（擴大培養(yǎng)、工業(yè)生產(chǎn)）（分離、計數(shù)、鑒定等）加入凝固劑(如瓊脂)是一種從紅藻中提取的多糖。在98℃以上熔化，在44℃以下凝固，在常規(guī)培養(yǎng)條件下呈固態(tài)。注意：凝固劑（如瓊脂），不能給微生物提供能量，只起到凝固作用。菌落1.定義：2.特征：不同菌落的形狀、大小、顏色、光澤度、透明度等不同。3.功能：菌落是鑒定菌種的重要依據(jù)。[知識補充]單個或少數(shù)同種菌體在固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部大量繁殖，形成肉眼可見的子細胞群體。放線菌念珠菌霉菌酵母菌

培養(yǎng)基的配制化學成分來源劃分培養(yǎng)基種類特點用途功能用途劃分含化學成分不明確的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)分類、鑒定天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基用已知成分的化學物質(zhì)配制在培養(yǎng)基中加入某種化學物質(zhì),以抑制不需要的微生物的生長,促進所需要的微生物的生長培養(yǎng)、分離出特定微生物培養(yǎng)基中加入能與目的菌的代謝產(chǎn)物發(fā)生顯色反應的指示劑，用以鑒別不同種類的微生物鑒別不同種類微生物選擇培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基

培養(yǎng)基的配制耐高濃度食鹽的金黃色葡萄球菌伊紅-美藍培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌（出現(xiàn)帶金屬光澤的深紫色菌落）水、碳源、氮源和無機鹽①

碳源常見的有機碳源：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨等②

氮源常見的氮源：牛肉膏、蛋白胨、尿素、氨基酸等注：含C、H、O、N的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能源③

無機鹽：4.配方：（1）基本成分：調(diào)節(jié)酸堿平衡（PH）、維持滲透壓NaCl、K2HPO4、MgSO4等培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物不加含碳有機物的培養(yǎng)基培養(yǎng)固氮微生物不加氮源的培養(yǎng)基應用最廣泛普通的細菌基礎培養(yǎng)基1.根據(jù)培養(yǎng)基的物理性質(zhì)，該培養(yǎng)基屬于哪類培養(yǎng)基？2.為什么培養(yǎng)基需要氮源?（P10旁欄思考）3.培養(yǎng)任何微生物，是否必須有有機碳源和有機氮源？

培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成組分含量提供的主要營養(yǎng)牛肉膏5g

、磷酸鹽和維生素等蛋白胨10g

和維生素等瓊脂20g

；NaCl5g

；H2O定容至1000ml

。表1-11000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的營養(yǎng)組成

是微生物合成蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)所必需的。固體培養(yǎng)基例：自養(yǎng)型微生物可利用無機碳源（如空氣中的CO2）；

固氮微生物可利用無機氮源（如空氣中的N2）。不一定碳源、氮源、水、無機鹽碳源、氮源碳源、氮源凝固劑無機鹽水思考：2.碳源都可以提供能量？含C、N的有機物是異養(yǎng)型微生物的碳源、氮源、能量。1.同一種物質(zhì)能否既做作碳源又做氮源？CO2是自養(yǎng)微生物的碳源，但不提供能量。3.無機氮源NH3能提供能量嗎？可以提供能量。硝化細菌：NH3----HNO2-----HNO3（釋放化學能）。（2）特殊需求：培養(yǎng)基還需要滿足微生物生長對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的需求。④培養(yǎng)厭氧微生物時，需要提供

的條件。①培養(yǎng)乳酸桿菌時，需要在培養(yǎng)基中添加

；②培養(yǎng)霉菌時，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；③培養(yǎng)細菌時，需要將培養(yǎng)基調(diào)至

；維生素酸性中性或弱堿性無氧4.培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成：主要指生長因子：維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等思考：所有微生物是否都可以用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)?提示:否。病毒是沒有細胞結(jié)構(gòu)的微生物,必須在活細胞內(nèi)寄生并以復制的方式增殖,因此不能用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。生長因子：通常是指微生物自身不能合成或合成量不足，但又是微生物生長和代謝所必需的小分子。（2023·廣東）研究者擬從堆肥中取樣并篩選能高效降解羽毛、蹄角等廢棄物中角蛋白的嗜熱菌。根據(jù)堆肥溫度變化曲線（如圖）和選擇培養(yǎng)基篩選原理來判斷，下列最可能篩選到目標菌的條件組合是（

）A．a(chǎn)點時取樣、尿素氮源培養(yǎng)基B．b點時取樣、角蛋白氮源培養(yǎng)基C．b點時取樣、蛋白胨氮源培養(yǎng)基D．c點時取樣、角蛋白氮源培養(yǎng)基DPart2無菌技術Aseptictechnique【自主探究】請結(jié)合教材P10-11，思考下列問題：1.獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關鍵是什么？2.消毒和滅菌的區(qū)別是什么？3.消毒和滅菌常用的方法有哪些？它們適用于哪些對象？4.為了防止雜菌污染，具體措施有哪些？（實驗前和操作時）——防止雜菌污染

無菌技術無菌技術應圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括：消毒滅菌獲得純凈的微生物培養(yǎng)物的關鍵是：防止雜菌污染。

無菌技術類型理化因素作用強度消滅微生物數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒滅菌

較為溫和強烈部分微生物全部微生物一般不能能1.

比較消毒和滅菌對微生物作用效果的差異2.無菌操作的對象是什么？培養(yǎng)皿接種環(huán)培養(yǎng)基操作的空間、操作者的衣著和手等【芽孢】有些細菌在一定的條件下，細胞里面形成一個橢圓形的休眠體，叫做芽孢。芽孢壁很厚，對干旱、低溫、高溫等惡劣的環(huán)境有很強的抵抗力。例如，有的細菌的芽孢，煮沸3小時以后才死亡?！炬咦印考毦?、原生動物、真菌和植物等產(chǎn)生的一種有繁殖作用的無性生殖細胞。能直接發(fā)育成新個體。拓展類型適用范圍操作方法消毒滅菌煮沸消毒法日常生活100℃煮沸5～6min巴氏消毒法不耐高溫的液體62～65℃煮30min或80～90

℃煮30S～1min化學藥劑消毒法生物活體、水源等擦拭等,如用酒精擦拭雙手、用氯氣消毒水源紫外線消毒法房間、儀器設備紫外線照射30min灼燒滅菌接種工具、接種時用的試管口或瓶口等直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒干熱滅菌耐高溫、需保持干燥的物品,如玻璃器皿、金屬用具等物品放入干熱滅菌箱,160～170℃加熱2～3h濕熱滅菌（高壓蒸汽滅菌）培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿等,生產(chǎn)和實驗室常用高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi),100kPa,溫度121℃,15～30min消毒與滅菌的比較

無菌技術1.牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高溫瞬時消毒法，與煮沸消毒法相比，這兩種方法的優(yōu)點是什么？在達到消毒目的的同時，營養(yǎng)物質(zhì)損失較少。2.為什么體積分數(shù)為70%～75%的酒精殺菌效果最好？若酒精濃度過高，菌體表面蛋白質(zhì)變性過快而凝固成一層保護膜，酒精不能滲入其中；若酒精濃度過低，殺菌能力減弱。想一想4.防止雜菌污染的措施：P10旁欄思考2：無菌技術除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？有效避免操作者被微生物感染。實驗前：對操作空間、操作者的衣著和手進行清潔和消毒對所用器皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌操作時：避免已滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸造成污染在超凈工作臺上并在酒精燈火焰附近進行二、無菌技術不耐高溫的液體（牛奶）接種室、超凈工作臺培養(yǎng)皿.吸管等玻璃器皿耐高溫、需保持干燥的物品接種環(huán)等金屬工具實驗操作者的雙手培養(yǎng)基家庭餐具等生活用品消毒a.煮沸消毒法b.巴氏消毒法c.化學藥劑消毒d.紫外線消毒e.灼燒滅菌f.干熱滅菌g.高壓蒸汽滅菌鞏固練習：將以下器具、物品或?qū)ο笈c所采用的消毒或滅菌方法連線Part3微生物的純培養(yǎng)Pureculture任務2：請同學們自主閱讀教材P11-13，完成以下問題：

1.相關概念：培養(yǎng)物？純培養(yǎng)物？純培養(yǎng)？（P11）2.什么是菌落？單菌落？（P12）3.獲得單菌落的方法？（P12）4.酵母菌的純培養(yǎng)的基本步驟？（注意倒平板和接種的具體操作）二、微生物的純培養(yǎng)配制培養(yǎng)基滅菌接種和分離酵母菌培養(yǎng)酵母菌倒平板稀釋涂布平板法、平板劃線法制備培養(yǎng)基微生物群在固體培養(yǎng)基上分散或稀釋單個微生物繁殖單菌落獲得單菌落的方法？稀釋涂布平板法平板劃線法純培養(yǎng)物稀釋涂布平板法平板劃線法

微生物的純培養(yǎng)培養(yǎng)物純培養(yǎng)物純培養(yǎng)在微生物學中，將接種于培養(yǎng)基內(nèi)，在合適條件下形成含特定種類微生物的群體。由單一個體繁殖所獲得的微生物群體。獲得純培養(yǎng)物的過程就是純培養(yǎng)。平板劃線法、稀釋涂布平板法1.原理：微生物群分散或稀釋單個細胞單個菌落繁殖2.獲得單菌落的方法：

1.菌落：2.單菌落：3.特征：不同種菌落的

、

、

、

、

等不同。4.作用：作為

的重要依據(jù)。什么是菌落、單菌落？酵母菌菌落菌種鑒定大小形態(tài)光澤度顏色透明度

分散的微生物在適宜的固體培養(yǎng)基表面或內(nèi)部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體。

一般是由單個微生物繁殖形成的純培養(yǎng)物。制備培養(yǎng)基①配制培養(yǎng)基②滅菌③倒平板培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)皿：干熱滅菌溫度：50℃左右冷凝后倒置操作：酒精燈火焰附近思考：如果要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，應該在滅菌前還是滅菌后？滅菌前（一）制備培養(yǎng)基1.配制培養(yǎng)基：2.滅菌：3.倒平板：對培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進行滅菌50℃，酒精燈火焰附近三、酵母菌的純培養(yǎng)馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（固體培養(yǎng)基）如果要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，應該在滅菌前還是滅菌后？滅菌前倒平板的具體步驟：酵母菌的純培養(yǎng)探究-實踐1.拔出錐形瓶的棉塞2.將瓶口迅速通過火焰3.用拇指和食指將培養(yǎng)皿打開一條稍大于瓶口的縫隙，將培養(yǎng)基（10-20mL）倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋4.等待培養(yǎng)基冷卻凝固后，將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)過來放置待培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時，在酒精燈火焰附近倒平板?？梢杂檬钟|摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺溫度下降到剛剛不燙手即可。不能完全打開，以免雜菌污染培養(yǎng)基。目的：可以防止冷凝水落入培養(yǎng)基，造成污染。目的是灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。1.培養(yǎng)基滅菌后，為什么需要冷卻到50℃左右時，才能用來倒平板?＞50℃，燙手。將所倒平板放入37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12h～24h，觀察是否有菌落產(chǎn)生以確定是否被污染。3.怎么確定所倒平板未被雜菌污染？2.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？因為平板冷凝后,皿蓋上會凝結(jié)水珠,平板倒置后,可防止皿蓋上的冷凝水落入培養(yǎng)基造成污染。問題討論:＜50℃，若不及時操作，瓊脂就會凝固4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，那么這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？不能，因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生。平板劃線法(可用于計數(shù))接種和分離制備培養(yǎng)基①配制培養(yǎng)基②滅菌③倒平板培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)皿：干熱滅菌溫度：50℃左右冷凝后倒置操作：酒精燈火焰附近稀釋涂布平板法如果要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，應該在滅菌前還是滅菌后？滅菌前平板劃線法：通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。經(jīng)數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離得到單菌落。①灼燒接種環(huán)，直至接種環(huán)金屬絲燒紅②在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔出酵母菌培養(yǎng)液試管的棉塞④在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液⑥將皿蓋打開一條縫隙，將接種環(huán)在培養(yǎng)基表面迅速劃3-5條平行線，蓋上皿蓋。⑤試管口通過火焰，并塞上棉塞③試管口通過火焰⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開始作第二次劃線。重復以上操作，作第三、四、五次劃線。最后一次劃線不與第一次劃線相連殺死接種環(huán)上原有微生物。以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。殺死上次劃線后殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免污染環(huán)境和感染操作者。思考：接種結(jié)束后還要灼燒接種環(huán)嗎？

線條末端的菌體數(shù)量少，每次從末端劃線，使菌體的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而減少，最終分散成單個細胞，繁殖得到單菌落。因為最后一次劃線已經(jīng)將菌種稀釋成單個細胞，如果與第一次劃線相連，就增加了菌體的數(shù)量，難得到單菌落。

微生物的純培養(yǎng)接種和分離酵母菌12345灼燒時期目的取菌種前每次劃線前接種結(jié)束后殺死接種環(huán)上殘留菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。殺死上次劃線時殘留菌種，使下一次劃線的菌種直接來源上次劃線的末端，從而使每次劃線時菌種數(shù)目逐漸減少，直至得到單個細胞。殺死接種環(huán)上原有微生物合作探究（完成練習冊P17平板劃線法接種操作）1.為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時,還需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？2.在灼燒接種環(huán)之后，要等其冷卻再進行劃線，目的是什么？避免接種環(huán)溫度過高而殺死菌種。3.除第一次劃線外，每次劃線都從上一次劃線的末端開始，目的是什么？

劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐漸減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。4.為什么劃線時要注意不能劃破培養(yǎng)基？一旦劃破，會造成劃線不均勻，難以達到分離單菌落的目的；二是存留在劃破處的單個細胞無法形成規(guī)矩的菌落，菌落會沿著劃破處生長，會形成一個條狀的菌落。平板劃線法

將接種后的平板倒置，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間。(可用于計數(shù))接種和分離制備培養(yǎng)基培養(yǎng)①配制培養(yǎng)基②滅菌③倒平板培養(yǎng)基：高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)皿：干熱滅菌溫度：50℃左右冷凝后倒置操作：酒精燈火焰附近稀釋涂布平板法培養(yǎng)對照將一個未接種的平板倒置，放入相同環(huán)境中培養(yǎng)相同時間。如果要調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH，應該在滅菌前還是滅菌后？滅菌前

完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-28h。檢驗培養(yǎng)基滅菌是否徹底（三）培養(yǎng)酵母菌三、酵母菌的純培養(yǎng)成果分析與評價2.正常情況下，培養(yǎng)基上能觀察到幾種形態(tài)的菌落？

如果有不同形態(tài)的菌落，分析原因？一種；無菌操作不規(guī)范或菌種不純。(1)在未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長?

如果有,說明了什么?5.實驗結(jié)果分析與評價

在未接種的培養(yǎng)基表面應該沒有菌落生長，如果有，說明培養(yǎng)基滅菌不徹底或被雜菌污染?？梢栽谂囵B(yǎng)12h和24h后，觀察菌落的大小、形狀、顏色。培養(yǎng)24h后，菌落的大小、形狀是否發(fā)生變化，菌落顏色是否加深，光澤度是否增加，等等在接種酵母菌的培養(yǎng)基上可觀察到單菌落。如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合酵母菌菌落的特點，則說明純化酵母菌的操作成功；如果觀察到了不同形態(tài)的菌落，可能是接種的菌種不純或者無菌操作不規(guī)范等原因引起的。(2)在接種酵母菌的培養(yǎng)基上,你是否觀察到了單菌落?這些菌落的顏色、形狀和大小是否一致?如果你觀察到了不同形態(tài)的菌落,你能分析出可能是由哪些原因引起的嗎?(3)你是如何記錄實驗結(jié)果的?請與其他同學交流、互評。請評估這一論點是否可信。課外拓展

有一段時間，水果“酵素”風靡各地。水果“酵素”制作的大致過程是：將洗凈、切成塊狀的水果放入潔凈的容器，再加入糖和水，密封，置于陰涼處發(fā)酵一至兩周。有人說，吃水果“酵素”可以美容、減肥、促進消化和提高免疫力。請評估這一論點是否可信。想一想評估論點的可信程度

所謂“酵素”，就是“酶”的另一種說法。“酵素”制作就是利用微生物進行無氧呼吸的原理，進行像制作泡菜一樣的發(fā)酵。這樣制作的“酵素”中可能有糖類(包括-些簡單的糖和膳食纖維等)、蛋白質(zhì)(包括多種酶)、有機酸等成分，不存在它獨有的、特殊的營養(yǎng)物質(zhì)，其中甚至可能含有微生物發(fā)酵產(chǎn)生的有毒物質(zhì)，食用后可能會危害人體健康。因此，“吃水果酵素