《海參中海參多糖的測定高效液相色譜

法》國家標準

編制說明

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國家標準

《海參中海參多糖的測定高效液相色譜法》

編制說明

1任務來源

本國家標準的制定任務是根據國家標準化管理委員會下達的國家標準制定計劃《海參中

海參多糖的測定高效液相色譜法》項目（計劃號為20205073-T-424）起草。本項目為2017

年國家重點研發計劃NQI項目《主要農業廢棄物提取加工與功效評價標準研究》

（2017YFF0207800）中一個任務。國家標準計劃《海參中海參多糖的測定高效液相色譜法》

由中國海洋大學上報，中國標準化研究院歸口上報及執行，主管部門為國家市場監督管理總

局。本標準由中國海洋大學、中國標準化研究院、大連棒棰島海產股份有限公司、山東好當

家海洋發展股份有限公司、大連獐子島漁業集團股份有限公司、山東東方海洋科技股份有限

公司、中國水產科學院黃海水產研究所共同起草。本標準主要起草人：王靜鳳、薛長湖、樊

燕。

2標準目的和意義

2.1海參相關產品質量控制的需要

海參(seacucumber)，屬棘皮動物門(Echinodermata)，海參綱(Holothurioider)，是棘皮動

物中經濟價值最大的一綱。全世界海參約有1100多種，我國有100多種，可供食用的有20

多種，其中以仿刺參的品質和口感最佳。海參含有蛋白質、多糖、微量元素和維生素等多種

營養物質，已經作為功能食品而被引起關注。更重要的是，它們含有大量的生物活性物質如

海參皂甙、粘多糖和膠原蛋白等，具有潛在的醫藥應用價值。

隨著人們生活水平的提高，與海參相關的食品、保健品和藥品日益成為市場消費的熱點

和主流。2019年海參產值達600億元。市售海參產品種類紛繁，干海參（淡干、鹽干、凍干）、

海參口服液、海參膠囊、海參酒、海參牛奶充斥市場，名產品牌效應日益突顯。為改善產品

良莠不齊，避免以次充好的現象出現，保證海參產品安全，建立控制體系顯得尤為必要。

海參多糖作為主要的活性成分，其含量對其食用及藥用價值影響很大，是不可或缺的海

參營養評價指標。海參中多糖類化合物結構復雜，且因海參種類和生長環境的不同而有差別。

不同種類海參中的多糖結構不同，而不同產地的同種海參中海參巖藻聚糖硫酸酯（SC-FUC）

和海參硫酸軟骨素（SC-CHS）的含量也不盡相同。另外，海參中蛋白質、多糖、脂肪、微量

元素等復雜成分的存在，會給海參多糖的測定帶來很多困難，采用簡單的分光光度法或稱重

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法很難滿足以海參多糖為評價指標建立海參制品質量標準的要求。因此，制訂簡單可信的海

參多糖的檢測方法標準具有十分重要的現實意義和緊迫性。

2.2完善國家標準的需要

經查詢，目前ISO、AOAC的相關標準中都沒有海參及其制品中海參多糖含量測定方法

的相關標準。而我國行業標準中有一項與之相關，為《刺參及其制品中海參多糖的測定高效

液相色譜法》（SC/T3049-2015），該標準針對刺參及其制品中海參多糖含量給出了明確的測

定方法，并對該方法對刺參及其制品中海參多糖的檢出限和定量限進行了說明。

2.3維護消費者權益的需要

海參富含糖蛋白、酸性多糖、海參皂甙、神經節苷酯等多種生物活性物質，因具有抗腫

瘤、抗凝血、降血脂、消除疲勞，提高免疫力等功效，已成為一種深受大眾喜愛的時尚消費

品。目前市場上的海參，每斤少則1000多元，多則數千元不等，價格差異較大。由于檢驗方

法標準的滯后，海參的優劣只能從一些外觀指標上評判。目前市場上銷售的各類海參制品，

往往不能從外觀判斷其中海參含量到底有多少。為了維護消費者的合法權益，制訂有效的海

參多糖檢測方法標準是非常必要的。

2.4應對國際貿易的需要

海參是全球華人喜愛的食品，東南亞是海參的主要市場，消費量占全球的90%左右。海

參由于其品種和生長水域的不同，其營養成分和活性成分的含量也大不相同，黃渤海域出產

的日本刺參品質優良，我國亦是海參生產和進出口大國，為了保證進出口產品的質量，制訂

與國際標準水平相當的檢測方法標準是非常必要的。

2.5統一檢測方法的需要

我國尚未確定對海參多糖的檢測方法的國家標準或行業標準，目前多糖的檢測方法，無

法實現對海參及其制品中海參多糖準確的定性和定量分析，為了做到科學、準確地測定海參

多糖的含量，制訂一個統一的檢測方法標準是非常必要的。

2.6完善國家標準的需要

中國海參市場已經全面成型，海參消費正在從北方擴展到南方，直至到全國市場。但海

參品種之間、營養價值之間均有較大差別，而我國現有的海參多糖檢測方法存在較大的局限

性，也不能滿足復雜海參制品中海參多糖的檢測需要。因此，制訂海參多糖的檢測方法也是

完善食品檢測方法國家標準的需要。

3海參多糖研究現狀

海參多糖是海參體內一種重要的生物活性物質。研究發現存在于海參體壁的多糖主要分

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兩類：一類為巖藻糖基化的海參硫酸軟骨素（SC-CHS），是由D-N-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄

糖醛酸和L-巖藻糖組成的分支雜多糖，相對分子質量為4萬-5萬；另一類為海參巖藻多糖

（SC-FUC），是由L-巖藻糖所構成的直鏈多糖，相對分子質量為8萬-10萬。兩者的組成糖

基雖不同，但糖鏈上都有部分羥基發生硫酸酯化，并且硫酸酯基類多糖含量均在32%左右，

兩種海參多糖的特殊結構，均為海參所特有。

海參中多糖類化合物結構復雜，且因海參種類和生長環境的不同而有差別。不同種類海

參中的多糖結構不同，而同種海參中海參硫酸軟骨素（SC-CHS）和海參巖藻聚糖硫酸酯

（SC-FUC）的含量也不盡相同。另外，海參中還含有大量的蛋白質、脂肪、微量元素等復雜

成分，必然會給海參中總多糖的測定帶來很多困難。隨著人們生活水平的提高，與海參相關

的食品、保健品和藥品日益成為市場消費的熱點和主流。海參多糖作為主要的活性成分，其

含量對其食用及藥用價值影響很大，是不可或缺的海參營養評價指標。市面上目前的海參品

種復雜，而采用簡單的分光光度法或稱重法很難滿足以海參多糖為評價指標建立海參制品質

量標準的要求。因此迫切需要建立一種簡便可信的海參多糖測定方法。

已有的關于多糖含量的測定方法，如“測定海參多糖含量的方法”，對干海參樣品經堿溶，

超聲提取，二次醇沉等步驟，最后對樣品干燥至恒重后測得多糖含量，該方法對目標測定物

的選擇性不強，樣品中的雜質如鹽、微量元素、蛋白質等成分易引起較大的測定誤差，易給

測定結果帶來進一步的誤差，且不適合添加了海參或海參酶解物的樣品中海參多糖含量的測

定；“測定蘆薈多糖的新方法”采用了分光光度法測定了蘆薈多糖，具有較好的重復性和精密

度，然而因為海參多糖中含有葡萄糖醛酸和氨基糖，二者在該種方法中不顯色，所以也不適

合海參多糖含量的測定；董平等采用以巖藻聚糖硫酸酯（Fucoidan）作為標準品，采用次甲

基蘭法測定了海參多糖的含量，結果表明，該法能夠應用于測定海參多糖的含量，但是由于

海參多糖同時含有巖藻聚糖硫酸酯和硫酸軟骨素，而且兩者與次甲基蘭結合后的顯色強度不

同，因此難以以單一多糖作為顯色標準品，且分光光度法本身存在一定的誤差，易受溶液中

色素、皂苷等其他雜質的影響，只適合比較純的樣品的多糖含量測定，不適合成分較復雜的

海參制品中的多糖含量的測定。

近年來以高效液相色譜為基礎的多糖的定量方法發展較快，如“一種多糖定量檢測方法與

系統”靈敏準確，但對設備要求較高，且通常該方法適用于糖組成以中性糖含量為主的多糖。

海參多糖中有較高含量的糖醛酸和氨基糖，用該方法不能夠柱后顯色。另外，海參多糖中兩

種糖的種間差異大，無法確定具體以何種多糖作為標準品進行分光光度或者液相色譜測定。

文獻表明，1-苯基-3甲基-5-吡唑啉酮（PMP）可以修飾糖環的還原端，使其具有高度紫外吸

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收，修飾糖能在反相高效液相色譜柱上得到很好的分離，并且衍生過程簡便快捷，用于單糖

組成測定非常有效，目前已有許多相關報道。

本方法采用PMP-柱前衍生高效液相色譜法和巖藻糖對不同海參制品中海參總糖進行定

量。巖藻糖是SC-CHS和SC-FUC中都存在的一種單糖，且同一種海參中巖藻糖占多糖總量

的百分含量一定，因此同種海參中的多糖含量和巖藻糖含量之間存在固定的轉換系數。巖藻

糖衍生物在254nm有強吸收，并且能夠與其他種類單糖較好分離，高效液相可以達到很好的

分析定量效果。而葡萄糖醛酸亦可以作為海參鑒定海參多糖的一個重要指標。因此能夠以本

方法為基礎，建立以海參多糖為指標的海參產品的質量評價體系。

4標準主要起草過程

4.1標準制定工作組的成立

國家重點研發項目立項后，2017年11月10日在北京市西藏大廈召開了國家標準《海參

中海參多糖的測定高效液相色譜法》第一次工作會。參加單位有中國海洋大學、中國標準

化研究院、中國熱帶農業科學院分析測試中心等。會議成立了由中國海洋大學、中國標準化

研究院、中國熱帶農業科學院分析測試中心等單位參加的標準工作組，主要由從事標準制修

訂、儀器分析、具有豐富技術經驗的專業研究人員組成，工作組制定了初步的標準編制工作

計劃。

4.2工作計劃和標準制定原則的確定

按照工作任務要求，標準編制工作組制定了標準起草工作計劃和任務分工。在充分研究

與討論的基礎上，制定了標準制定原則：

（1）先進性：其準確度、精密度和靈敏度達到較高水平。

（2）適用性：要適應我國植物提取物產業發展的要求，滿足植物提取物現代化的需要。

（3）可操作性：符合我國目前檢測儀器設備和試劑、材料的供應條件。

（4）實用性：符合檢測從業人員的技術水平，能被國內主要的環境分析實驗室所使用并達到

所規定的要求。要有利于提高農業廢棄物綜合利用，為植物提取物質量控制部門、有關企業

和三農服務。

4.3國內外相關標準和文獻的檢索

目前，CAC、AOAC、ISO的相關標準中都沒有海參及其制品中海參多糖測定方法的相關

標準。現有的行業標準為“刺參及其制品中海參多糖的測定高效液相色譜法（SC/T

3049-20l5）”。在本行業標準中，僅僅標明了刺參中海參多糖的含量測定方法，未能有海參其

他種類的測定方法。目前，市場中存在海地瓜、梅花參、黃海參、石參、黑參等產品，因而

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不能滿足現行標準的要求。現有的行業標準為“刺參及其制品中海參多糖的測定高效液相色

譜法（SC/T3049-20l5）”是本單位制定，具有操作較為簡便、靈敏度高、穩定性好、分離效

果好、適用范圍廣的優點。本方法可同時測定海參制品中葡萄糖醛酸的含量及各單糖的比例，

可同時用于海參制品中海參多糖存在及實際添加量的輔助判定。但是，在本行業標準中，僅

僅標明了刺參中海參多糖的含量測定方法，未能有海參其他種類的測定方法。目前，市場中

存在海地瓜、梅花參、黃海參、石參、黑參等產品，因而不能滿足現行標準的要求，迫切需

要擴大本標準的適用范圍和適用對象。本標準將適用范圍和適用對象擴大升級后，將有利于

維護消費者健康的需求、統一監測方法的需求、完善國家標準的需要、應對國際貿易的需求。

高效液相色譜-質譜法具有準確度好、精密度高、檢出限與定量限低、操作簡單等優點，

因此確定采用液相色譜法檢測海參中的海參多糖。以海參及其制品為樣品，經過初步試驗，

證明方法是可行的。而后對方法進行優化，對方法進行驗證，結果表明方法的準確性、回收

率、精密度等方面都能達到國家可標準的要求，并且基本符合制定國家標準的條件，并于2019

年向國家標準化管理委員會提出立項申請。

4.4標準方法的建立

標準工作組按照計劃任務書的要求，結合制定標準的要求，研究建立標準方法的實驗方

案，并進行方法前處理條件的選擇、儀器條件的確定和方法精密度、準確度及檢出限的測定

等試驗。

2018年3月開始，標準起草工作組針對不同海域地區進行海參主產地進行調研，獲取了

大量相關信息與數據。原料樣品采集后，開始開展實驗室驗證工作，建立海參及其制品中海

參多糖的測定高效液相色譜法，包括線性范圍、相關系數、加標回收率、準確度、精密度、

檢出限、定量限等，以及樣品中海參多糖的提取條件的優化，如提取溶劑種類、提取溶劑體

積、超聲提取時間等。

4.5標準草案的形成

標準起草工作組查閱、收集和整理了國內外有關研究進展和專利、標準、法規等文獻資料，

掌握了相關標準的現狀；對文獻中海參多糖測定方法進行了對比和總結，為標準文本的編制

奠定理論基礎。在《海參及其制品中海參多糖的測定高效液相色譜法》國家標準第一次起

草工作會議的基礎上，起草工作組相關單位共同討論起草形成了《海參及其制品中海參多糖

的測定高效液相色譜法》國家標準的技術框架和主要內容，初步形成了《海參及其制品中

海參多糖的測定高效液相色譜法》標準草案。

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4.6標準討論稿和標準說明的形成

2019年7月5日，起草工作組組織相關單位和專家，在山東青島中國科學院蘭州化學物

理研究所召開第二次標準起草工作會。參會單位包括中國海洋大學、中國標準化研究院、中

國科學院蘭州化學物理研究所、浙江大學、中國熱帶農業科學院分析測試中心等。

與會專家對《海參中海參多糖的測定高效液相色譜法》標準草案的英文名稱、范圍、術

語和定義、基本要求、主要技術指標、附錄等章條逐一進行了修改，會后根據修改意見形成

了《海參中海參多糖的測定高效液相色譜法》標準討論稿及其編制說明。

4.7標準征求意見稿和編制說明的形成

在前期工作的基礎上，起草工作組組織相關單位和專家于2019年10月22日在北京中國

標準化研究院召開第三次標準起草工作會。參會單位包括中國海洋大學、中國熱帶農業科學

院、中國標準化研究院、浙江大學等。與會成員認真討論《海參中海參多糖的測定高效液

相色譜法》標準討論稿后，根據討論結果修改形成了《海參中海參多糖的測定高效液相色

譜法》征求意見稿及編制說明。會議同時討論了下一階段征求意見的單位和專家名單。

4.8方法驗證

2020年9～11月，對“海參及其制品中海參多糖的測定高效液相色譜法”進行驗證。參

加本標準征求意見稿方法驗證的三個實驗室，分別屬于國家水產品質量監督檢驗中心（中國

水產科學研究院黃海水產研究所）、農業部漁業產品質量監督檢驗測試中心（煙臺）、青島市

產品質量監督檢驗所，均通過了“雙認證（計量認證/審查認可）”評審或復審，具備進行本

標準項目驗證工作的條件。通過統計檢驗技術確認外部實驗室試驗結果的準確性。

5本標準與國內外分析方法的關系

本標準研究旨在建立一項滿足我國海參及其制品中海參多糖檢測的要求，在質量控制目

標和技術手段上，適應我國大部分質控實驗室儀器設備和技術能力的檢測方法標準。通過查

閱國內外相關文獻資料，制定條件優化方案，確保本方法前處理所采用的裝置操作簡便，能

夠滿足國內實驗室的條件要求。本標準擬采用高效液相色譜法測定海參多糖。樣品的前處理，

即對提取時間、提取溶劑種類、提取次數等因素進行優化。檢測方法在穩定、可靠和實用的

基礎上，達到國際先進水平，以適應我國海參及其制品中海參多糖含量檢測、質控與管理的

需要。

目前已有很多關于多糖含量測定方法的申請專利及文獻報道，如專利申請號為

200410036250.7的“測定海參多糖含量的方法”，該方法對于海參樣品經堿溶，超聲提取，二

次醇沉等步驟，最后將樣品干燥至恒重后測得多糖含量，但該方法對目標測定物的選擇性不

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強，樣品中的雜質如鹽、微量元素、蛋白質等成分易引起較大的測定誤差，且不適合海參制

品中海參多糖含量的測定；專利申請號為200410052907.9的“一種多糖定量檢測方法與系統”，

該方法靈敏準確，但對設備要求較高，而且該方法通常適用于以中性糖含量為主的多糖，海

參多糖中含有較高含量的糖醛酸和氨基糖，用該方法不能夠柱后顯色。另外，也有文獻報道

采用分光光度法測定海參多糖含量，以巖藻聚糖硫酸酯作為標準品，采用次甲基蘭顯色法測

定了海參多糖的含量，結果表明，該法能夠應用于測定海參多糖的含量，但是由于海參多糖

同時含有海參巖藻聚糖硫酸酯和海參硫酸軟骨素兩種組分，而且兩者與次甲基蘭結合后的顯

色強度不同，因此難以以單一多糖作為顯色標準品，且分光光度法本身存在一定的誤差，易

受溶液中色素等其他雜質的影響，只適合比較純的樣品的多糖含量測定，不適合成分較復雜

的海參制品中的多糖含量的測定。最重要是以上方法都不能很好排除市場上的摻假摻雜現象，

因此準確性難以保證。

本標準方法的優點在于：（1）靈敏度高，巖藻糖衍生物在254nm有很強的吸收，濃度為

8.0×10-4mg/mL時即可實現定量檢測。（2）穩定性好，24小時內巖藻糖衍生物峰面積穩定，

RSD≤5％。（3）分離效果好，在此高效液相色譜條件下，巖藻糖能夠與其它單糖明顯分離，

有效避免其它單糖對巖藻糖的檢測帶來的干擾，實現準確定量。（4）適用范圍較廣，可應用

于固態、液態等多種刺參制品中海參多糖含量的測定。（5）本方法能有效排除市場上向刺參

制品中摻入其它來源多糖而干擾海參多糖準確定量的問題。

6本標準主要技術指標的依據與說明

6.1標準名稱

本標準主要解決海參及其制品中海參多糖含量測定的技術問題，所以將本標準的名稱定

為：《海參中海參多糖的含量測定高效液相色譜法》，翻譯為“Determinationofseacucumber

polysaccharidesinseacucumber-Highperformanceliquidchromatography”。

6.2前言

明確了本標準的歸口單位及主要起草單位、起草人。

6.3主體內容

標準的主體內容包括：范圍、規范性引用文件、原理、試劑、儀器和設備、測定步驟、

結果計算與表示、精密度和回收率等。

6.4“范圍”的界定

本標準規定了海參及以海參為原料加工而成的干海參、即食海參、膠囊、漿液等深加工

制品中海參多糖含量的高效液相色譜測定方法。

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本標準適用于海參及以海參及其制品中海參多糖含量的測定。

6.5檢測方法的原理

海參多糖（seacucumberpolysaccharides）包含海參巖藻聚糖硫酸酯（seacucumberfucoidan,

SC-FUC）和海參硫酸軟骨素（seacucumberchondroitinsulfate,SC-CHS）兩種成分。在同一

種海參中海參巖藻聚糖硫酸酯和海參硫酸軟骨素的比例基本恒定。海參硫酸軟骨素，是一種

具有巖藻糖支鏈的硫酸化多糖，主要由D-乙酰氨基半乳糖、D-葡萄糖醛酸和L-巖藻糖構

成。同一海參中海參多糖組成的特定性以及海參硫酸軟骨素結構的特定性，決定了海參多糖

與海參硫酸軟骨素中含有的巖藻糖之間存在固定的質量轉換系數，通過高效液相色譜法測定

得到海參硫酸軟骨素中巖藻糖含量后可按照公式C=CFuc×K(K為質量轉換系數)計算得出海

參多糖的含量。

海參硫酸軟骨素與其它來源硫酸軟骨素結構存在明顯差異，其具備巖藻糖基化的特定結

構。本標準利用乙酸鉀沉淀法沉淀得到供試樣品中海參硫酸軟骨素組分，有效避免各種摻假

摻雜干擾，可準確的測定出刺參及其相關制品中海參多糖含量。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮

（PMP）可以修飾糖環的還原端，使其具有高度紫外吸收，修飾糖能在反相高效液相色譜柱

上得到很好的分離，并且衍生過程簡便快捷，用于單糖組成測定非常有效。巖藻糖衍生物在

254nm有強吸收，并且在實驗色譜條件下能夠與其他種類單糖較好分離，高效液相可以達到

很好的分析定量效果。

6.6方法主要技術參數確定依據

6.6.1海參硫酸軟骨素分離方法的確定

本方法通過測定供試樣品所含有的海參硫酸軟骨素中巖藻糖的含量，經質量轉換系數K

換算得到海參多糖含量。乙酸鉀可專一沉淀出供試樣品多糖酶解液中的硫酸軟骨素組分，使

其與巖藻聚糖硫酸酯分離。J.E.Scott曾經用乙酸鉀沉淀出哺乳動物的肝素。衡陽醫學院生化

教研室的蕭惠連證明類肝素也可用乙酸鉀沉淀得到。因肝素或非海參來源的類肝素物質中并

不含有巖藻糖，故其沉淀后并不影響海參硫酸軟骨素中巖藻糖的定量。通過實驗證明，乙酸

鉀濃度達到2.5mol/L時可保證樣品中海參硫酸軟骨素組分的完全沉淀，而不影響巖藻聚糖硫

酸酯等其它多糖的溶解性。故本標準中分離供試樣品海參硫酸軟骨素組分的條件確定為2.5

mol/L乙酸鉀溶液。

6.6.2水解條件的確定

將鮮參去腸腺，灰嘴，剪成0.5cm×0.5cm的小塊，70℃烘干12h，小型粉碎機粉碎，

混勻。準確稱取（1.00±0.05g）刺參粉，置于50mL三角瓶中，加入25mL0.1mol/LpH6.0

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乙酸鈉緩沖液、100mg木瓜蛋白酶、37mg乙二胺四乙酸和22mg半胱氨酸鹽酸鹽，渦旋混

合，60℃恒溫水浴振蕩反應24h，將酶解液轉移入50mL離心管，于9000rpm離心10min。

棄去沉淀，上清液轉移至另一50mL離心管中，加入1.6mL10%的氯化十六烷基吡啶溶液，

渦旋混合，室溫放置24h，于9000rpm離心10min。棄去上清液，沉淀溶解于25mL蒸餾

水中，再加入6.13g乙酸鉀，渦旋混合，超聲至乙酸鉀完全溶解，4℃放置24h，于9000rpm

離心10min。沉淀分別用25mL80%乙醇溶液和95%乙醇溶液洗兩次，最后將沉淀于60℃

干燥2h，用適量蒸餾水溶解，用截流分子量為6kDa的真空纖維膜超濾并脫鹽，濃縮，凍干，

得到刺參海參硫酸軟骨素。

準確稱取2mg海參硫酸軟骨素樣品于5mL安培瓶中，分別加入1mL2mol/L三氟乙酸

溶液，1mL2mol/L硫酸溶液，1mL2mol/L三氟乙酸和2mol/L硫酸等體積混合溶液，充氮

封管，分別于110℃水解反應4h、6h、8h、10h、12h，14h、16h，70℃下氮氣吹干，以

2mL超純水超聲溶解殘余物，用0.3mol/L氫氧化鈉溶液調節單糖水解液至pH為7.0后轉移

入5mL容量瓶，稀釋至刻度，即得刺參硫酸軟骨素水解液。準確移取海參硫酸軟骨素水解液

400μL于10mL具塞試管中，加入50μL2mmol/L乳糖溶液，450μL0.5mol/L1-苯基-3-甲

基-5-吡唑啉酮（PMP）-甲醇溶液和450μL0.3mol/L氫氧化鈉溶液，渦旋混合均勻后于70℃

水浴反應30min，取出冷卻至室溫，加入450μL0.3mol/L鹽酸溶液，渦旋混合。加1mL三

氯甲烷，充分振蕩，靜置分層，吸棄下層三氯甲烷層，按上述方法用三氯甲烷重復萃取3次。

將上層水相過0.45μm濾膜，供高效液相色譜分析。

不同酸與不同水解時間對刺參海參硫酸軟骨素水解程度及單糖檢測的影響結果見圖1，

圖2，圖3。

圖1刺參海參硫酸軟骨素2mol/L三氟乙酸水解作用圖

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圖2刺參海參硫酸軟骨素2mol/L硫酸水解作用圖

圖3刺參海參硫酸軟骨素2mol/L混酸水解作用圖

不同條件下，單糖水解情況變化很大。氨基葡萄糖（GlcN）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、氨

基半乳糖（GalN）、半乳糖（Gal）和巖藻糖（Fuc）在三種條件下都能水解釋放出來，而甘露

糖（Man）只能在2mol/L三氟乙酸溶液的作用條件下水解釋放出來。除半乳糖（Gal）在2mol/L

三氟乙酸溶液作用6h后達到最大值外，其余單糖都是在2mol/L三氟乙酸溶液作用8h后達

到最高含量。故確定水解條件為：2mol/L三氟乙酸溶液，110℃，8h。

6.6.3色譜條件的確定

在實驗中發現用水和乙腈做流動相不能達到完全分離，而且峰拖尾、譜帶擴展嚴重，這

是因為經PMP衍生化后的糖類是易離解的弱堿性有機物，C18柱固定相中的鍵合相表面殘存

的硅羥基與堿的陰離子有親和力，所以會引起峰形拖尾并干擾分離。當加入了磷酸鹽緩沖液

后，鹽效應減弱了殘存的硅羥基的干擾作用，抑制峰形拖尾并改善分離效果，使用pH6.9的

磷酸鹽緩沖液，單糖衍生物的峰形和分離效果良好。乙腈比例影響分離效果，乙腈比例降低，

出峰時間延長。實驗確定色譜條件為：色譜柱：XDB-C18，5μm，250mm×4.6mm（內徑）

或相當者；柱溫：25℃；檢測波長：254nm；進樣量：20μL；流速：1.0mL/min；流動相：

A：0.05mol/LpH6.9磷酸鹽緩沖液磷酸鹽-乙腈（85:15，v/v）溶液，B：0.05mol/LpH6.9磷

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酸鹽緩沖液磷酸鹽-乙腈（60:40，v/v）溶液；梯度洗脫程序：0→10min→40min→45min，B

0→8%→37%→0。

在實驗確定梯度洗脫條件下，溶劑峰與PMP的出峰時間均超前于單糖衍生物峰，不會

對分析結果造成影響，同時，各單糖可以得到有效分離，有效避免其它單糖對巖藻糖的檢測

帶來的干擾，見圖4。

圖4單糖混合標準溶液衍生物液相色譜圖

6.6.4質量轉換系數K的確定

6.6.4.1不同產地海參中海參多糖含量的測定

選取中國沿海6個不同產地的刺參作為研究對象，每個產地采樣8個。將鮮刺參去腸腺，

灰嘴，剪成0.5cm×0.5cm的小塊，70℃烘干12h，小型粉碎機粉碎，混勻。準確稱取（1.00

±0.05g）刺參粉，置于50mL三角瓶中，加入25mL0.1mol/LpH6.0乙酸鈉緩沖液、100mg

木瓜蛋白酶、37mg乙二胺四乙酸和22mg半胱氨酸鹽酸鹽，渦旋混合，60℃恒溫水浴振蕩

反應24h，將酶解液全部轉移至50mL離心管中，于9000rpm離心10min。棄去沉淀，上

清液轉移至另一50mL離心管中，加入1.6mL10%的氯化十六烷基吡啶溶液，渦旋混合，室

溫放置24h，于9000rpm離心10min。棄去上清液，沉淀溶解于25mL蒸餾水中，再加入

75mL無水乙醇，渦旋混合，4℃放置24h，于9000rpm離心10min。沉淀分別用25mL80%

乙醇溶液和95%乙醇溶液洗兩次，最后將沉淀于60℃干燥2h，蒸餾水溶解，用截流分子量

為6kDa的真空纖維膜超濾并脫鹽，濃縮，凍干，得到海參多糖并稱重，詳見表1。

6.6.4.2不同產地刺參海參硫酸軟骨素中巖藻糖含量的測定

準確稱取（1.00±0.05g）試樣，置于50mL三角瓶中，加入25mL0.1mol/LpH6.0乙酸

鈉緩沖液，加入100mg木瓜蛋白酶、37mg乙二胺四乙酸和22mg半胱氨酸鹽酸鹽，渦旋混合，

60℃恒溫水浴振蕩酶解24h，將酶解液全部轉移至50mL離心管中，于9000rpm離心10min。

14

棄去沉淀，上清液轉移至50mL燒杯中，加入6.13g乙酸鉀，渦旋混合，超聲至乙酸鉀完全溶

解，于4℃靜置12h后轉移至另一50mL離心管，于9000rpm離心10min，棄去上清液，沉淀

用5mL蒸餾水超聲溶解后轉移至10mL容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，即得海參硫酸軟骨素

溶液。取1mL海參硫酸軟骨素溶液于5mL安培瓶中，加入1mL4mol/L三氟乙酸溶液，充氮

封管，110℃水解8h后，于70℃氮氣吹干，加2mL蒸餾水超聲溶解殘余物，用0.3mol/L氫氧

化鈉溶液調節水解液pH至6.5~7.5后轉移入5mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，即得海參硫

酸軟骨素水解液。準確移取400μL海參硫酸軟骨素水解液于10mL具塞試管中，加入50μL2

mmol/L乳糖溶液，450μL0.5mol/L1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮-甲醇溶液，450μL0.3mol/L氫

氧化鈉溶液，渦旋混合，70℃水浴反應30min，取出冷卻至室溫，加450μL0.3mol/L鹽酸溶

液，渦旋混合。加1mL三氯甲烷，充分振蕩，靜置分層，吸棄下層三氯甲烷層，按上述方法

用三氯甲烷重復萃取3次。將上層水相過0.45μm濾膜，經高效液相色譜法測定得到刺參中海

參硫酸軟骨素所含巖藻糖含量，詳見表1。

6.6.4.3質量轉換系數K的確定

根據6.6.3.4.1和6.6.4.2測定的刺參中海參多糖含量及其海參硫酸軟骨素中巖藻糖的含量計

算得到質量轉換系數K=20.0，詳見表1。

表1質量轉換系數K的確定

刺參取海參多糖含量HPLC法測定海參硫酸軟骨素質量轉換質量轉換

序號平均值

樣地mg/g中巖藻糖含量mg/g系數K系數K

1105.9325.39519.64

2113.6655.91419.22

3108.6975.50919.73

4111.3135.71619.47

遼寧19.43

5112.4515.92518.98

盤錦

6108.8055.63519.31

7110.3945.59019.75

8114.2875.90719.35

198.9324.96519.93

20.00

2101.6655.06320.08

398.6975.01919.66

山東

498.3134.89620.08

煙臺20.06

597.4514.92719.78

牟平

697.8054.93519.82

798.3944.85120.28

8102.2874.90720.85

15

189.5344.34520.61

287.5284.36820.04

391.9044.73119.43

山東484.5754.21920.05

19.85

蓬萊590.2544.60519.60

688.0334.51519.50

795.2654.77319.96

887.3814.45219.63

1104.3825.22919.96

2105.1375.31319.79

397.6034.78720.39

遼寧4100.7315.17419.47

19.94

大連596.4674.89019.73

698.7564.97319.86

7103.3205.10220.25

8101.9525.08520.05

194.4254.80119.67

291.3914.53220.17

395.7184.76620.08

山東496.4864.83919.94

20.09

威海592.7534.66419.89

695.0524.60520.64

790.9684.47520.33

894.3164.71520.00

173.5323.48521.10

283.9514.11820.39

374.8083.61720.68

浙江475.8603.68920.56

20.61

溫州576.2043.80620.02

683.7953.97521.08

779.6303.86220.62

881.4173.99020.41

6.6.5樣品測定

6.6.5.1試樣制備

鮮參去腸腺，灰嘴，剪成約0.5cm×0.5cm的小塊，70℃烘干12h，粉碎，過10目篩，

混勻備用；干刺參，粉碎，過10目篩，混勻備用；即食刺參，剪成約0.5cm×0.5cm的小塊，

16

70℃烘干12h，粉碎，過10目篩，混勻備用；膠囊，取內容物混勻備用；漿液，混勻備用。

6.6.5.2鮮參、干參、即食參、海參粉及參膠囊等固體制品

依照6.6.4.2所述方法對鮮刺參、干刺參、即食刺參及刺參膠囊等固體制品進行前處理。

6.6.5.3海參原漿液、海參口服液、海參酒、海參乳飲料等液體制品

準確移取25mL試樣，加入25mL0.1mol/L乙酸鈉緩沖液，加入100mg木瓜蛋白酶、73mg

乙二胺四乙酸和44mg半胱氨酸鹽酸鹽，渦旋混合，60℃恒溫水浴振蕩酶解24h，將酶解液轉

移至50mL離心管中，于9000rpm離心10min。棄去沉淀，上清液經0.45μm水膜過濾后轉移

至100mL燒杯中，加入12.27g乙酸鉀，渦旋混合，超聲至乙酸鉀完全溶解，以下按6.6.4.2自“于

4℃靜置12h……”起依法操作。

6.7方法驗證

6.7.1實驗室內試驗數據分析

6.7.1.1線性關系及精密度

在實驗確定色譜檢測條件下，以巖藻糖（Fuc）衍生物的峰面積與乳糖（Lac）衍生物的

峰面積之比（Y）對巖藻糖（Fuc）相應濃度（X）繪制標準工作曲線，線性良好。標準曲線

方程：Y=6.032X+0.2084，R2≥0.9984，線性范圍為5.0×10-3mmol/L~6.0mmol/L。

吸取1.8mmol/L巖藻糖標準品溶液，衍生后，連續進樣6次，利用內標校正，巖藻糖衍生

物RSD=2.19％，表明儀器精密度良好，方法精密度符合要求。

6.7.1.2重復性

六組巖藻糖標準品平行樣（1.2mmol/L）用同樣的儀器和試劑于當天進行衍生測定。巖藻

糖-PMP衍生物RSD=3.80%，表明該方法對巖藻糖衍生物的檢測重復性良好。

6.7.1.3檢出限和定量限

方法的檢出限一般是根據信噪比外推得到，然而由于基質干擾等因素的影響，在進行實

際樣品測定時，檢出限通常很難實現。方法的測定低限是指在保證具有一定可靠性(準確度和

精密度)的前提下，分析方法能夠測定出的樣品中目標物的最低濃度。經測定得該方法巖藻糖

衍生物的檢出限（R/N=3）和定量限（R/N=10）分別為1.0×10-3mmol/L和4.8×10-3mmol/L。

6.7.1.4穩定性

測定的24h內，巖藻糖衍生物的峰面積穩定，其相對標準偏差（RSD）小于2.5%。表明

該測定方法在24h內是穩定的。

6.7.1.5回收率

選取刺參粉和刺參口服液作為研究對象以考察低濃度（0.05mmol/L）、中濃度（0.9

17

mmol/L）和高濃度（6.0mmol/L）三個水平的方法回收率。各濃度水平的加標回收率和相對

標準差，詳見表2和表3。

表2刺參粉加標回收率測定結果

樣品添加量mmol/L檢測值mmol/L回收率%平均回收率%相對標準偏差%

1.0.041583.0

2.0.039077.9

3.0.041282.3

0.0578.94.50

4.0.036973.7

5.0.040480.8

6.0.038276.4

1.0.82491.5

2.0.89299.1

3.0.84093.3

0.992.24.31

4.0.79187.9

5.0.82992.1

6.0.80489.3

1.5.2787.8

2.5.0884.6

3.4.7879.7

6.087.04.98

4.5.4190.2

5.5.5191.8

6.5.2787.9

表3刺參口服液加標回收率測定結果

樣品添加量mmol/L檢測值mmol/L回收率%平均回收率%相對標準偏差%

10.042384.5

20.045991.8

30.043486.7

0.0588.94.95

40.041582.9

50.046091.9

60.047895.6

10.83292.4

20.84593.9

30.89699.6

0.994.84.82

40.78186.8

50.87897.5

60.88898.7

15.5692.6

25.7195.2

6.092.34.88

35.5692.6

45.9599.1

18

55.3989.8

65.0884.7

6.7.1.6變異系數

批內變異系數在4.31%~4.98%之間；批間變異系數在5.22%~6.71%之間，證明該方法

精確性良好。

6.7.1.7市售刺參制品中海參多糖的測定

對市售的具有代表性的刺參制品進行了方法適用性驗證，色譜圖見圖5~圖8，該方法能

夠實現對刺參制品中海參多糖的準確定量。

圖5單糖混合標準溶液衍生物液相色譜圖圖6空白試樣液相色譜圖

圖7刺參口服液液相色譜圖譜圖8刺參粉液相色譜圖譜

6.7.2實驗室間驗證數據分析

國家水產品質量監督檢驗中心、農業部漁業產品質量監督檢驗測試中心（煙臺）、青島市

產品質量監督檢驗所三家單位的液相色譜檢測技術人員，按照上述測定步驟，參照上述色譜

條件，用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀，分別進行了驗證試驗。驗證結果見各自的驗證

試驗報告，四個實驗室的主要試驗結果歸納如下：

6.7.2.1線性范圍

四家實驗室測定巖藻糖的濃度線性范圍見表4，從表中可知，呈線性的濃度最低可至本

19

方法規定的5.0×10-3mmol/L，最高能達到本方法規定的6.0mmol/L。

表4巖藻糖測定的濃度線性范圍、線性方程和相關系數

實驗室線性范圍（mmol/L）線性方程相關系數相關顯著性水平濃度點數

本實驗室5.0×10-3~6.0Y=6.032X+0.210.9984<0.0110

國家水產品質

量監督檢驗中5.0×10-3~6.0Y=5.595X-0.170.9995<0.0110

心

農業部漁業產

品質量監督檢

5.0×10-3~6.0Y=5.639X-0.280.9986<0.0110

驗測試中心

（煙臺）

青島市產品質

5.0×10-3~6.0Y=5.529X-0.340.9998<0.0110

量監督檢驗所

6.7.2.2檢出限和定量限

高效液相色譜法一般以信噪比≥3作為檢出限，以信噪比≥10作為定量限。四家實驗室

用本標準規定方法測定時，巖藻糖檢出限均達到1.2×10-3mmol/L，定量限均達到5.0×10-3

mmol/L（見表5），符合本方法標準規定的檢出限和定量限。

表5巖藻糖的檢出限和定量限

實驗室檢出限（mmol/L）定量限（mmol/L）

本實驗室1.2×10-35.0×10-3

國家水產品質量監督檢驗中心1.2×10-35.0×10-3

農業部漁業產品質量監督檢驗測試中

1.2×10-35.0×10-3

心（煙臺）

青島市產品質量監督檢驗所1.2×10-35.0×10-3

6.7.2.3方法回收率

用刺參口服液做為本底，進行加標回收試驗，添加三個水平的巖藻糖，即0.05mmol/L、

0.9mmol/L和6.0mmol/L，每種試樣每個添加量測六份。根據各實驗室試驗報告統計的加標

回收率見表6。從表6可見，用本方法測定巖藻糖三個加標水平的回收率最低為71.9%，最

高為104.7%，符合檢測方法標準的制定要求。

20

表6巖藻糖加標回收率（%）范圍和平均值

加標水平（mmol/L）

實驗室

0.050.96.0

本實驗室82.9~95.6(88.9)86.8~99.6(94.8)84.7~99.1(92.3)

國家水產品質量監督

71.9~83.6(78.4)87.9~104.7(96.0)76.1~91.5(