第2章

細(xì)胞工程第2節(jié)

動物細(xì)胞工程二

動物細(xì)胞融合技術(shù)與單克隆抗體復(fù)習(xí)回顧-植物體細(xì)胞雜交技術(shù)A細(xì)胞B細(xì)胞A原生質(zhì)體B原生質(zhì)體正在融合的原生質(zhì)體雜種細(xì)胞愈傷組織雜種植株移栽后的植株①①②③④⑤⑥那么，有沒有技術(shù)能讓不同種動物的體細(xì)胞進行雜交，培育出集不同細(xì)胞的優(yōu)勢于一身的動物細(xì)胞呢？植物體細(xì)胞雜交技術(shù)的優(yōu)勢：打破生殖隔離，實現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交育種，培育了植物新品種。復(fù)習(xí)回顧-人——鼠細(xì)胞熒光標(biāo)記融合實驗融合細(xì)胞細(xì)胞融合37℃40min正在融合的細(xì)胞紅色熒光染料標(biāo)記膜蛋白綠色熒光染料標(biāo)記膜蛋白人細(xì)胞小鼠細(xì)胞該實驗說明：細(xì)胞膜具有流動性一、動物細(xì)胞融合技術(shù)使兩個或多個動物細(xì)胞結(jié)合形成一個細(xì)胞的技術(shù)。形成具有原來兩個或多個細(xì)胞的遺傳信息的雜交細(xì)胞

細(xì)胞膜的流動性1.概念：4.結(jié)果：2.原理：3.誘導(dǎo)方式物理法：離心、振動、電激化學(xué)法：聚乙二醇（PEG)生物法：滅活的病毒動物細(xì)胞融合特有一、動物細(xì)胞融合技術(shù)滅活是指用物理或化學(xué)手段使病毒或細(xì)菌失去感染能力，但并不破壞它們的抗原結(jié)構(gòu)。滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理是：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能夠與細(xì)胞膜上的糖蛋白發(fā)生作用，使細(xì)胞互相凝聚，細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子和脂質(zhì)分子重新排布，細(xì)胞膜打開，細(xì)胞發(fā)生融合。動物細(xì)胞融合實質(zhì)及完成的標(biāo)志：細(xì)胞核的融合滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理19世紀(jì)30年代，科學(xué)家曾在患肺結(jié)核、天花和麻疹等疾病的病人的病理組織中，觀察到多核細(xì)胞。如何解釋這一現(xiàn)象？病人體內(nèi)的病毒等誘導(dǎo)多個體細(xì)胞融合形成了多核細(xì)胞。一、動物細(xì)胞融合技術(shù)4.意義：突破了有性雜交的局限，使遠(yuǎn)緣雜交成為可能。5.應(yīng)用：（1）細(xì)胞融合技術(shù)已經(jīng)成為研究細(xì)胞遺傳、細(xì)胞免疫、腫瘤和培育生物新品種等的重要手段。（2）利用動物細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來的雜交瘤技術(shù)，為制造單克隆抗體開辟了新途徑。至今，種間、屬間、科間，甚至動植物之間融合都已獲得了成功。生物種類細(xì)胞來源成功年代酵母菌—雞原生質(zhì)體—血紅細(xì)胞1975年人—胡蘿卜腹水癌細(xì)胞—原生質(zhì)體1976年人—小鼠纖維肉瘤細(xì)胞——畸胎瘤細(xì)胞1978年比較植物體細(xì)胞雜交與動物細(xì)胞融合技術(shù)項目植物體細(xì)胞雜交動物細(xì)胞融合原理步驟誘導(dǎo)方法結(jié)果意義細(xì)胞膜的流動性和植物細(xì)胞的全能性細(xì)胞膜的流動性、細(xì)胞增殖酶解法去掉細(xì)胞壁后，誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種體細(xì)胞，再經(jīng)過植物組織培養(yǎng)形成雜種植株分散成單個細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)胞融合物理方法、化學(xué)方法、滅活病毒形成雜種植株形成雜種細(xì)胞克服遠(yuǎn)緣雜交不親和障礙物理方法、化學(xué)方法二、單克隆抗體及其應(yīng)用向動物體內(nèi)反復(fù)注射某種抗原，使動物產(chǎn)生抗體，然后從動物血清中分離所需抗體。1.早期獲得抗體的方法：產(chǎn)量低，純度低，制備的抗體特異性差、反應(yīng)不靈敏反復(fù)注射動物體內(nèi)抗原多種漿細(xì)胞多種抗體（血清）每一個漿細(xì)胞只能產(chǎn)生一種特異性抗體體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體多達(dá)百萬種缺點：二、單克隆抗體及其應(yīng)用2.單克隆抗體的制備思路（1）B淋巴細(xì)胞特點：①哺乳動物感染病原體后，體內(nèi)會形成相應(yīng)的B淋巴細(xì)胞，這些細(xì)胞能分泌抗體，抗體識別并特異性結(jié)合病原體，從而抑制病原體的增殖等。②動物體內(nèi)產(chǎn)生的特異性抗體種類超過百萬種，但每一個B淋巴細(xì)胞只分泌一種特異性抗體。③要想獲得大量單一抗體，必須克?。ù罅吭鲋常﹩我坏腂淋巴細(xì)胞，形成細(xì)胞群。④面臨困難：在體外培養(yǎng)條件下，一個B淋巴細(xì)胞是不可能無限增殖的。實質(zhì)是漿細(xì)胞二、單克隆抗體及其應(yīng)用（2）骨髓瘤細(xì)胞特點：在體外培養(yǎng)條件下，能大量增殖。一種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞（能產(chǎn)生抗體）（能大量增殖）融合細(xì)胞（既能產(chǎn)生抗體，又能大量增殖）雜交瘤細(xì)胞既能大量增殖，又能產(chǎn)生足夠數(shù)量的特定抗體。單克隆抗體：由單個B淋巴細(xì)胞經(jīng)過克隆（無限增殖），形成基因型相同的細(xì)胞群，由這一細(xì)胞群所產(chǎn)生的化學(xué)性質(zhì)單一、特異性強的抗體。2.單克隆抗體的制備思路由于發(fā)明了單克隆抗體的制備技術(shù)，米爾斯坦和科勒于1984年獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。二、單克隆抗體及其應(yīng)用3.單克隆抗體的制備過程培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合注射特定的抗原從脾中提取誘導(dǎo)融合能產(chǎn)生抗體，但不能大量增殖不能產(chǎn)生抗體，但能大量增殖PEG融合法、電融合法、滅活病毒誘導(dǎo)法（1）用特定的抗原對小鼠進行免疫，并從該小鼠的脾中得到能產(chǎn)生特定抗體的B淋巴細(xì)胞。二、單克隆抗體及其應(yīng)用3.單克隆抗體的制備過程多種雜交細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞(既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體)若只考慮細(xì)胞的兩兩融合，融合形成的細(xì)胞有幾種？需要的是？B-B細(xì)胞B-瘤細(xì)胞瘤-瘤細(xì)胞3種第一次篩選（2）用特定的選擇培養(yǎng)基（HAT培養(yǎng)基）進行篩選：在該培養(yǎng)基上，未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長。資料卡：細(xì)胞合成DNA有D和S兩條途徑，其中D途徑能被氨基蝶呤阻斷。免疫的B淋巴細(xì)胞中有這兩種DNA的合成途徑，但它不能分裂增殖，其本身也不能在體外長期存活。鼠骨髓瘤細(xì)胞中只有D途徑，沒有S途徑，但它能不斷分裂增殖。如果它的D途徑被阻斷的話，它會因不能合成DNA而死。培養(yǎng)基中加入氨基蝶呤二、單克隆抗體及其應(yīng)用3.單克隆抗體的制備過程（3）對上述經(jīng)選擇培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選，就可獲得足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的細(xì)胞。抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞①將雜交瘤細(xì)胞群稀釋，約每孔1個進行培養(yǎng)（克隆化培養(yǎng)）；②一段時間后，用標(biāo)記的抗原檢測每個小孔上清液里是否含有我們需要的特異性的抗體（抗原抗體能結(jié)合即為陽性孔）；③陽性孔中的細(xì)胞還不能保證是來自單個細(xì)胞，挑選陽性孔的細(xì)胞繼續(xù)進行有限稀釋，一般需進行3～4次，直至確信每個孔中增殖的細(xì)胞為單克隆細(xì)胞。檢測方法：抗原—抗體雜交技術(shù)二、單克隆抗體及其應(yīng)用多孔細(xì)胞培養(yǎng)板陽性克隆的篩選和克隆化培養(yǎng)用培養(yǎng)液有限稀釋克隆化培養(yǎng)與抗體檢測二、單克隆抗體及其應(yīng)用（4）將抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞在體外條件下大規(guī)模培養(yǎng)，或注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖。（5）從細(xì)胞培養(yǎng)液或小鼠腹水中獲取大量的單克隆抗體。抗體檢測呈陽性的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液提取小鼠腹水中提取單克隆抗體特異性強，靈敏度高，可大量制備3.單克隆抗體的制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用4.單克隆抗體制備過程中兩次篩選的比較項目第一次篩選第二次篩選篩選原因目的

篩選方法

篩選出雜交瘤細(xì)胞篩選出能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞誘導(dǎo)融合后得到多種融合細(xì)胞，還有未融合的細(xì)胞等由于小鼠在生活中還受到其他抗原的刺激，所以經(jīng)選擇培養(yǎng)獲得的雜交瘤細(xì)胞中有能產(chǎn)生其他抗體的細(xì)胞用特定的選擇培養(yǎng)基篩選：未融合的親本細(xì)胞和融合的具有同種核的細(xì)胞都會死亡，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能生長。用96孔板培養(yǎng)，在每一個孔中盡量只接種一個雜交瘤細(xì)胞的情況下進行克隆化培養(yǎng)和抗體檢測，經(jīng)多次篩選得到足夠數(shù)量的能分泌所需抗體的雜交瘤細(xì)胞。二、單克隆抗體及其應(yīng)用二、單克隆抗體及其應(yīng)用應(yīng)用到的技術(shù)：原理：細(xì)胞膜的流動性多種雜交細(xì)胞及未融合的細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞多種B淋巴細(xì)胞給小鼠注射特定抗原提取雜交瘤細(xì)胞第一次篩選：用特定的選擇性培養(yǎng)基足夠數(shù)量的能產(chǎn)生所需抗體的雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)注射到小鼠腹腔大量單克隆抗體第二次篩選：克隆化培養(yǎng)、抗體檢測（既能迅速大量增殖，又能產(chǎn)生抗體）動物細(xì)胞融合動物細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖單克隆抗體制備過程二、單克隆抗體及其應(yīng)用思考?討論單克隆抗體的應(yīng)用【資料1】用抗人絨毛膜促性腺激素單克隆抗體做成的“早早孕診斷試劑盒”。在妊娠第8天就可以作出診斷，這比原來的診斷方法提前了10d左右，可以避免孕婦在不知道妊娠的情況下因服用藥物而對胎兒造成不利影響。該方法檢測的準(zhǔn)確率在90%以上。二、單克隆抗體及其應(yīng)用抗體藥物接頭ADC被細(xì)胞吞噬釋放藥物溶酶體裂解細(xì)胞凋亡【資料2】使用高效的細(xì)胞毒素類藥物進行化療可以有效殺傷腫瘤細(xì)胞。但細(xì)胞毒素沒有特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時還會對健康細(xì)胞造成傷害，這限制了它在臨床上的應(yīng)用?？贵w-藥物偶聯(lián)物（antibody-drugconjugates,ADC）通過將細(xì)胞毒素與能特異性識別腫瘤抗原的單克隆抗體結(jié)合，實現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷。ADC通常由抗體、接頭和藥物(如細(xì)胞毒素)三部分組成，它的作用機制如下圖所示。思考?討論單克隆抗體的應(yīng)用二、單克隆抗體及其應(yīng)用討論1.ADC的抗體和藥物各具有什么作用？抗體主要發(fā)揮靶向運輸作用，即通過特異性結(jié)合靶細(xì)胞表面的抗原，將連接的藥物輸送到靶細(xì)胞；藥物發(fā)揮治療效應(yīng)，如殺傷靶細(xì)胞。思考?討論單克隆抗體的應(yīng)用討論2.除了細(xì)胞毒素，還有哪些物質(zhì)理論上可以作為ADC偶聯(lián)的藥物？①可以用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體進行靶向放療；②一些作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的藥物可以通過阻斷腫瘤細(xì)胞的信號通路來抑制其生長，理論上也可以將這些藥物與單克隆抗體結(jié)合進行治療。二、單克隆抗體及其應(yīng)用討論3.單克隆抗體診斷試劑盒和ADC在臨床應(yīng)用上各具有什么優(yōu)勢？①單克隆抗體診斷試劑盒中的單克隆抗體只與特定的抗原反應(yīng)，因此檢測的特異性和靈敏度大大提高；生產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)、冷凍保存和復(fù)蘇利用，有利于控制產(chǎn)品的質(zhì)量和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)診斷試劑盒；②ADC能夠協(xié)同發(fā)揮抗體特異性識別的靶向作用和細(xì)胞毒素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，因此它在臨床上具有靶點清楚、毒副作用小等優(yōu)點。思考?討論單克隆抗體的應(yīng)用二、單克隆抗體及其應(yīng)用5.單克隆抗體的優(yōu)點（1）能準(zhǔn)確地識別抗原的細(xì)微差異；（2）與特定抗原發(fā)生特異性結(jié)合；（3）可以大量制備。6．單克隆抗體的應(yīng)用（1）廣泛用作診斷試劑利用同位素或熒光標(biāo)記的單克隆抗體在特定組織中成像的技術(shù)，可定位診斷腫瘤、心血管畸形等疾病。（2）運載藥物：如抗體-藥物偶聯(lián)物（ADC）。生物導(dǎo)彈=單克隆抗體+藥物，治療腫瘤。(單抗導(dǎo)向，藥物為彈頭)優(yōu)點：位置準(zhǔn)確、療效高、副作用?。?）直接用于治療疾病。1.下列有關(guān)動物細(xì)胞融合與植物體細(xì)胞雜交比較的敘述，錯誤的是（

）A.它們的原理都涉及細(xì)胞膜的流動性B.都可以用電融合法或