抗生素抗性基因在養殖廢水中的分布與去除導讀：畜禽養殖場作為抗生素抗性基因的一個熱點區，其產生的廢水中存在大量的抗生素抗性基因，直接排放將會污染接受的水體.本討論以微生物固化曝氣技術為核心，構建了一個包含沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘的養殖廢水處理系統.采納高通量熒光定量PCR技術，探究各種抗性基因在進水、各處理池和出水中的種類、多樣性和豐度的變化以及可能的影響因素.討論發覺：（1）微生物固化曝氣技術能有效降低養殖廢水中抗性基因的種類和多樣性；（2）該技術也能有效去除養殖廢水中抗性基因的肯定豐度，去除率高達93.6%；（3）養殖廢水出水中抗性基因肯定豐度仍高于自然水體，其直接排放仍有抗性基因污染風險；（4）畜禽養殖廢水中TN和土霉素的含量與很多抗生素抗性基因總豐度存在正相關性.通過對TN和土霉素的去除或者掌握使用，可以有效降低養殖廢水中的抗性基因。抗生素在預防、治療微生物引起的疾病時具有良好的療效，同時還能促進畜禽生長，所以被廣泛用于畜禽養殖場[1-2].然而大多數抗生素并不能被動物腸道完全汲取，大部分仍以母體或者相關代謝產物的形式排出體外[2-3].這些排出體外的抗生素會對環境中的微生物產生一個選擇壓力，誘導和選擇環境微生物產生耐藥性，增加環境中抗性基因的豐度和多樣性[4].此外，喂食了抗生素的動物，其腸道內抗性基因的豐度和多樣性均有所提高[5].動物腸道內的耐藥菌和抗性基因隨著動物的排泄進入環境中，直接增加了環境中抗性基因的豐度及多樣性。抗生素抗性基因是一種新型的環境污染物[3，6].攜帶抗生素抗性基因的微生物（如致病菌等）能對相應的抗生素產生耐藥性，這使得抗生素在治療由致病菌引起的疾病時療效下降甚至無效，嚴峻威逼人類健康[4，7].2011年德國爆發“毒黃瓜”大事，在歐洲至少9個國家擴散，造成33人死亡，超過3000人受到感染，其中至少470人消失腎功能衰竭并發癥，引起本次疫情的就是一種新型的高傳染性攜帶多種抗性基因的致病菌[4].在美國每年有超過200萬人感染耐藥病原體，其中有14000人死亡[6]。固化微生物污水凈化器（biocleaner）是BioCleaner公司研發的由微生物發生器與高效曝氣裝置組合的污水治理專用設備.對該裝置處理養殖廢水的討論結果表明：（1）微生物固化曝氣技術能有效去除常規污染物，除TP外，COD和NH+4-N的出水濃度均能達到《畜禽養殖業污染物排放標準》（GB18596—2001）；（2）該技術對抗生素的去除效果依抗生素的種類而變，對4種四環素類抗生素的去除率高達85%以上；對大環內酯類中的阿奇霉素的去除率為62.8%；對大環內酯類中的羅紅霉素和氟喹諾酮類抗生素則基本無效[8]。本討論在之前討論[8]的基礎上，采納高通量熒光定量PCR技術，進一步討論：（1）養殖廢水中各種抗生素抗性基因在進水、各處理池、出水中的分布與變化；（2）固化曝氣技術對各種抗生素抗性基因的去除效果；（3）各種抗性基因的去除效果與常規污染物和抗生素的去除是否有耦合關系。1材料與方法（MaterialsandMethods）1.1系統運行處理系統采納美國Biocleaner技術，由沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘組成.各處理單元的尺寸（長×寬×高）分別為：沉淀池25m×20m×5m、一級處理池25m×20m×2m、二級處理池25m×20m×2m和氧化塘40m×30m×4m[8].各處理單元用管道連接，根據高程由高到低，依次排列沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘，省去不同處理單元間依靠泵為動力進行的水力流淌.該處理系統廢水來自于四周多個養殖場直排的清糞水，每日污水處理量為150—200t.在一級處理和二級處理池中分別放置一個曝氣機和一個Biocleaner設備，曝氣機功率為2.2kV，采納人工開啟電閘掌握，運行時間為24h·d-1.Biocleaner設備裝載微生物載體，無需人工維護.系統自2013年8月試運行，經過12個月調試，于2014年8月穩定運行.本討論以穩定運行監測數據進行分析。1.2樣點布設與采樣點概況討論樣地位于龍巖市某養殖廢水處理示范點.依據處理系統的運行狀況，于2014年8月，進行1次系統地采樣，采集12個點，其中進水1個（Ⅰ），沉淀池2個（Ⅱ），一級處理池（Ⅲ）、二級處理池（Ⅳ）和氧化塘（Ⅴ）各3個（圖1）.分析測試了12個點的NH+4-N、NO-3-N、TN、TP、COD、TOC、9種抗生素（4種四環素：土霉素、四環素、金霉素、強力霉素；2種大環內酯類抗生素：羅紅霉素、阿奇霉素；3種氟喹諾酮類抗生素：氧氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星），討論結果已經發表[8].本討論選取進水以及各處理單元出水樣品（Ⅰ-1、Ⅱ-2，Ⅲ-2、Ⅳ-3、Ⅴ-3）進行抗生素抗性基因分析。1.3DNA提取依據水樣的渾濁程度，量取肯定體積的水樣倒入50mL離心管中，12000r·min-1轉速離心10min，倒掉上清液，在每個離心管中加入1mL生理鹽水，將底部的沉淀充分混勻.再將樣品全部轉移至新的1.5mL離心管中，18000r·min-1離心5min后，倒掉上清液.若所得固體沉淀樣品過少，則重復上述操作，直到所得樣品約為0.5g.然后加入978μLPBS緩沖液（FastDNASPINkitforSoil試劑盒，MPBiomedical，美國），并全部轉移到試劑盒中的LysingMatrixE管，按試劑盒供應的操作說明進行提取.詳細步驟如下：加入122μLMTBuffer，在FastPrep儀器中進行振蕩破裂均質化（時間30s，速度6.0m·s-1），然后對LysingMatrixE管進行離心處理（14000r·min-1，15min）.將上清液轉移到一個新的2mL離心管中，加入250μLPPS，并用手搖10次進行混合.對樣品再一次進行離心（14000r·min-1，5min），將上清液轉移到一個新的2mL離心管中，并加入1mLBindingMatrixSuspension，用手上下顛倒2min，使DNA附著到基質上，靜置約3min.去除約500μL上清，分多次將BindingMatrix全部轉移到SPINTMFilter中，加入500μLSEWS-M到SPINTMFilter中對BindingMatrix進行清洗，通過離心去除SEWS-M，在室溫下風干SPINTMFilter5min.最終加入70μLDES溶液進行DNA洗脫。<imgsrc=“/UploadFiles/2020001/20209/Env/202009121153412598.jpg”alt=“1.jpg”width=“591”height=“285”/1.4高通量熒光定量PCR本試驗采納SmartChipReal-timePCRSystems（WaferGen公司，美國）的高通量熒光定量的反應平臺[9-11].總共使用了296對引物，由于一個基因有多個引物，因此共有214對抗性基因的引物（基本上掩蓋目前全部的抗性基因種類），5對可移動原件基因引物和1對16SrRNA基因引物.反應體系和反應程序與Ouyang等[11]和黃福義等[12]的全都.采納100nL反應體系，各試劑濃度為：LightCycler480SYBRGreenⅠMasterMix1×，DNA濃度5ng·μL-1，BSA濃度1ng·μL-1和1μmol·L-1引物.反應程序為：95℃預變性10min，95℃變性30s，60℃退火延長30s，40個循環；程序自動升溫進行溶解曲線分析.定量PCR數據處理參照文獻進行[11，13]，以CT值31作為儀器的檢測閾值.每個樣品進行3次技術重復，只有當每個樣品中3個重復同時檢測出時，才認為目的基因被有效檢出.抗性基因相對拷貝數的計算參照公式（1）和（2）[5，11，13]，然后通過16SrRNA肯定拷貝數與抗性基因相對拷貝數計算出抗性基因的肯定拷貝數（公式3）.基因拷貝數=10（（31-CT）/（10/3））（1）抗性基因相對拷貝數（相對豐度）=抗性基因拷貝數/16SrRNA基因拷貝數（2）抗性基因肯定豐度=抗性基因相對拷貝數×16SrRNA基因的肯定拷貝數（3）1.516SrRNA定量采納Roche480定量PCR儀測定樣品中的16SrRNA基因，并采納標準質粒外標法對其豐度進行肯定定量[11].標準質粒原始濃度為1.39×109copies·μL-1，標準曲線（10倍稀釋）的范圍為1.39×103—1.39×109copies·μL-1.使用20μL反應體系：10μL2×LightCycler480SYBRGreenⅠMasterMix，上下游引物各1μL，1μLDNA模板和7μL無菌水.反應運行程序為：95℃預變性5min，40個循環（95℃變性15s，60℃退火1min，72℃延長15s），儀器自動添加溶解曲線程序.用滅菌超純水代替樣品進行陰性對比，每個樣品均做3次重復.1.6數據處理與分析平均值以及標準差使用Excel2007版本進行計算；顯著性分析和Pearson相關分析使用SPSS17.0版本進行分析；在計算檢測到的基因數量時，由于一個基因有多個引物，假如有多對引物檢測出同一個基因，在計算時只算檢出一個.2結果與爭論（ResultsandDiscussion）2.1抗性基因多樣性在整個處理系統中，全部水樣中共檢出123種抗性基因和5種可移動遺傳元件.進水中檢測出111種抗性基因和可移動遺傳元件（MGES），沉淀池、一級處理池中均檢測出115種，二級處理池和出水中分別檢測出108種和95種，比進水（111種）略有降低（圖2）.此外，二級處理池和出水的Shannon和InverseSimpson指數也均低于進水（表1）.這說明微生物固化曝氣技術能降低養殖廢水中抗性基因的多樣性.該出水是直接排入九龍江流域的.在九龍江流域城市河段的2個水樣中，檢測出的抗性基因數量分別為131和161種[11].本討論中畜禽養殖廢水出水中所檢測到的抗性基因種類較少，為90個.這說明九龍江流域中抗性基因的來源不僅有畜禽養殖廢水這一種途徑，應當還有來自于城市污水處理廠這一途徑。<imgsrc=“/UploadFiles/2020001/20209/Env/202009121153413647.jpg”alt=“2.jpg”width=“484”height=“333”/依據抗性基因對抗生素的抗性機制，可將檢測到的抗性基因分為抗生素失活（antibioticdeactivate）、抗生素外排（effluxpump）、細胞核糖體愛護（cellularprotection）和其他（unknown）4種類型.抗生素失活機制的抗性基因，在各種樣品中占46.67%—50.91%（表2）.黃福義等[12]討論長期施用豬糞的水稻土以及Ouyang等[11]討論九龍江流域的水體時，也發覺抗生素失活機制的抗性基因所占比例最大，分別為：42.59%和49.06%.這說明攜帶抗生素失活機制基因的微生物是各種環境介質中常見的種類.抗生素外排機制的抗性基因，其檢出種類僅次于抗生素失活機制的抗性基因，從進水的30.19%到出水的32.22%.攜帶抗生素外排抗性基因的細菌，不僅可以將抗生素排出細胞外，還能將重金屬和其它有毒分子等排出體外[14].這使得攜帶抗生素外排泵抗性基因的微生物能更好地適應環境.從抗性基因所對應的抗生素類型來看，所檢測出的抗性基因掩蓋了所劃分的9種類型：氨基糖苷類抗性基因（aminoglycoside）、β-內酰胺類抗性基因（beta-lactamase）、氯霉素類抗性基因（chloramphenicol）、大環內酯類林肯酰胺類鏈陽性菌素B抗性基因（MLSB）、多重耐藥基因（multidrug）、磺胺類抗性基因（sulfonae）、四環素類抗性基因（tetracycline）、萬古霉素抗性基因（vancomycin）以及其它類型抗性基因（others）.隨著污水處理的不斷深化，9種類型的抗性基因數量在各個處理池間無明顯差異，在各處理池間所占比例分別為：17.78%—19.42%、14.15%—17.78%、1.82%—2.22%、12.22%—17.92%、19.81%—21.11%、1.82%—2.22%、12.26%—14.44%、3.64%—5.66%和7.27%—8.18%（表2）.相對而言，多重耐藥基因檢出種類在各處理單元中所占比例最大.多重耐藥基因會使攜帶其的微生物對多種抗生素具有耐藥性，進而有可能使微生物成為“超級細菌”.本討論說明該畜禽養殖廢水對人類健康有“超級細菌”的潛在威逼。<imgsrc=“/UploadFiles/2020001/20209/Env/202009121153415358.jpg”alt=“3.jpg”width=“665”height=“518”/2.2抗性基因豐度經微生物固化曝氣技術處理后，養殖廢水中抗性基因肯定豐度顯著削減（圖3）.進水中抗性基因的肯定豐度為3.8×1010copies·mL-1，而出水中為2.4×109copies·mL-1，去除率達93.6%.沉淀池、一級處理池、二級處理池和氧化塘對抗性基因的去除貢獻不一樣：沉淀池中抗性基因肯定豐度為3.1×1010copies·mL-1，去除率為18.0%；一級處理池中抗性基因肯定豐度為6.6×109copies·mL-1，去除率為64.7%；二級處理池中抗性基因肯定豐度為3.2×109copies·mL-1，去除率為9.0%；氧化塘中抗性基因肯定豐度為2.4×109copies·mL-1，去除率為1.9%.一級處理池對抗性基因去除貢獻最大，為64.7%.抗性基因的相對豐度在各處理池間并沒有顯著區分（圖4），進水為2.37，出水為3.14.這意味著抗性基因肯定豐度的削減是由于廢水中16SrRNA肯定豐度（或者說微生物數量）削減所引起的，而不是該處理系統能選擇性去除抗生素抗性基因.此外，相對于進水，出水中抗性基因肯定豐度雖然削減了許多，但仍比自然水體高出不少.Ouyang等[11]討論發覺九龍江流經城市的河段水體中抗性基因的肯定豐度為9.7×107—1.0×108copies·mL-1，發源地河段水體中抗性基因的肯定豐度為7.2×105copies·mL-1.這表明經微生物固化曝氣技術處理后，養殖廢水中抗生素抗性基因仍有可能對排放的水體產生污染.隨著養殖廢水的不斷處理，不同抗性機制抗性基因的肯定豐度比例也在發生變化（表3）.攜帶抗生素失活的抗性基因在各處理池之間無顯著變化，進水中為43.2%，出水中為40.4%；攜帶細胞核糖體愛護的抗性基因在逐步降低，在進水、沉淀池、一級處理池、二級處理池和出水中依次為23.5%、15.6%、6.2%、2.4%和5.3%；攜帶外排泵機制的抗性基因在逐步增加，在進水、沉淀池、一級處理池、二級處理池和出水中依次為33.3%、35.6%、48.5%、58.4%和54.2%.這進一步說明，攜帶外排泵機制的抗性基因的微生物相對于攜帶其它抗性機制的基因的微生物來說，具有更好的環境適應性.從抗性基因所對應的抗生素類型來看（表3）：（1）氨基糖苷類抗性基因和四環素類抗性基因在各處理單元中均穩定地占有較高的比例（分別為30.4%—40.3%和25.1%—29.9%）；（2）多重耐藥基因雖然檢出種類最多，但是它們的肯定豐度在進水中并不是最多的.然而，隨著養殖廢水的不斷處理，其所占比例逐步增加，在進水、沉淀池和一級處理池中依次為：19.2%、22.5%和26.5%，并在二級處理池（34.0%）和出水（32.8%）中超過氨基糖苷類成為污水中豐度最高的抗性基因；（3）雖然大環內酯類林肯酰胺類鏈陽性菌素B抗性基因及β-內酰胺類抗性基因在各處理池中檢出的數量不少（表1），但是肯定豐度所占的比例卻很少（表3）；（4）在整個處理系統中，萬古霉素抗性基因肯定豐度所占的比例最小，在0.01%—0.02%之間，這應當是由于萬古霉素抗生素僅用于人類疾病治療[11]，而生豬養殖行業不使用萬古霉素.2.3抗性基因與常規污染物、抗生素相關性分析Forsberg等[15]討論發覺微生物群落組成是土壤抗性基因含量的主要打算因素；Su等[9]同樣發覺抗性基因與微生物群落結構顯著相關.氮、磷等常規污染物，作為微生物生長繁殖的必要養分物質，可以通過影響微生物的生長，進而影響抗性基因的豐度.將常規污染物濃度[8]與不同抗性機制抗性基因和不同抗生素種類抗性基因的肯定豐度進行相關性分析（表4）發覺，TN與外排泵機制抗性基因、磺胺類抗性基因、四環素類抗性基因和總抗性基因的肯定豐度呈顯著正相關（P0.05），這說明攜帶這幾類抗性基因的微生物的生長和繁殖受環境中總氮水平的制約.<imgsrc=“/Uploa