利用PCR-DGGE技術(shù)分析病死豬堆肥過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)和種類特征集約化養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展的同時,也造成來自畜禽糞便、污水以及病死畜禽殘體的嚴(yán)重污染。相對于畜禽糞便對環(huán)境的污染,死畜禽由于攜帶大量的病原微生物,如果不及時處理,對人和動物的危害更大更直接。據(jù)統(tǒng)計,養(yǎng)殖場的畜禽死亡率在5%~10%之間,而生豬的死亡率在8%~12%之間,遇到重大疫情,死亡率還會升高。因此,對死畜禽進(jìn)行無害化處理是解決環(huán)境污染,實現(xiàn)畜牧業(yè)良性發(fā)展的必由之路。堆肥是一個可被生物降解的有機(jī)質(zhì)堆,通過好氧微生物分解成穩(wěn)定的、類似土壤的腐殖質(zhì)過程。病死豬堆肥相對于傳統(tǒng)的死豬處理方法,如,掩埋、焚燒、高溫熬煮等,具有更加安全和環(huán)保的優(yōu)勢。堆肥過程的物質(zhì)轉(zhuǎn)化歸根到底是由堆肥體系中微生物的代謝活動來完成。因此充分了解病死豬堆肥體系中微生物的菌群種類和動態(tài)分布,挖掘病死豬堆肥體系的優(yōu)勢微生物,為開發(fā)病死豬堆肥微生物菌劑,促進(jìn)腐熟進(jìn)程,縮短堆肥周期奠定基礎(chǔ)。本研究通過開展6個月為一個堆肥周期的病死豬尸體自然發(fā)酵試驗,檢測了堆肥過程不同階段的理化參數(shù),利用PCR-DGGE技術(shù)分析了堆肥過程不同階段的微生物種類,構(gòu)建了系統(tǒng)樹。分離和篩選出5株高溫優(yōu)勢菌,并通過生理生化實驗和16srRNA測序?qū)@5株優(yōu)勢菌進(jìn)行了初步鑒定。主要研究結(jié)果如下:(1)實時監(jiān)測病死豬堆肥不同階段不同高度的溫度變化,對不同階段的樣品含氮量、含水率、pH值、有機(jī)質(zhì)含量、有效活菌數(shù)、蛔蟲死亡率、重金屬含量和類大腸桿菌數(shù)理化參數(shù)進(jìn)行測定和分析。堆肥試驗中堆體溫度的變化經(jīng)歷了典型的升溫期、高溫期、降溫期三個階段,且堆體上、中、下三層溫度的變化趨勢基本是一致的,前3個月是有機(jī)質(zhì)降解階段,微生物活動頻繁,中層溫度近70℃;pH變化遵循先下降-再升高-再下降的進(jìn)程趨勢。堆肥結(jié)束,病死豬尸體軟組織全部降解,堆料腐熟,外觀成黑色顆粒如腐殖質(zhì),依稀可見骨頭和牙齒,但這些難降解物質(zhì)很脆,容易捏碎。氮含量為5.3%左右,有機(jī)質(zhì)含量為53%,大腸桿菌值低于100個/g,蛔蟲卵殺滅率接近于100%,有效活菌數(shù)接近于0.35億/g,堆體周圍沒有活的蛆、蛹或新羽化的成蠅,達(dá)到了《糞便無害化衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB7959-87)》的規(guī)定。(2)提取了微生物基因組總DNA,完成了16srRNAV6~V8區(qū)片段的PCR擴(kuò)增。通過變形梯度凝膠電泳,得到了18個樣品的DGGE圖譜。通過QuantityOne軟件分析DGGE圖譜發(fā)現(xiàn),各個時期的細(xì)菌豐富度都比較高。前三個月的細(xì)菌的分布比較凌亂,后三個月的細(xì)菌分布趨于穩(wěn)定。致病菌只在前三個月存在,后三個月致病菌被殺死。分別對切膠回收后的45條優(yōu)勢條帶測序,并與已知序列在NCBI上進(jìn)行同源性比對,得到了這45條序列的詳細(xì)結(jié)果并完成了它們的系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),堆肥過程中存在大量未知細(xì)菌,它們在堆肥過程中的作用還有待探究。堆肥過程的優(yōu)勢菌為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslincheniformis)、枝芽孢桿菌(Virgibacillus)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)。(3)傳統(tǒng)培養(yǎng)并結(jié)合高溫處理,分離獲得了5株優(yōu)勢菌。通過生理生化鑒定、顯微鏡形態(tài)觀察和16srRNA測序,結(jié)果顯示,J1為未知菌與已知的Unculturedbacteriumclone(JF155193)相似率為98%,J2、J3和J5為Bacillussubtillisstrain,J4為Bacillusthuringiensisstrain。產(chǎn)淀粉酶酶活性由強(qiáng)至弱依次為