第二章發酵的流程

菌種擴大培養

第一節發酵的特點及流程

一、發酵的特點發酵和其他化學工業的最大區別在于它是生物體所進行的化學反響。其主要特點如下：1、發酵過程一般來說都是在常溫常壓下進行的生物化學反響，反響平安，要求條件也比較簡單。2、發酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他農副產品為主，只要參加少量的有機和無機氮源就可進行反響。微生物因不同的類別可以有選擇地去利用它所需要的營養。基于這—特性，可以利用廢水和廢物等作為發酵的原料進行生物資源的改造和更新。3、發酵過程是通過生物體的自動調節方式來完成的，反響的專一性強，因而可以得到較為單—的代謝產物。4、由于生物體本身所具有的反響機制，能夠專一性地和高度選擇性地對某些較為復雜的化合物進行特定部位地氧化、復原等化學轉化反響，也可以產生比較復雜的高分子化合物。5、發酵過程中對雜菌污染的防治至關重要。除了必須對設備進行嚴格消毒處理和空氣過濾外，反響必須在無菌條件下進行。如果污染了雜菌，生產上就要遭到巨大的經濟損失，要是感染了噬菌體，對發酵就會造成更大的危害。因而維持無菌條件是發酵成敗的關鍵。6、微生物菌種是進行發酵的根本因素，通過變異和菌種篩選，可以獲得高產的優良菌株并使生產設備得到充分利用，也可以因此獲得按常規方法難以生產的產品。7、工業發酵與其他工業相比，投資少，見效快，可以取得顯著的經濟效益。基于以上特點，工業發酵日益引起人們重視。和傳統的發酵工藝相比，現代發酵工程除了上述的發酵特征之外更有其優越性。除了使用微生物外，還可以用動植物細胞和酶，也可以用人工構建的“工程菌’來進行反響；反響設備也不只是常規的發酵罐，而是以各種各樣的生物反響器而代之，自動化連續化程度高，使發酵水平在原有根底上有所提高和和創新。

二、發酵過程的組成局部1、發酵過程的組成除某些轉化過程外，典型的發酵過程可以劃分成六個根本組成局部：〔1〕繁殖種子和發酵生產所用的培養基組份設定；〔2〕培養基、發酵罐及其附屬設備的滅菌；〔3〕培養有活性、適量的純種，接種入生產容器中；〔4〕微生物在最適合于產物生長的條件下，在發酵罐中生長；〔5〕產物萃取和精制；〔6〕過程中排出的廢棄物的處理。六個局部之間的關系如下圖。在建立發酵過程以前，首先要別離出產生菌，并改進菌種，使所產生的產物符合工業要求。3、發酵生產的條件

〔1〕某種適宜的微生物〔2〕保證或控制微生物進行代謝的各種條件〔培養基組成，溫度，溶氧pH等〕〔3〕進行微生物發酵的設備〔4〕提取菌體或代謝產物，精制成產品的方法和設備

第二節生產菌種的擴大培養

發酵罐容積幾百立方米。生產用種子是一個由實驗室制備到車間生產的過程。其生產方法與條件隨不同的生產品種和菌種種類而異。如細菌、酵母菌、放線菌或霉菌生長的快慢；產孢子能力的大小；營養、溫度、需氧等條件要求均有所不同。種子擴大培養應根據菌種的生理特性，選擇適宜的培養條件來獲得代謝旺盛、數量足夠的種子。種子接入發酵罐后，將使發酵生產周期縮短，設備利用率提高。種子液質量的優劣對發酵生產起著關鍵性的作用。種子擴大培養：是指將保存在砂土管、冷凍枯燥管中處于休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化后，在經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級放大培養而獲得一定數量和質量的純種過程。這些純種培養物稱為種子。發酵工業生產過程中的種子的必須滿足以下條件：〔1〕菌種細胞的生長活力強，移種至發酵罐后能迅速生長，緩慢期短；〔2〕生理性狀穩定；〔3〕菌體總量及濃度能滿足大容量發酵罐的要求；〔4〕無雜菌污染；〔5〕保持穩定的生產能力。在發酵生產過程中，種子制備的過程大致可分為兩個階段：〔1〕實驗室種子制備階段〔2〕生產車間種子制備階段一、實驗室種子的制備實驗室種子的制備一般采用兩種方式：產孢子能力強的及孢子發芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養基培養孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，可用液體培養法。〔一〕孢子的制備1、細菌孢子的制備細菌的斜面培養基多采用碳源限量而氮源豐富。培養溫度一般為37℃。細菌菌體培養時間1~2d，產芽孢的細菌培養5~10d。2、霉菌孢子的制備霉菌孢子的培養一般以大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農產品為培養基。培養的溫度一般為25~28℃。培養時間一般為4~14d。3、放線菌孢子的制備放線菌的孢子培養一般采用瓊脂斜面培養基，培養基中含有適合產孢子的營養成分，如麩皮、豌豆浸汁、蛋白胨和無機鹽等。培養溫度一般為28℃。培養時間5~14d。〔二〕液體種子制備1、好氧培養對于產孢子能力不強或孢子發芽慢的菌種，如產鏈霉素的灰色鏈霉菌〔S.griseus〕可以用搖瓶液體培養法。將孢子接入含液體培養基的搖瓶中，恒溫振蕩培養，獲得菌絲體，作為種子。其過程如下：試管→三角瓶→搖床→種子罐2、厭氧培養酵母菌〔啤酒，葡萄酒，清酒等〕其種子的制備過程如下：試管→三角瓶→卡式罐→種子罐例如:生產啤酒的酵母菌一般保存在麥芽汁瓊脂或MYPG培養基〔培養基配制：3g麥芽浸出物，3g酵母浸出物，5g蛋白胨，10g葡萄糖和20g瓊脂于1L水中〕的斜面上，于4℃冰箱內保藏。每年移種3-4次。將保存的酵母菌種接入含10ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養2-3d。再擴大至含有250-500ml麥芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培養2d.移種至含有5-10L麥芽汁的卡氏培養罐中，于15-20℃培養3-5d即可作100L麥芽汁的發酵罐種子。從三角瓶到卡氏培養罐培養期間，均需定時搖動或通氣，使酵母菌液與空氣接觸，以有利與酵母菌的增殖。二、生產車間種子制備種子罐的培養基因不同菌種而異，但其原那么為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，需氧菌，還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌〔絲〕體在培養液中均勻分布。1、種子罐的作用使孢子發芽，生長繁殖成菌〔絲〕體，接入發酵罐能迅速生長，到達一定的菌體量，以利于產物的合成。2、種子罐級數確實定種子罐級數：是指制備種子需逐級擴大培養的次數，取決于：〔1〕菌種生長特性、孢子發芽及菌體繁殖速度；〔2〕所采用發酵罐的容積。比方：細菌：生長快，種子用量比例少，級數也較少，二級發酵。茄子瓶→種子罐→發酵罐霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發酵孢子懸浮液→一級種子罐〔27℃,40h孢子發芽，產生菌絲〕→二級種子罐〔27℃，10~24h，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體〕→發酵罐放線菌：生長更慢，采用四級發酵酵母：比細菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子3、確定種子罐級數需注意的問題〔1〕種子級數越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌時機〔2〕種子級數太少，接種量小，發酵時間延長，降低發酵罐的生產率，增加染菌時機〔3〕雖然種子罐級數隨產物的品種及生產規模而定。但也與所選用工藝條件有關。如改變種子罐的培養條件，加速了孢子發芽及菌體的繁殖，也可相應地減少種子罐的級數。第三節種子質量的控制一、影響孢子質量的因素及控制影響孢子質量的因素通常有：培養基、培養條件、培養時間和冷藏時間等。1、培養基種子質量不穩定的主要原因是原材料質量波動。例如：在四環素、土霉素生產中，配制產孢子斜面培養基用的麩皮，因小麥產地、品種、加工方法及用量的不同對孢子質量的影響也不同。蛋白胨加工原料不同如魚胨或骨胨對孢子影響不同。原材料質量的波動，也會影響孢子質量。如微量元素Mg2+

、Cu2+

、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也會影響孢子的質量。水質的影響：地區不同、季節變化和水源污染，均可造成水質波動，影響種子質量。菌種在固體培養基上可呈現多種不同代謝類型的菌落，氮源品種越多，出現的菌落類型也越多，不利于生產的穩定。解決措施：〔1〕培養基所用原料要經過發酵試驗合格才可使用；〔2〕嚴格控制滅菌后培養基的質量；〔3〕斜面培養基使用前，需在適當溫度下放置一定時間；〔4〕供生產用的孢子培養基要用比較單一的氮源，作為選種或別離用的培養基那么采用較復雜的有機氮源。2、培養條件〔1〕溫度如土霉素生產菌種在高于37℃培養時，孢子接入發酵罐后出現糖代謝變慢，氨基氮上升提前，菌絲過早自溶，效價降低等現象。一般要嚴格控制孢子子斜面的培養溫度。〔2〕濕度制備斜面孢子培養基的濕度對孢子數量和質量有較大影響。例如土霉素生產菌種龜裂鏈霉菌孢子制備時發現：氣候枯燥地區孢子斜面長得較快，在含有少量水分的試管斜面培養基下部孢子長得較好，斜面上部由于水分迅速蒸發呈干疤狀，孢子稀少。在氣溫高含濕度大的地區，斜面孢子長得慢，主要由于試管下部冷凝水多而不利于孢子的形成。表2-1不同相對濕度對龜裂鏈霉菌斜面生長的影響相對濕度（%）斜面外觀活孢子計數（億/支）16.5~1925~3640~45上部稀薄下部稠略黃上部薄中部均勻發白一片白，孢子豐富，稍皺1.22.35.73、培養時間和冷藏時間〔1〕培養時間一般來說，衰老的孢子不如年輕的孢子，因為衰老的孢子已在逐步進入發芽階段，核物質趨于分化狀態。過于衰老的孢子會導致生產能力的下降。解決措施：孢子培養的時間應該控制在孢子量多、孢子成熟、發酵產量正常的階段終止培養。〔2〕冷藏時間斜面冷藏對孢子質量影響與孢子成熟程度有關。如土霉素生產菌種孢子斜面培養4d左右即于4℃冰箱保存，發現冷藏7~8d菌體細胞開始自溶。而培養5d以后冷藏，20d未發現自溶。

冷藏時間對孢子生產能力也有影響。例如在鏈霉素生產中，斜面孢子在6℃冷藏兩個月后發酵單位比冷藏一個月降低18%，冷藏3個月后降低35%。4、接種量接種量大小影響到培養基中孢子的數量，進而影響菌體的生理狀況。也影響到菌種的適應期。

二、影響種子質量的因素及控制生產過程中影響種子質量的因素通常有：孢子的質量、培養基、培養條件、種齡、接種量。1、培養基種子培養基要滿足以下要求：〔1〕營養成分適合種子培養的需要〔2〕選擇有利于孢子發芽和菌體生長的培養基；〔3〕營養上要易于被菌體直接吸收和利用；〔4〕營養成分要適當豐富和完全，氮源和維生素含量要高〔5〕營養成分要盡可能與發酵培養基相近。2、培養條件〔1〕溫度〔2〕通氣量在種子罐中培養的種子除保證供給易被利用的培養基外，有足夠的通氣量可以提高種子質量。例如，青霉素的生產菌種在制備過程中將通氣充足和缺乏兩種情況下得到的種子分別接入發酵罐內，它們的發酵單位可相差1倍。但也有例外，例如土霉素生產菌，一級種子罐的通氣量小對發酵有利。3、種齡種齡：是指種子罐中培養的菌絲體開始移入下一級種子罐或發酵罐時的培養時間。通常種齡是以處于生命力極旺盛的對數生長期，菌體量還未到達最大值時的培養時間較為適宜。時間太長，菌種趨于老化，生產能力下降，菌體自溶；種齡太短，造成發酵前期生長緩慢。不同菌種或同一菌種工藝條件不同，種齡是不一樣的，一般需經過多種實驗來確定。如嗜堿性芽孢桿菌生產堿性蛋白酶，12小時最好〔見以下圖〕。4、接種量接種量：是指移入的種子液體積和接種后培養液體積的比例。接種量的大小決定于生產菌種在發酵罐中生長繁殖的速度，采用較大的接種量可以縮短發酵罐中菌絲繁殖到達頂峰的時間，使產物的形成提前到來，并可減少雜菌的生長時機。但接種量過大或者過小，均會影響發酵。過大會引起溶氧缺乏，影響產物合成；而且會過多移入代謝廢物，也不經濟；過小會延長培養時間，降低發酵罐的生產率。通常接種量，細菌1~5%，酵母菌5~10%，霉菌7~15%，有時20~25%

三、種子質量的控制措施種子質量的最終指標是考察其在發酵罐中所表現出來的生產能力。因此首先必須保證生產菌種的穩定性，其次是提供種子培養的適宜環境保證無雜菌侵入，以獲得優良種子。因此在生產過程中通常進行以下兩項檢查。〔1〕菌種穩定性的檢查〔2〕無〔雜菌〕檢查四、種子質量標準1、細胞或菌體菌絲形態、菌絲濃度和培養液外觀〔色素、顆粒等〕單細胞：菌體健壯、菌形一致、均勻整齊，有的還要求有一定的排列或形態；霉菌、放線菌：菌絲粗壯、對某些染料著色力強、生長旺盛、菌絲分枝情況和內含物情況好。2、生化指標種子液的糖、氮、磷的含量和pH變化。3、產物生成量在抗生素發酵中，產物生成量是考察種子質量的重要指標，因為種子液中產物生成量的多少間接反映種子的生產能力和成熟程度。4、酶活力種子液中某種酶的活力，與目的產物的產量有一定的關聯。

五、種子異常分析菌種生長速度，過快或過慢菌絲結團菌絲粘壁感染噬菌體第四節實例一、谷氨酸發酵的菌種擴大培養斜面菌種→一級種子培養→二級種子培養→發酵罐1、斜面菌種的培養菌種的斜面培養必須有利于菌種生長而不產酸，并要求斜面菌種絕對純，不得混有任何雜菌和噬菌體，培養條件應有利于菌種繁殖，培養基以多含有機氮而不含或少含糖為原那么。(1)斜面培養基組成葡萄糖0.1%，蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化鈉0.5%，瓊脂2.0~2.5%，pH7.0~7.2〔傳代和保藏斜面不加葡萄糖〕。(2)培養條件33~34℃，培養18~24h。2、一級種子培養一級種子培養的目的在于大量繁殖活力強的菌體，培養基組成應以少含糖分，多含有機氮為主，培養條件從有利于長菌考慮。(1)培養基組成葡萄糖2.5%，尿素0.5%，硫酸鎂0.04%，磷酸氫二鉀0.1%，玉米漿2.5~3.5%(按質增減)，硫酸亞鐵、硫酸錳各2ppm，pH7.0。(2)培養條件用1000mL三角瓶裝入培養基200mI，滅菌后置于沖程7.6cm、頻率96次/min的往復式搖床上振蕩培養12h，培養溫度33~34℃。(3)一級種子質量要求種齡：12h，pH值：6.4±0.1光密度：凈增OD值0.5以上殘糖：0.5％以下無菌檢查：(-)噬菌體檢查：(-)鏡檢：菌體生長均勻、粗壯，排列整齊革蘭氏陽性反響。3、二級種子培養為了獲得發酵所需要的足夠數量的菌體，在一級種子培養的根底上進而擴大到種子罐的二級種子培養。種子罐容積大小取決于發酵罐大小和種量比例。(1)培養基組成培養基組成（%）T6-13B9T738AS1.299水解糖玉米漿磷酸氫二鉀硫酸鎂尿素Fe++（ppm）Mn++（ppm）pH2.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.150.040.4226.8-7.02.52.5-3.50.20.050.5227.02.52.50.10.040.5226.5-6.8(2)培養條件接種量：0.8~1.0％培養溫度：32~34℃培養時間：7~8h通風量：50L種子罐1:0.5攪拌轉速340r／min；250L種子罐1:0.3攪拌轉速300r／min500L種子罐1:0.25攪拌轉速230r／min(3)二級種子的質量要求種齡：7~8hpH：7.2左右OD值凈增0.5左右無菌檢查(-)噬菌體檢查(-)二、啤酒酵母的擴大培養一般可采用三級擴大培養，擴大倍數：第1級到第2級為8-10倍，第2級到第3級為4-6倍。1、實驗室擴大培養

第五節生產發酵罐的無菌接種生產規模發酵罐的接種，包括兩個方面：從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個種子罐；從一個種子罐移入另一個生產發酵罐中。〔1〕從實驗室搖瓶或孢子懸浮液容器接種通常有兩種方式第四節菌種的保藏與復壯一、菌種的保藏1、菌種保藏的意義菌種是從事微生物學以及生命科學研究的根本材料，特別是利用微生物進行有關生產如抗生素、氨基酸、釀造等工業，更離不開菌種。所以菌種保藏是進行微生物學研究和微生物育種工作的重要組成局部。其任務首先是使菌種不致死亡，同時還要盡可能設法把菌種的優良特性保持下來而不致向壞的方面轉化。常用的要求：低溫、隔氧、枯燥2、菌種保藏的目的菌種保藏主要是根據菌種的生理生化特點人工創造條件使孢子或菌體的生長代謝活動盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養基營養成分在最低水平缺氧狀態，枯燥和低溫，使菌種處于“休眠〞狀態，抑制其繁殖能力。一種好的保藏方法首先應能長期保持菌種原有的優良性狀不變，同時還需考慮到方法本身的簡便和經濟，以便生產上能推廣使用。3、菌種保藏的方法〔1〕斜面低溫保藏法將菌株接種于適宜斜面培養基上，待生長好后置于4冰箱保藏，每隔一定時間進行移接培養后再將新斜面繼續保藏。這種保藏方法簡單，存活率高，易于推廣，經常使用的菌種可采用這種方法。其缺點是菌種仍有一定強度的代謝活動條件，保存時間不長，而且傳代多，因此菌種客易產生變異。〔2〕石蠟油封保藏法將生長好的新鮮斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上端1cm，使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內保藏即可。這種方法也比較簡便，且保藏時間一般可長達l年以上。適于保存局部霉菌、酵母菌、放線菌，但對細菌效果較差，對某些能同化烴類的微生物那么不適用。〔3〕砂土管保藏法將孢子懸浮液轉移至滅過菌的砂土管中，于真空枯燥器內用真空泵抽干，再轉至有枯燥劑的容器中，密封低溫保藏。本方法是用人工方法模擬自然環境使菌種得以棲息。適用于細菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對枯燥敏感的無芽孢的細菌和酵母菌。主要包括砂土制備和真空抽干兩步。〔4〕冷凍枯燥法此法的原理是在低溫下迅速將細胞凍結以保持細胞結構的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動處于極低水平，不易發生變異和死亡，因而能長期保存，一般為5~10年。微生物在此條件下易死亡，所以需參加一些物質作保護劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。該法存活率高，變異率低，并能廣泛適用于細菌〔有芽孢和無芽孢的〕、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。其缺點是手續麻煩，操作復雜，要求嚴格，并需有一定設備條件。〔5〕超低溫保藏法由于現在超低溫冰箱的使用已較普及，所以菌種的超低溫保藏法在生產企業和研究機構已得到廣泛應用。該方法的要點是：將要保藏的菌種置于10%甘油或二甲基亞砜保護劑中，密封于試管或安瓿管中，然后將其放入超低溫冰箱中于-70℃下保藏。該法簡便易行，而且保藏效果較好。二、發酵工業微生物菌種的衰退與復壯微生物具有生命活動能力，其世代時間一般是很短的，在傳代過程中易發生變異甚至死亡，因此常常造成工業生產菌種的退化，并有可能使優良菌種喪失，所以，如何保持菌種優良性狀的穩定是研究菌種保藏的重要課題。〔一〕微生物菌種的衰退菌種退化是指在較長時期傳代保藏后，菌株的一個或多個生理性狀和形態特征逐漸減退或消失的現象。常見的菌種衰退在形態上表現為分生孢子的減少或菌落顏色的改變。在生理上常指菌種發酵能力的降低，有些菌的抗噬菌體能力下降。對誘變育種而獲得的高產變異株那么常表現出恢復野生型性狀等。菌種的真正退化必須與由于環境原因變化而引起菌種形態、和生理上的變異區別開來。如培養基中微量元素缺乏會導致孢子數量減少，也會引起孢子顏色的改變。此外，溫度、pH、不同碳氮源都會導致菌種變化。但只要一旦恢復正常條件，這些現象就會消失。雜菌污染也會造成菌種退化的假象。因此，必須正確判斷是否退化，才能找出正確的解決方法。一般菌種退化是從量變到質變逐漸發生的，同時也是整個群體中產量降低及其相聯系的種種特性的變化，而不是指單個細胞的改變。引起菌種退化的原因主要有：1、基因突變菌種退化的主要原因是有關基因的負突變。如果控制產量的基因發生負突變那么會引起產量下降，如果控制孢子生成的基因發生負突變那么孢子性能就會下降。當然，這些負突變都是自發形成的。經常處于旺盛生長狀態的細胞比休眠狀態細胞發生突變的機率大得多。在發酵生產中常用營養缺陷型突變株，如缺陷型發生回復突變就會使產量水平下降。如粘質賽氏桿菌(Serratiamarcescens)H-2892菌株生產力為18g/L組氨酸，經5次傳代后因回復突變型增多，產量下降至4g/L。很多抗生素生物合成、產生氣生菌絲和色素等性狀都局部或全部受質粒基因控制。當菌株連續傳代、菌體發生質粒脫落而出現大量光禿型菌落，那么生產能力也顯著下降。2、變異菌株性狀別離變異菌株性狀別離也會引起高產性狀的喪失。在菌種篩選工作中初篩搖瓶產量很高，復篩產量逐漸下降而被淘汰的現象，在霉菌中更為常見。當誘變的單菌落是由一個以上孢子或細胞形成，而其中只有一個孢子或細胞是高產時，在移接傳代過程中，這個高產菌株數量減少，當然產量也就下降。菌落是由一個孢子或單個細胞形成，只要它是多核細胞，在誘發突變中核的變化不會都一樣，隨著菌種傳代和核的別離也會使性狀表現多樣化，產量也會隨之變化。

單核孢子發生突變時，如果雙鏈DNA上僅一條鏈上某個位點發生變化，經移殖后也會出現性狀別離。因此一個較穩定的變異株的獲得必須經過屢次別離純化。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細胞DNA雙鏈中一條鏈的某一點發生突變，另一條鏈完全失活不再復制來提高純菌產生率。3、連續傳