沉默NET-1基因對肝癌細胞生物學行為的影響

陳莉，王桂蘭，秦婧，吳園園，朱建偉南通大學附屬腫瘤醫(yī)院病理科南通大學醫(yī)學院病理學教研室

肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinomaHCC）是全球性的健康問題之一。我們南通啟東是WHO確定的HCC高發(fā)研究現場。研究基于我們的首次發(fā)現NET-1在HCC組織中特定表達，并發(fā)現該基因參與HCC細胞的分裂增殖和癌發(fā)生、發(fā)展密切相關的細胞運動過程,探討針對NET-1的siRNA抑制肝癌癌細胞株(SMMC-7721)中NET-1基因的表達，及該基因對癌細胞增殖、遷移、內吞的影響。一、項目研究背景NET-1與NET-2到NET-7一起統稱為NET-X，它們是由Serru等于2000年在EST數據庫中發(fā)現的7個新的含4次跨膜蛋白超家族(transmembrane4superfamily或tetraspanfamily,簡稱TM4SF)的成員。

NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1)

定位于染色體1p34.1上，其mRNA全長為1297bp(基因庫登記號碼AF065388)，為TM4SF的成員之一，最近證實其為腫瘤相關基因。1、NET-1siRNA表達質粒和myc-NET-1重組表達質粒的構建。2、細胞培養(yǎng)與轉染。3、細胞內總RNA抽提及RT-QPCR檢測NET-1mRNA。4、Westernblot檢測NET-1蛋白表達。5、CCK-8法檢測細胞增殖活性。6、流式細胞儀(FCN)檢測各組細胞處于不同細胞周期中的比例與增殖指數。7、細胞劃痕試驗檢測細胞二圍空間的遷移能力。8、Transwell小室檢測細胞三圍空間的遷移能力。9、Capture-ELISA方法測量細胞內生物素標記的轉鐵蛋白水平。10、anti-uPAR標記的癌細胞偽足形成實驗。一、材料與方法

系統組織成人組織胎兒組織惡性組織第一組第二組第三組消化系統胃+NA*+

食道+NANA

小腸+NANA

結腸+NANA

直腸+NA+

胰腺－NA+

肝－－+泌尿生殖系統腎+++睪丸+++宮頸+NA(halan細胞l)+

宮體+NA+

前列腺+NANA

乳腺+NANA內分泌系統垂體+NANA

甲狀腺+NANA

腎上腺+NANA淋巴造血系統造血細胞－NA－**

淋巴結+NANA

骨髓－NANA

脾臟+NANA

胸腺+NANA神經系統腦++NA

脊髓+NANA

視網膜+NANA其他心－+黑色素瘤+肺++NA

肌肉++NA

皮膚++NA

胎盤+NANA

*NA:現在未做檢測；**白血病，淋巴瘤1.檢測人體組織中NET-1mRNA表達鎖定研究目標——HCC二、結果M1234567891011LanesM:200ngof1kbsizeladder(NewEnglandBioLabs);Lanes1-3:NormalFetalLiverTissues;Lanes4-7:NormalAdultLiverTissues;Lanes8-11:LiverCancerTissues

轉染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721細胞中NET-1mRNA的表達（RT-QPCR）以未處理組為1。NET-1-siRNA組和myc-NET-1組分別與未處理組相比(●P<0.05，●●p<0.01)；NET-1-siRNA組與pU6H1-GFP組相比(▲P<0.05，▲p<0.01)；myc-NET-1組與pcDNA3.1/myc組相比(★P<0.05，★★p<0.01)

2、RT-QPCR檢測轉染NET-1siRNA和myc-NET-1細胞中NET-1mRNA的結果

（2）NET-1-siRNA處理組細胞存在G0/G1和G2/M期阻滯，G0/G1和G2/M期細胞比例分別增加了17.04%和10.97%，S期細胞比例降低。NET-1穩(wěn)定表達組細胞更快地進入細胞周期進程，G0/G1期細胞比例明顯降低。GFPsiRNA組NET-1siRNA組對照組NET-1過表達組5.干擾NET-1可以抑制HCC細胞遷移在NET-1siRNA組中顯著減少(p<0.05)，在myc-NET-1組中明顯增加(p<0.05)。Mock組與未處理組間差異未見顯著統計學意義（均p>0.05）NET-1siRNA處理細胞后遷移能力明顯下降。轉染48h后穿過Matrigel膠細胞數NET-1siRNA組（21.42±5.74）和pU6H1-GFP（45.60±8.25）差異有顯著統計學意義（P<0.05）；myc-NET-1組（64.80±6.14）和pcDNA3.1/myc（38.20±7.22）差異有顯著統計學意義（P<0.05）。

6.干擾NET-1可以抑制HCC細胞內吞

轉鐵蛋白(Tfn)內吞實驗顯示，NET-1siRNA組癌細胞的內吞能力明顯下降。其他組間的內吞作用變化不明顯。未處理anti-NET-1兔IgGNET-1siRNAGFP-siRNA7.干擾NET-1可以抑制HCC細胞侵襲偽足形成NET-1siRNA處理細胞偽足形成細胞百分比明顯減少(p<0.01)

NET-1siRNA處理細胞中以anti-uPAR標記的癌細胞偽足明顯減少。

8.干擾NET-1可以抑制裸鼠HCC的生長myc-NET-1NET-1siRNA9.NET-1表達與HCC臨床病理因素和預后的研究(1)NET-1表達與HCC臨床病理因素密切相關。NET-1基因蛋白表達與HCC臨床病理因素的關系(76例)（2）Kaplan-Meier生存曲線

（3）Cox比例風險模型多因素生存分析HCC轉移、組織學分級，癌中NET-1、JAB1、p-p27T187、p-p27S10、PCNA表達均具有獨立的預后意義。風險分析提示這些因素增強時均能增加HCC病人的死亡風險(其風險比均＞1)三、討論

本文通過構建NET-1siRNA和myc-NET-1表達質粒，并轉染肝癌細胞SMMC-7721。研究發(fā)現NET-1基因參與肝癌細胞的增殖分裂活動，干擾肝癌細胞NET-1基因的表達，可以抑制癌細胞的增殖，使細胞生長受限，可以抑制細胞在二圍、三圍空間的遷移能力、癌細胞內吞能力和侵襲性偽足形成能力。相反，增加NET-1基因的表達，癌細胞表現為顯著增生，更快地進入細胞周期，遷移能力提高。研究結果揭示了肝癌細胞中NET-1基因的功能