細菌鑒定技術南華大學預防醫學與放射衛生實驗教學中心教學對象：高等醫學院校衛生檢驗專業學生實驗課時：4學時課程類型：專業實驗課課程要求：必修每組人數：2人實驗目的和要求掌握鑒別細菌常用生化反響的原理和結果斷定。熟習鑒別細菌常用生化反響的培育基、方法和意義。熟習數字編碼鑒定技術的原理和結果判別。了解細菌數字編碼技術操作和臨床意義。實驗內容生化反響培育基的制備。常用細菌生化反響。數字編碼鑒定。一、生化反響培育基的制備不同生化反響需選擇不同生化反響培育基。按相應培育基配方及配制要求，制備所需生化反響培育基。制備方法同培育基制備技術二、常用細菌生化反響糖發酵實驗吲哚實驗〔靛基質實驗〕甲基紅實驗V-P〔Voges-Proskauer〕實驗枸櫞酸鹽〔或檸檬酸鹽〕利用實驗克氏雙糖鐵〔KIA〕復合實驗動力、吲哚及脲酶〔MIU〕復合實驗1.糖發酵實驗【原理】：各種細菌含有不同的分解糖〔苷、醇〕的酶，對糖〔苷、醇〕分解才干也各不一樣，有的不分解，有的分解后僅產酸，有的分解后產酸產氣，故可用來鑒別細菌。【方法】：將大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種葡萄糖、乳糖發酵管，35oC培育18-24h察看結果。1.糖發酵實驗【結果】：首先確定細菌能否生長，細菌生長者培育基呈混濁狀：1〕不分解糖，培育基顔色與接種前無變化，以“-〞表示；2〕分解糖產酸不產氣，培育基由紫色變為黃色，以“+〞表示；3〕分解糖產酸產氣，除培育基顔色變化外，倒管中還有氣泡，以“⊕〞表示。2.吲哚實驗〔靛基質實驗〕【原理】：有些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸產生吲哚，與吲哚試劑構成紅色化合物。【方法】：大腸埃希菌和傷寒沙門菌分別接種于蛋白胨水培育基中，35oC18-24h后，參與吲哚試劑數滴，靜置分層，察看結果。【結果】：在培育物液面上層呈玫瑰紅色為陽性，不變色者為陰性。3.甲基紅實驗【原理】：某些細菌分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸可進一步分解為甲酸、乙酸等酸性物質，故培育基pH在4.5以下，參與甲基紅指示劑后呈紅色〔陽性〕；有些細菌分解葡萄糖產生的酸進一步化為醇、酮等非酸性物質，使培育基pH在6.2以上，參與甲基紅指示劑后呈黃色〔陰性〕。【方法】：大腸埃希菌和產氣腸桿菌分別接種葡萄糖蛋白胨水培育基中，35oC18-24h，參與甲基紅指示劑2-3滴察看結果。【結果】：紅色為陽性，黃色為陰性。－+4.V-P〔Voges-Proskauer〕實驗【原理】：某些細菌分解葡萄糖生成丙酮酸，進一步脫羧生成乙酰甲基甲醇，在堿性環境下被氧化成二乙酰，后者與蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成紅色胍縮二乙酰，為VP實驗陽性。假設培育基中胍基含量少，參與少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反響。【方法】：大腸埃希菌和產氣腸桿菌分別接種于葡萄糖蛋白胨水中，35oC，24-48h，參與VP試劑甲液和乙液各1滴，充分搖動，察看。【結果】：紅色為陽性，假設為陰性應再培育4h察看，仍無紅色者為陰性。－+5.枸櫞酸鹽〔或檸檬酸鹽〕利用實驗【原理】：當細菌可以利用銨鹽作為獨一氮源，同時檸檬酸鹽為獨一碳源時，可在檸檬酸鹽培育基上生長，分解檸檬酸鹽為碳酸鹽，使培育基變堿，指示劑溴麝香草酚藍由綠色變為深藍色為陽性，培育基不變色〔綠色〕為陰性。【方法】：大腸埃希菌和產氣腸桿菌分別接種于檸檬酸鹽培育基中，35oC，24-48h，察看。【結果】：菌苔出現，培育基變為深藍色為陽性。細菌不能生長，培育基不變色〔綠色〕為陰性。6.克氏雙糖鐵〔KIA〕復合實驗【原理】：該培育基用酚紅指示劑，在酸性時呈黃色，堿性時呈紅色。細菌如能發酵乳糖和葡萄糖而產酸產氣，那么斜面與底層均呈黃色，且有氣泡。如只發酵葡萄糖不發酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接觸空氣而氧化揮發，從而使斜面部分堅持原來的紅色；底層由于是在相對缺氧形狀下，細菌發酵葡萄糖所生成的酸類物質不被氧化揮發而堅持黃色。如細菌分解蛋白產生硫化氫，那么與硫化亞鐵作用生成黑色的硫化鐵，使培育基變黑。6.克氏雙糖鐵〔KIA〕復合實驗【方法】：將待檢菌接種于克氏雙糖鐵培育基〔底層穿刺，上層斜面劃線〕，35oC，24h，察看。【結果】：發酵乳糖和葡萄糖產酸產氣，那么上層和底層均呈黃色且有氣泡產生；只發酵葡萄糖而不發酵乳糖，那么底層變黃，上層仍為紅色。如底層變黑，闡明該菌產生硫化氫，生成黑色的硫化鐵沉淀。雙糖鐵培育基規范管痢疾桿菌KA－－傷寒桿菌KA－＋大腸桿菌AA＋－7.動力、吲哚及脲酶〔MIU〕復合實驗【原理】：培育基為含尿素、蛋白胨的半固體培育基，指示劑為酚紅。具色氨酸酶的細菌能分解色氨酸產生吲哚，參與吲哚試劑后，培育基上層的吲哚會變紅；具脲酶的細菌能分解尿素產氨，使整個培育基變堿呈紅色；有動力的細菌沿穿刺線分散生長。【方法】：將大腸埃希菌和普通變形桿菌穿刺線接種于MIU培育基，35oC，18-24h，察看動力和脲酶反響后，再滴加吲哚試劑。【結果】：分散生長為動力陽性；滴加吲哚試劑后呈玫瑰紅色為陽性；培育基變紅脲酶陽性。大腸埃希菌MIU〔＋＋－〕三、數字編碼鑒定【原理】：數字編碼鑒定技術，是計算并比較數據庫內每個細菌條目對系統中每個生化反響出現頻率總和。計算單項發生頻率和多項發頻率，得出鑒定百分率〔%id〕，按鑒定百分率排序、查碼。三、數字編碼鑒定【詳細內容】：是將鑒別細菌的各種生化反響微量化與綜合系列化，將各種生化反響培育基分裝在微量板或微量