第五章動物性食品中致病微生物和寄生蟲的檢驗檢疫根據國家食源性疾病監測網局部資料的分析結果顯示，我國食源性疾病的高危食品依次為肉類、糧食、海產品、水果蔬菜、雞蛋、豆類、奶。由動物或植物性食物污染所引起的疫病比例接近〔約各占30%〕，而其中因微生物污染引起的食源性疾病比例接近40%，遠高于化學性食物中毒〔20%〕。綜觀國內外食源性疾病的發病情況，動物性食品中微生物污染是人類食源性疾病的主要問題。動物性食品中微生物污染的可能途徑主要有：食品原料本身的污染；動物養殖環境中的微生物對食品原料的污染；屠宰過程中的污染；深加工動物食品可能受到加工車間、加工設備外表殘存微生物污染；食品從加工出廠、貯存、運輸、銷售過程中可以受到相應環境中微生物的污染；在家庭、賓館等廚房中生熟食品的交叉污染。第一節動物性食品中菌落總數與大腸菌群的檢驗食品微生物檢測所涉及的類群微生物非細胞生物細胞生物病毒原核生物真核生物細菌酵母菌、霉菌微生物檢測程序樣品的采集注意：1所用接觸樣品的用具經過滅菌2取樣要均勻、特殊樣品要控制溫度3樣品采好后要貼上標簽〔注明：樣品名稱、來源、數量、采樣人、地點及時間〕樣品的微生物檢驗注意：1采好的樣品送檢不要超過3小時2檢完的樣品的存放時間3報告的填寫

微生物對食品的污染問題是我國乃至全世界食品平安中最突出的問題，我國為此數次公布食品微生物檢驗標準。按照食品平安國家標準要求，菌落總數和大腸菌群是食品企業出廠時必檢的微生物指標。菌落總數是指一定培養條件下〔如需氧狀況、培養基成分、PH、培養溫度和時間等〕每克〔每毫升〕食品樣品中所生長出來的細菌菌落總數。檢測菌落總數，可以判定食品被細菌污染程度，反映出食品的新鮮程度和衛生狀況。如果某食品的菌落總數嚴重超標，說明其產品的衛生狀況達不到根本的衛生要求，食品將加速腐敗變質，失去食用價值。菌落總數的檢驗程序25g(ml)樣品+225ml生理鹽水(1:10的稀釋液)作幾個適當倍數的稀釋液(例如1:100，1:1000)選擇2~3個適宜稀釋度各取1ml分別加入滅菌培養皿中每個平皿中加適量（15~20ml）營養瓊脂菌落記數本卷須知：1操作要在無菌的狀態下進行。2操作時間越短越好。3樣品不同選擇的稀釋倍數不同。4培養基冷卻溫度不宜過高或過低。大腸菌群系指一群能發酵乳糖、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，包括腸桿菌科的大腸埃希氏菌屬、檸檬桿菌屬、腸桿菌屬和克雷伯菌屬細菌。檢測大腸菌群，可以判定食品被與糞便污染有關的細菌污染的程度。如果某食品的大腸菌群超標，那么可以推測其產品中存在著腸道致病菌污染的可能性，食用之可能導致食物中毒或罹患流行病。第二節動物性食品中致病性細菌的檢驗沙門氏菌致病性大腸桿菌副溶血弧菌金黃色葡萄球菌溶血性鏈球菌產單核細胞李斯特菌肉毒梭菌結核分枝桿菌空腸彎曲桿菌炭疽桿菌產氣莢膜梭菌蠟樣芽孢桿菌變形桿菌食品中沙門氏菌檢驗一、實驗目的1、掌握食品中沙門氏菌的檢驗原理。2、掌握食品中沙門氏菌的檢驗方法。二、實驗原理

〔一〕沙門氏菌屬簡介沙門氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學相關的革蘭氏陰性、需氧性、無芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結構復雜，現已發現2000多個血清型，我國已發現血清型近200個。沙門氏菌屬——生物學特性形態特征：革蘭氏陰性，大小為1-3×0.4-0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無芽孢，一般無莢膜，除雞沙門氏菌和雛沙門氏菌以外，都有周身鞭毛，運動力強。培養特性：沙門氏菌需氧或兼性厭氧，10～42℃都可生長，最適生長溫度為37℃，最適pH為6.8～7.8。營養瓊脂平板上：35～37℃培養18-24h，其菌落大小一般為2～3mm，光滑、濕潤、無色、半透明、邊緣整齊。血平板上：中等大小的灰白色菌落。沙門氏菌屬的抗原菌體抗原〔O抗原〕外表抗原〔K抗原〕：Vi抗原和M抗原鞭毛抗原〔H抗原〕纖毛抗原

沙門氏菌屬——致病性沙門氏菌胃腸炎是由除傷寒沙門氏菌外任何一型沙門氏菌而所致，潛伏期一般6-72小時，主要病癥為惡心、嘔吐、腹絞痛、腹瀉、發熱寒顫頭痛。病程一般1～2天或更長。感染劑量為15～20個菌，死亡率達1～4%。最易感群體是年幼兒童、虛弱者、年長老人、免疫缺陷者等。污染源主要是人和家畜的糞便，沙門氏菌常存在于動物中，特別是禽類和豬。在許多環境中也有存在。從水，土壤，昆蟲中，從工廠和廚房設施的外表和動物糞便中已發現該類細菌。它們可以存在于多類食品中，包括生肉，禽，奶制品和蛋，魚，蝦和田雞腿，酵母，椰子，醬油和沙拉調料，蛋糕粉，奶油夾心甜點，頂端配料，干明膠，花生露，橙汁，可可和巧克力。〔二〕檢驗三、實驗儀器和材料1冰箱：0℃～4℃。2恒溫培養箱：36℃±1℃，42℃。3顯微鏡：10×～100×。4高壓滅菌器。5超凈工作臺。6均質器或滅菌乳缽。7架盤藥物天平：0g～500g,精確度0.5g。8滅菌廣口瓶：500mL。9滅菌錐形瓶：500mL、250mL。10滅菌吸管：10mL〔具0.1mL刻度〕。11天菌培養皿：90mm。12滅菌小試管：內徑3mm×50mm。13滅菌毛細管。四、培養基和試劑1緩沖蛋白胨水(BP)2氯化鎂孔雀綠(MM)增菌液3四硫酸鈉煌綠(TTB)增菌液4亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液5亞硫酸鉍瓊脂(BS)6

DHL瓊脂7

HE瓊脂：按GB/T4789.28—2003中4.21規定。8

TSI瓊脂9蛋白胨水、靛基質試劑10尿素瓊脂(pH7.2)11氨基酸脫羧酶試驗培養基12沙門氏菌因子血清：按26種用于初步分型；57種用于進一步分型；163種用于詳細分型。五、檢驗樣品1鮮豬肉、鮮牛肉；凍豬肉2鮮牛奶、鮮魚；凍魚3香腸、蝦仁六、沙門氏菌檢驗流程檢樣前增菌法直接增菌法凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳及其它未經加工的食品25g＋BP225mL25g＋滅菌生理鹽水25mL制成檢樣均質液〔36±1〕℃一般4h，干蛋品18～24h10mL＋MM(或TTB)100mL10mL＋SC100mL檢樣均質液的半量＋MM(或TTB)100mL檢樣均質液的半量＋SC100mL42℃18～24h〔36±1〕℃18～24h42℃18～24h〔36±1〕℃18～24hBSDHL(或HE、WS、SS)〔36±1〕℃40～48h〔36±1〕℃18～24h挑取可疑菌落TSI〔斜面、底層、產氣、H2S〕、蛋白胨水〔靛基質〕、尿素〔pH7.2〕、KCN、賴氨酸H2S＋靛基質－H2S＋靛基質＋H2S－靛基質－非如左述的尿素－KCN－賴氨酸＋尿素－KCN－賴氨酸＋尿素－KCN－賴氨酸＋/－各種反響結果

甘露醇、山梨醇ONPG沙門氏菌血清學實驗沙門氏菌血清學實驗非沙門氏菌非沙門氏菌報告

七、操作步驟1、前增菌和增菌凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應經過前增菌。以無菌操作取25g〔mL〕，加在裝有225mL緩沖蛋白胨水的500mL廣口瓶內。固體食品可先應用均質器以8000～10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用滅菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃±1℃培養4h(干蛋品培養18h～24h)，移取10mL，轉種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫酸鈉煌綠增菌液內，于42℃培養18h～24h。同時，另取10mL，轉種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內，于36℃±1℃培養18h～24h。

鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其他未經加工的食品不必經過前增菌。各取25g(25mL)參加滅菌生理鹽水25mL，按前法做成檢樣勻液；取25mL，接種于100mL氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內，于42℃培養24h；另取25mL接種于100mL亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內，于36℃±1℃培養18h～24h。2、別離取增菌液1環，劃線接種于一個亞硫酸鉍瓊脂平板和一個DHL瓊脂平板(或HE瓊脂平板、WS或SS瓊脂平板)。兩種增菌液可同時劃線接種在同一個平板上。于36℃±1℃分別培養18h～24h(DHL、HE、WS、SS)或40h～48h(BS)，觀察各個平板上生長的菌落。沙門氏菌屬各群在各種選擇性瓊脂平板上的菌落特征

選擇性瓊脂平板沙門氏菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ沙門氏菌Ⅲ（即亞利桑那菌）

BS瓊脂產硫化氫菌落為黑色帶有金屬光澤，棕褐色或灰色，菌落周圍培養基可呈黑色或棕色；有些菌株不產生硫化氫，形成灰綠色的菌落，周圍培養基不變黑色帶有金屬光澤

DHL瓊脂無色半透明，產硫化氫菌落中心帶黑色或幾乎全黑色乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心帶黑色

HE瓊脂

WS瓊脂藍綠色或藍色；多數菌株產硫化氫，菌落中心黑色或幾乎全黑色乳糖陽性的菌株為黃色，中心黑色或幾乎全黑色；乳糖遲緩陽性或陰性的菌株為藍綠色或藍色，中心黑色或幾乎全黑色

SS瓊脂無色半透明，產硫化氫菌株，有的菌落中心帶黑色，但不如以上培養基明顯乳糖遲緩陽性或陰性的菌株與亞屬Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ相同；乳糖陽性的菌株為粉紅色，中心黑色，但中心無黑色形成時與大腸埃希氏菌不能區別3、生化試驗自選擇性瓊脂平板上直接挑取數個可疑菌落，分別接種三糖鐵瓊脂、蛋白陳水(供做靛基質試驗)、尿素瓊脂(pH7.2)、氰化鉀(KCN)培養基和賴氨酸脫竣酶試驗培養基及對照培養基各1管，于36℃±1℃培養18h～24h，必要時可延長至48h，按生化反響初步鑒定表判定結果。按反響序號分類，沙門氏菌屬的結果應屬于A1、A2和B1，其他5種反響結果均可以排除。腸桿菌科各屬在三糖鐵瓊脂內的反響結果斜面底層產氣硫化氫可能的菌屬和種－＋＋/－＋沙門氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌、變形桿菌屬、緩慢愛德華氏菌＋＋＋/－＋沙門氏菌Ⅲ、弗勞地氏檸檬酸桿菌、普通變形桿菌－＋＋－沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬－＋－－傷寒沙門氏菌，雞沙門氏菌、志賀氏菌屬、大腸埃希氏菌、蜂窩哈夫尼亞菌、摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬＋＋＋/－－大腸埃希氏菌、腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、沙雷氏菌屬、弗勞地氏檸檬酸桿菌注：＋陽性；－陰性；＋/－多數陽性，少數陰性腸桿菌科各屬生化反響初步鑒別表反應序號硫化氫（H2S）靛基質pH7.2尿素氰化鉀（KCN）賴氨酸脫羧酶判定結果A1＋－－－＋沙門氏菌屬A2＋＋－－＋沙門氏菌屬（少見）緩慢愛德華氏菌A3＋－＋＋－弗勞地氏檸檬酸桿菌、奇異變形桿菌A4＋＋＋＋－普通變形桿菌B1－－－－－－－－＋－沙門氏菌屬、大腸埃希氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B2－－＋＋－－－＋－大腸埃希氏菌大腸埃希氏菌、志賀氏菌屬B3－－－－＋/－＋＋＋＋－克雷伯氏菌族各屬陰溝腸桿菌、弗勞地氏檸檬酸桿菌B4－＋＋/－＋－摩根氏菌，普羅菲登斯菌屬注1：三糖鐵瓊脂底層均產酸，不產氣者可排除；斜面產酸與產氣與否均不限。注2：KCN和賴氨酸可選作其中一項，但不能判定結果時，仍需補做另一項。注3：＋表示陽性；－表示陰性；＋/－表示多數陽性，少數陰性。沙門氏菌檢驗——幾點注意冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動調溫器自控的水浴鍋內不斷攪拌進行15min或在2-8℃，18小時內軟化。為保證檢驗的準確性，必須在選擇性培養基上挑取足夠數量的菌落進行生化和血清學鑒定。進行生化反響時，應以純培養物進行試驗，如出現血清學陽性，而生化反響特征不符合時，應對接種物進行純化，用純化后的培養物重新進行生化試驗。測試中應同時接種陽性對照菌株。金黃色葡萄球菌細菌學及其檢驗

1

生物學性狀

自然分布：金黃色葡萄球菌分布廣泛，存在于環境、空氣、水、牛奶、食品、污水及人和動物等。與人關系密切，構成人體皮膚、鼻腔、咽部等處的正常細菌群，對人有致病性，是臨床醫學中常見的化膿性球菌之一，也是污染食品造成食物中毒的細菌之一。形態與染色：典型金黃色葡萄球菌呈球形，直徑0.5—1.0微米，較非致病性葡萄球菌略小，各個菌體的大小及排列較整齊。細菌繁殖時呈多個平面的不規那么分裂，堆積成葡萄串狀排列。在膿汁或液體培養基中生長，常呈雙球或短鏈排列，易誤為鏈球菌。金黃色葡萄球菌無鞭毛，故不能自由移動，一般不形成莢膜，不產生芽孢。革蘭氏染色為陽性，衰老、死亡或被白細胞吞噬的菌體，常轉呈革蘭氏陰性，故須注意。培養特性：本菌為需氧或兼性厭氧，對營養要求不高，在普通培養基上生長良好，最適宜生長溫度為37℃，最適宜pH為7.4，耐鹽性強，在含10-15%氯化鈉培養基中能生長，利用這一特性，可有利于金葡菌的檢出。在普通瓊脂培養基上形成圓形、凸起、外表光滑、濕潤、邊緣整齊、不透明的菌落。直徑一般為1-2mm，密集生長的菌落較小，稀散或生長較久著，直徑可達4-5mm。在普通肉湯培養基中生長迅速，一般呈均勻混濁生長，如培養基中的糖類被分解后，產生較多的酸性物質即可發生酸性沉淀。培養時間較長，2-3日后常有菌膜形成而出現粘性沉淀。在血瓊脂平板上形成較大菌落，有色素產生，由于本菌產生的色素為脂溶性不溶于水，故色素只局限于菌落內，不透入培養基中。該菌產生溶血毒素，使菌落周圍紅細胞溶解而形成透明的溶血環，非致病性葡萄球菌無此現象。

在Baird—parker瓊脂平板上，菌落呈圓形凸起，外表光滑濕潤，直徑2—3mm，灰黑色至黑色，有光澤，常有淺色的邊緣，周圍繞以不透明圈，其外常有一清晰帶，菌落有黃油樣粘稠感。從長期貯存的冷凍或脫水食品中別離的菌落，其黑色常較典型菌落淺些，且外觀可能較粗糙，質地較枯燥。抵抗力：葡萄球菌抵抗力較強，在枯燥的膿汁中能存活數月，有些菌株需加熱80℃30—60分鐘才被殺死。在5%石炭酸中15分鐘死亡。

2致病性

金黃色葡萄球菌為潛在性的病原菌，它所產生的多種胞外蛋白質對人和動物組織有害，其中一類是各種酶類，如脂酶、蛋白酶、青霉素酶、凝固酶和耐熱DNA酶等，另一類為毒素，它們是溶血素〔α、β、γ、δ〕、溶白細胞素、腸毒素〔A、B、C、D、E、TSS〕及化膿性毒素等。

2致病性

雖然人體對金葡菌感染具有一定的抵抗力，但當機體抵抗力下降或皮膚粘膜受損時易被感染，可引起局部或全身炎癥，侵入血流可引起敗血癥及膿毒血癥。金葡菌污染食品之后可能產生大量的腸毒素，腸毒素是該菌引起食物中毒的主要因素之一。金葡菌腸毒素具有極強的穩定性，能抵抗許多蛋白酶的消化，只有在小于pH2的條件下蛋白酶才能使其失去活性。這一點可以解釋，為什么攝入腸毒素在胃中有蛋白酶時，仍然引起食物中毒，因為胃液的酸度大于pH2，所以不能消化腸毒素。腸毒素還相當耐熱，經煮沸30分鐘后仍不能完全破壞其毒性。當含腸毒素為20μɡ/ml的牛肉湯〔pH6.2〕，在121℃加熱需要37分鐘以上，才能滅活毒素。

金葡菌腸毒素的產生因菌株不同而有所差異，有資料顯示，食品中存在的金葡菌幾乎都產生腸毒素，以SEA型為最多。以往認為凝固酶陽性的金葡菌能產生腸毒素，但不是都產生腸毒素。后有實驗證實，有些產生腸毒素的金葡菌株產生耐熱DNA酶卻不產生凝固酶，即一些凝固酶陰性菌株也產生腸毒素，要鑒定是否是產毒株，需同時進行凝固酶和耐熱DNA酶測定試驗。而耐熱DNA酶和腸毒素的耐熱力相近似，由此可見耐熱DNA酶的產生與腸毒素的關系較凝固酶更為平行。所以常用耐熱DNA酶試驗代替腸毒素測定。自1982年起有些國家就提出進口方便食品中不得檢出含有耐熱DNA酶的金葡菌。結核分枝桿菌分枝桿菌屬Mycobacterium一類直或微彎曲的桿菌，有分枝生長趨勢，可呈絲狀或菌絲樣生長。細胞壁脂質含量高〔分枝菌酸〕，耐酸，抗酸染色陽性。對氧和營養要求高，生長慢。不產生毒素和侵襲酶類，引起慢性疾病。又稱抗酸桿菌(acid-fastbacillus)---不易著色，可抵抗鹽酸酒精的脫色作用分類屬放線菌科，本屬有80多種，可分三類：結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌和麻風分枝桿菌。細菌的DNAG+Cmol%為62－70臨床標本

抗酸染色+

L-J別離培養

+>7天+<7天緩生菌速生菌PNB+--T2H++-非典型分枝桿菌人型結核分枝桿菌牛型分枝桿菌光反響性試驗光產色菌暗產色菌不產色菌

分枝桿菌的鑒定程序結核分枝桿菌一、分類結核分枝桿菌〔MycobacteriumTuberculosis，TB〕復合群：人結核分枝桿菌(M.tuberculosis)牛分枝桿菌(M.bovis)非洲分枝桿菌田鼠分枝桿菌培養特性專性需氧菌，3%－5%的CO2能促進生長。最適ph6.5～6.8，最適溫度為37℃，低于30℃難生長，營養要求高，在含有蛋黃、馬鈐薯、甘油和天門冬素等的固體培養基上才能生長，且生長緩慢。固體培養基---典型菌落為枯燥、堅硬、外表呈顆粒狀、乳酪色或淡黃色，形似菜把戲。液體培養基---生長較快呈粗糙皺紋狀菌膜生長，有毒株可呈索狀生長〔吐溫干擾〕。菜把戲菌落生化反響生化不活潑。不發酵糖類，多數菌株觸酶陽性，熱觸酶陰性，非結核分枝桿菌正好相反。結核分枝桿菌煙酸和硝酸鹽試驗陽性，耐噻吩－2－羧酸肼(T2H)，牛型那么相反。有毒株中性紅試驗陽性。變異性TB菌易發生形態、菌落、最適生長溫度、毒力和耐藥性的變異。如卡介苗、Much顆粒和多重耐藥菌株出現等。抵抗力

TB菌細胞壁含大量脂類，抵抗力較強干痰中存活6-8個月，粘附塵埃上保持傳染性8-10天。

3%HCL或4%NaOH、6%H2SO4溶液中能耐受30分鐘常以酸堿中和處理嚴重污染的檢材，殺死雜菌和消化粘稠物質，提高檢出率對一定濃度的孔雀綠有抵抗力。

對濕熱、紫外線、酒精的抵抗力弱。

(如在液體中加熱60℃30分鐘，直射日光下2～3小時，75%酒精內數分鐘即死亡。)三、臨床意義TB菌引起結核病。對人類致病的有人結核分枝桿菌、牛型結核桿菌和非洲分枝桿菌，人型結核桿菌感染引起的發病率最高。成為全球性重大公共衛生問題。所致疾病TB菌的致病作用可能是細菌在細胞內增殖引起炎癥反響，以及誘導機體產生免疫反響性損傷有關。通過呼吸道、消化道和破損的皮膚粘膜進入機體，侵犯多種組織器官，引起相應器官，其中以肺結核最常見。可分原發感染和繼發感染。免疫性TB菌的感染率很高，發病率卻較低，這說明人體感染結核桿菌可獲得一定的抗結核免疫力，這種免疫稱為有菌免疫或傳染性免疫。TB菌的免疫原rRNA和變應原結核菌素誘發機體產生由T淋巴細胞介導細胞免疫反響。致病物質1.脂質－脂質占菌體干重的20～40%，占胞壁干重的60%。①磷脂：能刺激單核細胞增生，并可抑制蛋白酶的分解作用，使病灶形成干酷樣壞死。②索狀因子：是分枝菌酸與海藻糖的復合物，具有破壞細胞線粒體膜，毒害微粒體酶類，抑制中性粒細胞游走和吞噬作用，引起慢性肉牙腫。具有該物質的TB菌毒株，在液體培養基中能緊密粘成索狀。③蠟質D：是一種肽糖脂與分枝菌酸復合物，能引起遲發型變態反響，并具有佐劑作用。④硫酸腦苷脂：TB菌毒株胞壁中含有，能抑制吞噬細胞中的吞噬體與溶酶體融合，使結核桿菌在細胞內存活。2.莢膜－主要為多糖，少量脂質和蛋白質。①粘附和入侵②分解物質提供營養③防止有害物質入侵3.蛋白質－TB菌菌體內都含有數種蛋白質，其中重要的蛋白質是結核菌素。結核茵素與蠟質D結合，能引起較強的遲發型變態反響。其他蛋白質可引起機體產生相應的抗體，但無保護作用。標本采集感染部位不同，取不同的標本，宜用能抑制污染菌的方法常見標本：痰、尿、胸腹水等檢查方法1.顯微鏡檢查1〕直接涂片：用萋－尼氏法染色，假設鏡檢找到抗酸性桿菌，通常應報告：“查到抗酸性桿菌〞，需進一步別離培養鑒定。2〕濃縮集菌涂片：如標本中菌量少，雜菌和雜質多時，用離心沉淀法將菌濃縮聚集，再取沉淀物涂片作抗酸染色檢查別離培養

TB菌接種前處理－液化和處理雜菌4%NaOH、6%H2SO4、胰酶15-20min培養基選擇—羅氏培養基鑒別培養基(PNB、T2H、NAP)儀器培養—Bacte460、BacT/ALERT3D液體培養基培養時間—長一般6-8周鑒定1.染色性;2.菌落特征;3.生長速度;4.色素產生;5.生化試驗鑒別試驗：

NAP(p-nitro-α-acetylamino-β-hydroxy-propiophenome)抑制試驗結核分枝桿菌NAP-

非結核分枝桿菌NAP+

藥物敏感試驗動物接種菌株別離和檢測毒力結果分析與報告涂片鏡檢的報告方式非典型分枝桿菌指結核分枝桿菌與麻風桿菌以外的分枝桿菌已發現17種以上可引起人類疾病，在臨床上難以與結核分枝桿菌感染區別分類光產色菌：暗處不產色素，光照后產色素暗產色菌：有光或無光均產色素不產色菌：有光或無光均不產色素迅速生長菌：普通培養基上生長3-6天光產色菌

堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、猿分枝桿菌暗產色菌

瘰痢分枝桿菌、蘇爾加分枝桿菌不產色菌

鳥-胞內復合分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、蟾分枝桿菌迅速生長菌

偶發分枝桿菌、龜分枝桿菌第三節動物性食品中致病性病毒的檢驗口蹄疫病毒流行性感冒病毒禽流感病毒豬瘟病毒新城疫病毒馬立克氏病病毒朊病毒冠狀病毒口蹄疫病毒檢驗

口蹄疫病毒(Foodandmouthdiseasevirus，FMDV)是牛、豬、羊等偶蹄動物口蹄疫的病原。是全球性最重要的動物健康問題之一。1898年，德國科學家Loeffler與Frosch發現口蹄疫病畜的病料通過濾菌器后→仍能使健康動物發病。一、生物學特性口蹄疫病毒屬于：微RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，屬內只有口蹄疫病毒一種。二十面體對稱，直徑20～25nm，無囊膜，病毒基因組為單股正鏈RNA，在RNA芯髓外對稱衣殼上有32個殼粒。電鏡下，可見病毒粒子外表的顆粒狀結構和一個密度較低的中心。此外尚可見有較小的蛋白質亞單位顆粒，直徑7～8nm，無感染性。病毒子在宿主細胞漿內可形成晶格狀排列。本病毒是動物病毒中發現最早的一種。二、抵抗力對酸敏感，病毒在pH為6.5的緩沖液中、4℃條件下14h滅活90％，在pH5.5時1min滅活90％，在pH5.0時每秒鐘滅活90％，pH3.0時瞬間滅活，病毒在pH7.0～7.5時十分穩定。病毒的感染性RNA在pH4.0時較原病毒穩定。口蹄疫病毒對堿也很敏感。對消毒劑的抵抗力較強。病毒在低溫下能長期保存。病毒的滅活溫度為85℃1min，70℃10min，60℃15min，但裸露的RNA對熱較穩定。三、抗原性根據病毒的血清學特征，目前口蹄疫病毒有七個主型：A、O、C、南非Ⅰ、南非Ⅱ、南非Ⅲ和亞洲Ⅰ型(SAT1、SAT2、SAT3、Asia1)。各型之間沒有相互免疫作用。本病毒有較大的變異性，病毒在保存和流行中，常發生血清學的變異，有時流行初期與末期毒型不一致，幾乎每年都有新的亞型出現，本病毒已發現85個以上的亞型。四、培養特性1．組織培養

利用犢牛、幼豬的腎臟或豚鼠、牛胚胎上皮組織制成細胞單層來培養病毒，病毒繁殖后，使細胞發生病變。2．雞胚培養

本病毒不易在雞胚上生長，必須反復交替通過牛與雞胚或在添有牛舌上皮的雞胚組織培養繼代后，才可能適應于雞胚或雞胚組織培養。在感染了口蹄疫病毒的細胞培養液中，有大小不同的4種粒子：最大的粒子為完整病毒；第二種為不含RNA的空衣殼；第三種為衣殼蛋白亞單位；第四種是病毒感染相關抗原。五、致病性在自然條件下，主要發生于偶蹄獸，其中以奶牛和黃牛最易感，其次是水牛，牦牛、豬，再次為羊和駱駝等。野生偶蹄獸也能發生。從流行病學的觀點來看，綿羊是本病的“儲存器〞，豬是“擴大器〞，牛是“指示器〞。1.傳播途徑:呼吸道、消化道(被污染的飼料、飲水)；創傷、皮膚、粘膜2.流行特點：有一定的季節性(以冬、春季節發病較多，夏季可以平息),傳播迅速,一般沿交通線進行傳播。六、微生物學診斷

(一)豚鼠接種試驗

選擇500g以上的健康豚鼠4～6只，剪去后肢足掌部被毛，用濕棉花球洗凈，再用70％酒精棉消毒。將足掌部皮膚或口腔粘膜劃破，把感染性病料涂擦于劃破處。第二天如局部有水皰，即可確診。(二)乳鼠接種試驗

選2～7日齡乳鼠5只，4只做檢樣，1只做對照，每只頸背部皮下接種0.1ml，觀察1周，如有死鼠,及時取出，制備1:3檢樣，傳代。如無死鼠取活鼠凍死傳代，傳2-3代不死亡為陰性。接種乳鼠：呼吸急促，四肢和全身麻痹禽流感病毒禽流感：是野生鳥類和家禽感染了一種甲型流感病毒，即禽流感病毒以后引起的以體溫升高、打噴嚏、頭部水腫、呼吸困難、產蛋率明顯減少、腹瀉等病癥呼吸道傳染病。被國際獸疫局定為甲類傳染病，由稱真性雞瘟或歐洲雞瘟。按病原體不同，禽流感可分為高致病性、低致病性和非致病性三大類。一、定義禽流感：1878年，意大利發生雞群大量死亡〔雞瘟的由來〕，1955年證實其致病病毒為甲型流感病毒。此后，這種疾病被更名為禽流感1983～1984在美國、1992～1995在墨西哥、1999～2001在意大利均發生禽流感的爆發流行1997年香港發生了禽流感流行，150萬雞被宰殺，病毒為H5N12003年２月荷蘭發生禽流感病毒H7N7流行2003年12月5日禽流感在韓國爆發，疫情蔓延迅速，至今該病毒已經在亞洲10個國家和地區出現過不同程度的流行二、歷史回憶流感病毒屬于正粘病毒〔Orthomyxovirus〕，大多呈球形顆粒狀。正、副粘病毒的區別是以其核酸是否分節段為標準，分節段者為正粘病毒，不分節段者為副粘病毒。事實上，正粘病毒只有流行性感冒病毒一種。三、流感病毒結構：病毒的直徑為80～120nm，內有一直徑約為70nm的電子致密核心，是病毒的核衣殼。流感病毒的結構主要包括內部的核心〔即核衣殼〕和外面的包膜〔即病毒囊膜〕兩局部。核酸為單股負鏈RNA，甲、乙型流感病毒為8個節段，丙型為7個節段，每一個節段就是一個基因，決定流感病毒的遺傳特性。根據核蛋白抗原性的不同，可把感染人的流感病毒分為甲、乙、丙三型。三、流感病毒

滅活：·經過56℃，30分鐘、60℃，10分鐘處理均會喪失活性；加熱到65℃～70℃時只要2

分鐘即失活·對紫外線敏感，用紫外線直接照射病毒可以依次破壞其感染力、血凝素活性和神經氨酸酶活性·在陽光直射下流感病毒40～48小時即失活三、流感病毒四、流行病學(禽、人禽流感)傳播途徑：·飛沫經呼吸道傳播〔與SARS冠狀病毒育別〕·接觸傳播：經口，黏膜，破損皮膚·經口傳播：污物—口，糞—口(1)病毒別離·采用級雞胚或敏感細胞系(如Vero、MDCK)·通常采用鼻咽拭子、含漱液、氣管/肺胞灌洗液等·病毒別離后需經核酸檢測和/或血清檢測證實·病毒別離后可通過基因測序以確定所別離毒株與既往別離毒株間的關系

1.病原學檢測〔三〕實驗室檢查4.抗原檢測采用酶、熒光或其他標記單克隆抗體染色，可檢出感染細胞內相應的病毒抗原，作為早期特異性診斷。病原學檢測需要有兩個實驗室平行檢測，可與其他具有一定條件的實驗室協同。禽流感疫情確實認要由國家禽流感參考實驗室〔哈爾濱獸醫研究所〕檢測鑒定。第四節動物性食品中致病性寄生蟲的檢驗旋毛蟲囊尾蚴肉孢子蟲弓形蟲棘球蚴旋毛蟲病是重要的人畜共患寄生蟲病，它是由毛形科的旋毛形線蟲成蟲寄生于腸管，幼蟲寄生于橫紋肌所引起的。該病流行于哺乳類動物間，鳥類可實驗感染。人假設攝食了生的或未煮熟的含旋毛蟲包囊的豬肉可感染生病，主要臨床表現為胃腸道病癥、發熱、肌痛、水腫和血液嗜酸性粒細胞增多等，嚴重者可以導致死亡，故肉品衛生檢驗中將旋毛蟲列為首要工程。旋毛蟲病的肉品檢驗是生豬屠宰檢疫中的一項重要內容，通過該項檢驗可以檢出感染旋毛蟲的豬只。對于杜絕病豬肉流入肉品市場，有著重要的作用。一、實驗目的及要求1．掌握肌肉旋毛蟲壓片鏡檢法、消化法的操作方法。2．了解酶聯免疫吸附試驗的方法。3．掌握旋毛蟲病肉的處理方法。二、實驗器材〔一〕旋毛蟲壓片鏡檢法1．材料：被檢肉品。2．器材：載玻片，剪刀，鑷子，天平，顯微鏡。3．試劑：50%甘油水溶液，10%稀鹽酸。〔二〕旋毛蟲集樣消化法1．材料：被檢肉品。2．器材：組織搗碎機，采樣盤，磁力加熱攪拌器，圓盤轉動式計數鏡檢臺，集蟲器，載玻片，外表皿，燒杯，剪刀，鑷子，天平，溫度計，顯微鏡。3．試劑：0.04%胃蛋白酶溶液，鹽酸。三、實驗方法、步驟和操作要領〔一〕旋毛蟲壓片鏡檢法1．采樣。自胴體左右兩側橫膈膜的膈肌腳，各采膈肌1塊〔與胴體編成相同號碼〕，每塊肉樣不少于20g，記為一份肉樣，送至檢驗臺檢查。如果被檢樣品為局部胴體，那么可從肋間肌、腰肌、咬肌等處采樣。2．肉眼檢查。撕去被檢樣品肌膜，將肌肉拉平，在良好的光線下仔細檢查外表有無可疑的旋毛蟲病灶〔見圖21-2〕。未鈣化的包囊呈露滴狀，半透明，細針尖大小，較肌肉的色澤淡；隨著包囊形成時間的增加，色澤逐步變深而為乳白色、灰白色或黃白色。假設見可疑病灶時，做好記錄且告知總檢將可疑肉尸隔離，待壓片鏡檢后做出處理決定

3．制片。取清潔載玻片1塊放于檢驗臺上，并盡量靠近檢驗者。用鑷子夾住肉樣順著肌纖維方向將可疑局部剪下。如果無可疑病灶的，那么順著肌纖維方向在肉塊的不同部位剪取12個麥粒大小的肉粒〔2塊肉樣共剪取24個小肉粒〕。將剪下的肉粒依次均勻地附貼于載玻片上且排成兩行，每行6粒。然后，再取一清潔載玻片蓋放在肉片的載玻片上，并用力適度捏住兩端輕輕加壓，把肉粒壓成很薄的薄片，以能通過肉片標本看清下面報紙上的小字為標準。另一塊膈肌按上法制作，兩片壓片標本為一組進行鏡檢。4．鏡檢。把壓片標本放在低倍〔4×10〕顯微鏡下，從壓片的一端第一塊肉片處開始，順肌纖維依次檢查。鏡檢時應注意光線的強弱及檢查速度，切勿漏檢。5．結果判定。〔1〕沒有形成包囊的幼蟲，在肌纖維之間呈直桿狀或逐漸蜷曲狀態，但有時因標本壓得太緊，可使蟲體擠入壓出的肌漿中。〔2〕包囊形成期的旋毛蟲，在淡黃色背景上，可看到發光透明的圓形或橢圓形物。包囊的內外兩層主要由均質透明蛋白質和結締組織組成，囊中央是蜷曲的蟲體。成熟的包囊位于相鄰肌細胞所形成的梭形肌腔內。〔3〕發生機化現象的旋毛蟲。蟲體未形成包囊以前，包圍蟲體的肉芽組織逐漸增厚、變大，形成紡錘形、橢圓形或圓形的肉芽腫。被包圍的蟲體有的結構完整，有的破碎甚至完全消失。蟲體形成包囊后的機化，其病理過程與上述相似。由于機化灶透明度較差，需用50％甘油水溶液作透明處理，即在肉粒上滴加數滴50%甘油水溶液，數分鐘后，肉片變得透明，再覆蓋上玻片壓緊觀察。〔4〕鈣化的旋毛蟲。在包囊內可見數量不等、濃淡不均的黑色鈣化物，包囊周圍有大量結締組織增生。由于鈣化的不同開展過程，有時可能看到以下變化：①包囊內有不透明黑色鈣鹽顆粒沉著；②鈣鹽在包囊腔兩端沉著，逐漸向包囊中間擴展；③鈣鹽沉積于整個包囊腔，并涉及蟲體，尚可見到模糊不清的蟲體或蟲體全部被鈣鹽沉著。此外，在鏡檢中有時也能見到由蟲體開始鈣化逐漸擴展到包囊的鈣化過程〔多數是由于蟲體死亡后而引起的鈣化〕。發現鈣化旋毛蟲時，可以通過脫鈣處理，滴加10%稀鹽酸將鈣鹽溶解后，可見到蟲體及其痕跡，與包囊毗鄰的肌纖維變性，橫紋消失。〔5〕鑒別診斷。在旋毛蟲檢驗時，往往會發現住肉孢子蟲和發育不完全的囊尾蚴，蟲體典型者，容易識別，如發生鈣化，死亡或溶解現象時，那么容易混淆。〔二〕旋毛蟲集樣消化法1．實驗原理。先用機械方法將受檢肉樣搗碎，使其呈顆粒或絮狀，再用消化酶在最適溫度和最正確酸堿度條件下進行生物化學消化。本實驗采用快速集樣消化法，即由磁棒轉動帶動杯中消化液旋轉成旋窩，加速底物消化分解，同時比水重的有形物質隨旋窩的力量向中心移動，但未消化的巨型肌組織殘質那么被集蟲器外周粗篩阻留，而蟲體或蟲體包囊等細小物體隨旋窩向中心移動進入集蟲器；當轉動停止，集蟲器中的有形物質便隨旋窩作用逐漸沉降于底部細篩孔漏掉，只保存蟲體和包囊在篩面上供鏡檢。2．實驗方法、步驟和操作要領。〔1〕采樣。首先確定群檢分組的頭數，每組頭數的大小可根據各地區旋毛蟲病的發生情況而定，即在旋毛蟲病的低發病地區采取5-10頭豬為1組，而常年未檢出旋毛蟲的地區每組可增加到30-50頭或100頭。既能因地提高檢驗工效，又不致使旋毛蟲檢驗流于形式。如果以10頭豬為1組，其分組情況應按生產流水線上胴體編號1-10、11-20、21-30……順序。每頭豬取橫膈膜肌腳2g，每組10頭樣肉，共20g，依次放在序號相同的采樣盤或塑料袋內送檢。〔2〕搗碎。按采樣盤順序，每次取1組〔20g〕，置搗碎機容器中，參加0.04%胃蛋白酶溶液100ml〔按每10g樣肉加50ml酶溶液的比例〕，徐徐啟動搗碎機，轉速由8000rpm逐漸到16000rpm。搗碎約30s至肉樣成顆粒或絮狀，并混懸于混濁的消化液中。〔3〕加熱、消化、集蟲。取下容器將搗碎液倒入500ml燒杯中，參加2%的熱鹽酸溶液100ml〔與酶溶液等量〕，使溫