布魯氏菌病檢測技術布魯氏菌病檢測技術

1.概況

布魯氏菌病(簡稱布病)，是由布魯氏菌引起的一種人畜共患的傳染病。臨床主要特征是母畜流產、乳腺炎、不育和各種組織(如睪丸、關節)的炎癥。人類感染布病后，病程長，反復發作，長期不愈。布病幾乎遍及世界各地。凡有牲畜的地區都有布病流行。據不完全統計，在160個國家和地區中就有123個國家和地區有布病發生。我國多見于內蒙古、東北，西北等牧區。在北方農區也有散發，常呈地地方性流行。

在不良環境，如抗生素的影響下，本菌易發生變異，通常變異形成的布魯氏菌可在機體內長期存在。該菌對熱抵抗力不強，63℃經7～10min可被殺死，在鮮乳中可存活2天到18個月，在凍肉中可存活14～47天，在干燥土壤和胎兒體內可分別存活37天和6個月。對常用消毒藥敏感，如0.1％升汞數分鐘，1％來蘇兒或2％福爾馬林15min可將其殺死。日光下曝曬4h可殺死本菌。

人和多種動物對布魯氏菌易感。動物中羊、牛、豬的易感性最強。母畜比公畜，成年畜比幼年畜發病多。在母畜中，第一次妊娠母畜發病較多。帶菌動物，尤其是病畜、流產胎兒、胎衣是主要傳染源。消化道、呼吸道、生殖道是主要的感染途徑，也可通過損傷的皮膚、粘膜等感染。常呈地方性流行。人主要通過皮膚、粘膜和呼吸道感染。

本病一年四季均可發病。流行區在發病高峰季節(春末夏初)可呈點狀暴發流行。患病與職業有密切關系，如：獸醫、畜牧工作者、屠宰工人、皮毛工

等感染機會較高。

人類布魯氏菌病的預防，首先要注意職業性感染，凡在動物養殖區、屠宰區、畜產品加工廠的工作者以及獸醫、實驗室工作人員等，必須嚴守防護制度(即穿著防護服裝，做好消毒工作)，尤其在仔畜大批生產季節。更要特別注意。病畜乳肉食品必須滅菌后食用。必要時可用疫苗接種，接種前應行變態反應試驗。陰性反應者才能接種。2.實驗室監測技術概述(據布魯氏菌病防治技術規范)

2.1檢測方法血清學實驗或細菌分離。初篩試驗選用虎紅平板凝集試驗(RBPT)或乳牛布病全乳環狀試驗(MRT)(見GB/T18646)。正式試驗選用動物布病試管凝集試驗(SAT)或動物布病補體結合試驗(CFT)(見GB/T18646)

2.2監測對象：牛、羊、豬、鹿等動物。

2.3監測方法：采用流行病學調查、血清學方法，結合細菌分離進行監測。

2.4監測范圍、數量

免疫地區：對新生畜、未免疫畜、免疫一年半或口服免疫一年以后的牲畜進行監測(豬可在口服免疫半年后進行)。監測至少每年進行一次，牧區縣抽檢500頭(只)以上，農區和半農半牧區抽檢200頭(只)以上，交通不便的邊遠地區抽檢3個鄉9個村50%的牲畜進行血清學監測。

非免疫地區：監測至少每年進行一次。達到控制標準的牧區縣抽檢1000頭(只)以上，農區和半農半牧區抽檢500頭(只)以上；達到穩定控制標準的牧區縣抽檢500頭(只)以上，農區和半農半牧區抽檢200頭(只)以上。

所有的奶牛、奶山羊和種畜每年必須進行兩次血清學監測。

2.5監測時間

對成年動物監測時，豬、羊在5月齡以上，牛在8月齡以上，懷孕動物則在第1胎產后半個月至1個月間進行；對S2、M5、S19菌苗免疫接種過的動物，在接種后18個月(豬接種后6個月)進行。

2.6監測結果的判定與報告

初篩試驗出現陽性反應，并有流行病學史和臨床癥狀或分離出布魯氏菌，判為病畜。

血清學正式試驗中試管凝集試驗陽性或補體結合試驗陽性，判為陽性畜。

判定時應注意排除其它疑似疾病和菌苗接種引起的血清學反應。

按要求使用和填寫監測結果報告，并及時上報。

疫情處理必須嚴格執行《牛結核病防治技術規范》的有關要求。

3.實驗室檢測方法

實驗室檢測包括以下幾種方法：

3.1細菌學檢測

將樣品剪成小塊，用鑷子夾住直接涂抹在肝湯瓊脂平板上，一式兩份，一份放10%二氧化碳中培養，一份在普通環境中培養，一般37℃培養10天，布氏桿菌菌落在上述瓊脂板上呈無色、透明、圓形、隆起、表面光滑、均質樣的菌落、菌落中央有時有很小的顆粒，菌落開始微透明，以后逐漸變為混濁，菌落大小不等。挑取菌落涂片鏡檢即可發現布氏桿菌。

用母畜流產的胎兒組織和胎衣涂片鏡檢也能檢測到布氏桿菌。

3.2凝集反應試驗

3.2.1方法

目前對于布病的診斷多采用凝集反應試驗，主要檢測血清或乳中的抗布魯氏菌抗體。常用的監測方法有虎紅平板凝集試驗、布病試管凝集試驗、全乳環狀試驗、補體結合試驗。虎紅平板凝集試驗和全乳環狀試驗適用于家畜布病田間篩選試驗和乳牛場布病的監測及診斷泌乳母牛布病的初篩試驗；試管凝集試驗和補體結合試驗適用于診斷羊種、牛種和豬種布病感染的家畜。

3.2.2病料

3.2.2.1

虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗和補體結合試驗的病料為血清，即按常規方法采血分離制備的血清，血清應新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血，無腐敗氣味。

3.2.2.2

乳牛布病全乳環狀試驗的病料為新鮮、潔凈的全乳，采樣時應將母畜的乳房用溫水洗凈、擦干，然后將乳液擠入潔凈的器皿中。

3.2.3操作步驟(僅介紹常用的虎紅平板凝集試驗和試管凝集試驗)

3.2.3.1虎紅平板凝集試驗主要的操作過程：

3.2.3.1.1

標準陰、陽性血清對照試驗

分別吸取陽性血清和陰性血清各0.03ml，分別滴于玻璃板上，在陽、陰性血清旁滴各加0.03ml抗原，用牙簽攪動血清和抗原，使之充分混合，2min時判斷結果，陽性血清有凝集現象；陰性血清無凝集現象，呈均勻粉紅色。

3.2.3.1.2

檢測樣品

分別吸取待檢血清各0.03ml，滴于玻璃板上，在待檢血清旁各滴加0.03ml抗原，用牙簽攪動血清和抗原，使之充分混合，2min時判斷結果。

3.2.3.1.3

結果判定方法和依據:

在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定；受檢血清4min內出現肉眼可見凝集現象者判為陽性(+)，無凝集現象，呈均勻粉紅色者判為陰性(-)。

3.2.3.2試管凝集試驗主要的操作過程：

3.2.3.2.1

受檢血清的稀釋度：一般情況，牛、馬和駱駝用1：50，1：100，1：200和1：400四個稀釋度。大規模檢疫時也可只用兩個稀釋度即牛、馬和駱駝為1：50和1：100；豬、山羊、綿羊和狗為1：25和1：50。

3.2.3.2.2

稀釋血清(以羊、豬為例)和加入抗原的方法：

每份血清用5支小試管(口徑8-10mm)，第一管加入2.3ml石炭酸生理鹽水，第二管不加，第三、四和第五管各加入0.5ml。用1ml吸管吸取受檢血清0.2ml，加入第一管中，并混合均勻。混合方法：是將該試管中的混合液吸入吸管內，再沿管壁吹入原試管中，如此吸入、吸出三、四次。混勻后，以該吸管吸取混合液分別加入第二管和第三管，每管0.5ml。以該吸管將第三管的混合液混勻(方法同前)吸取0.5ml加入第四管混合后，又從第四管吸出0.5ml加入第五管，第五管混勻完畢棄去0.5ml。如此稀釋之后從第二管起血清稀釋度分別為1：12.5，1：25，1：50和1：100。

血清規定用0.5%石炭酸生理鹽水稀釋，但檢驗羊血清時用0.5%石炭酸10%鹽水溶液稀釋。

加入抗原的方法：先以0.5%石炭酸生理鹽水，將抗原原液作20倍稀釋(如果血清用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋則抗原原液亦須用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋)然后加入上述各管(第一管不加，留作血清蛋白凝集對照)，每管0.5ml，振搖均勻，加入抗原后，第二管至第五管各管混合液的溶積均為1ml，血清稀釋度從第三管起依次變為1：25，1：50，1：100和1：200。

牛、馬和駱駝血清稀釋和加抗原法，具體方法與上述的是一致的，不同的是，第一管加2.4ml0.5%石炭酸生理鹽水和0.1ml受檢血清，加抗原以后從第二管到五管血清稀釋度為1：50、1：100、1：200和1：400。

3.2.3.2.3

對照管的制作：

每次試驗須作三種對照各一份。

陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清同。

陽性血清對照：陽性血清對照須稀釋到其原有滴度，加抗原的方法與受檢血清相同。

抗原對照(了解抗原是否有自凝現象)：加1：20抗原稀釋液0.5ml于試管中，再加0.5ml0.5%石炭酸生理鹽水(如果血清用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋則也加入0.5%石炭酸，10%鹽水溶液)。

3.2.3.2.4

比濁管的制作：

每次試驗須配制比濁管作為判定清亮程度(凝集反應程度)的依據，配制方法如下：取本次試驗用的抗原稀釋液(即抗原原液20倍稀釋液)5—10ml加入等量的0.5%石炭酸生理鹽水(如果血清用0.5%石炭酸，10%鹽水溶液稀釋則加入0.5%石炭酸，10%鹽

水溶液)作對倍稀釋，然后按下表配制比濁管。管號

抗原稀釋液(ml)

石炭酸生理鹽水(ml)清亮度

標記1

0.0

1.0

100%

++++2

0.25

0.75

75%

+++3

0.50

0.50

50%

++4

0.75

0.25

25%

+5

1.0

0.0

0%

—3.2.3.2.5

全部試管于充分振蕩后置37℃—38℃恒溫箱中22—24小時，然后檢查并記錄結果。

3.2.3.2.6

記錄結果：

根據各管中上層液體的清亮度記錄凝集反應的強度(凝集價)特別是50%清亮度(即“++”的凝集)對判定結果關系很大。需用比濁管對照判定。

++++：等于完全凝集和沉淀，上層液體100%清亮(即100%菌體下沉)。

+++：等于幾乎完全凝集和沉淀，上層液體75%清亮。

++：等于顯著凝集和沉淀，液體50%清亮。

+：等于沉淀明顯，液體25%清亮。

—：等于無沉淀，不清亮。

確定每份血清的效價時，應以出現兩個“++”以上的凝集現象(即50%的清亮)的最高血清稀釋度為血清的凝集價。

3.2.3.2.7

試驗結果的判定

3.2.3.2.7.1

牛、馬和駱駝于1：100稀釋度，豬、山羊、綿羊和狗于1：50稀釋度出現兩個加號以上的凝集現象時，被檢血清判定為陽性反應。牛、馬和駱駝于1：50稀釋度，豬、山羊、綿羊和狗于1：25稀釋度出現兩個加號以上凝集現象，被檢血清判定為可疑反應。

3.2.3.2.7.2

可疑反應的牲畜，經3—4周，須重新采血檢驗，在牛和羊，如果重檢時仍為可疑，該畜判定為陽性。在豬和馬重檢時，如果凝集價仍然保持可疑反應水平，而農場的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性反應的患畜出項，該畜血清判定為陰性。

3.2.3.2.7.3

鑒于豬血清常有個別出現非特異性凝集反應，在試驗時須結合流行病學判定結果。如果受檢血清中有個別出現弱陽性反應(例如凝集價為1：100—1：200)，但豬群中所有的豬只均無布氏桿菌病臨床癥狀(流產、關節炎、睪丸炎等)，可考慮此種反應為非特異性，經3—4周可采血重檢。

3.2.3.2.7.4

將試驗結果通知畜主時，須注明凝集價。

3.3直接檢測病料中的病原

應用免疫酶組化直接法、間接法及SPA法檢測病料中的布魯氏菌，應用PCR技術檢測布魯氏菌，應在實際工作中加以應用。酶聯免疫吸附試驗、聚合酶鏈反應試驗的具體操作方法，按照使用說明書操作。

4.防治措施

4.1加強檢疫。引種時檢疫，引入后隔離觀察一個月，確認健康后方能合群。

4.2定期預防注射。布魯氏桿菌19號弱毒菌苗或凍干布氏桿菌羊5號弱毒菌苗可于成年母牛每年配種前1——2個月注射，免疫期一年。

4.3嚴格消毒。對病牛污染的圈舍、運動場、飼槽、臥床、等用5%克遼林、5%來蘇兒、10%—20%石灰乳或2%氫氧化鈉等消毒；病牛皮用3%——5%來蘇兒浸泡24h后用；乳汁煮沸消毒；糞便發酵處理。

4.4培育健康幼畜。約占50%的隱性病牛，在隔離飼養條件下，可經2——4年而自然痊愈；在奶牛場，可用健康公牛的精液人工授精，犢牛出生后食母乳3—5d送犢牛隔離舍喂以消毒和健康乳；6個月后作間隔為5——6周的兩次檢疫，