一種魚類DNA的非損傷檢測方法宋君;王東;葉先林;雷紹榮淳5靈安【摘要】為了減少和改變對瀕危野生魚類的大量傷害性取樣，本文探索了從非損傷性取樣的魚類體表粘液樣品中提取魚類基因組DNA的方法，并用常用的兩種分子標記(Cytb和D-Loop)檢測了分離到的粘液DNA.結果表明,從非損傷性取樣的魚類粘液樣品中能夠分離到高質量的魚類基因組DNA,可用于后續的研究工作.魚類體表粘液的非損傷性取樣及其DNA提取，為瀕危野生魚類遺傳學研究提供了一種新的非損傷性DNA檢測技術.【期刊名稱】《四川動物》【年(卷)，期】2013(032)006【總頁數】5頁(P853-856,861)【關鍵詞】非損傷性取樣;粘液DNA;檢測【作者】宋君;王東;葉先林;雷紹榮;郭靈安【作者單位】四川大學生命科學學院，四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室,成都610064;四川省農業科學院分析測試中心，成都610066;四川省農業科學院分析測試中心，成都610066;四川省農業科學院分析測試中心，成都610066;四川省農業科學院分析測試中心，成都610066;四川省農業科學院分析測試中心，成都610066【正文語種】中文【中圖分類】Q959.4;Q78瀕危物種的研究長期以來受到樣品來源的限制，通過采集諸如大量的珍稀瀕危動物血液、肌肉、肝臟、心臟、腎臟和脾臟等組織材料以提取足量的蛋白質和DNA，顯然是不可取的。在生物研究中，常用的取樣方法主要有3種，即傷害性取樣（destructivesampling）.非傷害性取樣（non-destructivesampling）和非損傷性取樣（non-invasivesampling）（Morin&Woodruff,1996）。非損傷性取樣是在不觸及或傷害野生動物本身的情況下，通過收集脫落的毛發或羽毛、糞便、尿液、食物殘渣、鹿角、魚鱗和卵殼等不同形式的分析樣品而進行遺傳分析的一種取樣方法（劉麗等，2007）。早期研究中的魚類等水生生物取樣，主要采用傷害性取樣方式從魚類的血液、肌肉、肝臟及腎臟等器官（組織）中提取DNA（薛良義，2000;馬洪雨等，2005；夏穎哲等，2007）和非傷害性取樣方式從鱗片中提取魚類DNA（胡光源等，2011）。傷害性取樣對于瀕危野生魚類資源是一種嚴重的破壞，因此，探討魚類尤其是瀕危野生魚類的非損傷性取樣有著非常重要的現實意義。目前，從魚類體表粘液的非損傷性取樣中提取DNA并用于后續分析的研究尚無報道。本文采用非損傷性取樣方法收集了鯽魚Carassiusauratus體表粘液和脫落鱗片，同時用無傷害性取樣方法采集了鯽魚尾鰭作對照，從鯽魚體表粘液、脫落鱗片和尾鰭中提取DNA，并用endpointPCR（終點法PCR）或realtimePCR（實時PCR）對鯽魚Cytb（細胞色素b）和D環控制區的部分DNA片段進行了分子檢測，以期為魚類遺傳學研究提供一種新的非損傷性DNA檢測技術。1材料和方法1.1無損取樣從市場上購買1尾鮮活鯽魚Carassiusauratus，質量約150g，在實驗室條件下常規飼養備用。鯽魚體表粘液的采集:用小型號的藥匙輕輕從鯽魚體表刮取少量粘液，轉移到2mL的滅菌離心管中，粘液采集量約50pLo鱗片收集:收集養殖過程中，鯽魚脫落的鱗片1~2片，用剪刀剪碎后轉移到2mL的滅菌離心管中。尾鰭采集:剪取少許(約5mg)尾鰭，剪碎后轉移到2mL的滅菌離心管中。1.2基因組DNA的提取及其質量檢測根據Sambrook等(1989)所描述的蛋白酶K-酚氯仿法提取尾鰭、鱗片的DNA。采用微量樣品基因組DNA提取試劑盒(TIANampMicroDNAKit，天根生物技術公司，北京)抽提鯽魚體表粘液DNA，抽提方法參照試劑盒說明書并略作修改。首先將收集到的粘液樣品1800g離心5min，小心倒掉上清液;添加200"緩沖液GA重懸沉淀;向沉淀懸液中加入20"蛋白酶K溶液(20mg/mL),渦旋10s混勻，56°C放置60min，期間每15min渦旋混勻3次加入200"緩沖液GB和1pLCarrierRNA(1pg/pL),充分顛倒混勻，70C放置10min，期間每3min渦旋10￡加入200pL無水乙醇，充分混勻后將混合液直接加入到帶收集管的吸附柱中，13000g離心30s，棄廢液;向吸附柱中加入500pL緩沖液GD,13000g離心30s，棄廢液;向吸附柱中加入700pL漂洗液PW,13000g離心30s，棄廢液；向吸附柱中加入500pL漂洗液PW,13000g離心30s，棄廢液;將吸附柱中加收集管13000g離心2min，棄廢液，將吸附柱常溫下放置約5min，晾干吸附柱中殘留的漂洗液;將吸附柱轉移到干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加20~50pL洗脫緩沖液TB。室溫放置2~5min,13000g離心2min，將溶液收集到離心管中。為增加基因組DNA的得率，將離心得到的溶液再次加入到吸附柱中，室溫放置2min,13000g離心2min，收集管中收集到的溶液即為鯽魚體表粘液DNA溶液。用超微量紫外分光光度計(Nanodrop1000,Thermo)檢測DNA溶液的A260/A280比值、A260/A230比值及其在260nm處的紫外線吸收峰然后用水平電泳分離提取的DNA，觀察DNA的完整性。1.3Cytb和D-Loop部分片段的檢測為了檢驗非損傷性取樣分離到的DNA能否用于魚類遺傳學研究，分別采用魚類群體遺傳學中常用的兩種分子標記Cytb（細胞色素b）和D-Loop（線粒體D環控制區）對提取的DNA進行檢測。擴增Cytb片段（475bp）的上、下游弓物分別為5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3'和5'-CCTCAGAAGGATATTTGTCCTC-3'（農業部953號公告，2007）o25pL擴增反應體系中分別加入10xPCR緩沖液18.3pL,10mM的dNTPs1pL,25pM的上、下游弓物各1pL,5U/pL的Taq酶0.2pL,模板DNA約50ng，然后補充滅菌水至25pL。Cytb片段擴增反應程序為94^變性3min，然后進行35次循環擴增反應（93°C變性30s,58°C退火30s,72°C延伸40?,最后72C延伸5min。采用引物5'-ACCCCTGCGTCCCAAAGC-3'和5'-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3'（劉煥章，2002）擴增鯽魚線粒體D-Loop1000bp的片段。在擴增D-Loop片段的25pLPCR反應體系中加入模板DNA約50ng,2xPCRMastermix（天根生物技術公司，北京）12.5pL,10pM的上、下弓物各1pL,然后補充滅菌水至25pL。擴增反應條件為95C預變性5min,35個循環反應（94C30s,55°C30s;72°C30s）,最后72C延伸7min。根據巖原鯉Procyprisrabaudi線粒體D-Loop序列（GenBank,HQ199642）,設計引物5'-CCTGTTATCCTTGTCAAACCC-3',5'-TGGGATGCAA-TTTATACCTCAA-3和探針FAM-5'-CGTTCTTGAGT-CCTCCTTGGTTTCG-3'-TAMRA，采用realtimePCR檢測尾鰭、鱗片和粘液DNA的D-Loop片段。在擴增D-Loop片段的20pL實時PCR反應體系中加入模板DNA100ng,2xqPCRmix（THUNDERBIRDTMProbeqPCRMix，東洋紡）10pL,10pM的上、下引物各1pL,10pM的探針0.5pL,50xROXreferencedye0.4pL,然后補充滅菌水至20"。擴增反應條件為95°C預變性10min,40個循環反應(95°C60s,60°C60s)。2結果與分析2.1尾鰭、鱗片及粘液DNA的質量用超微量紫外分光光度計對尾鰭、鱗片及粘液DNA進行檢測，能夠清楚觀察到在260nm波長的紫外線照射下，尾鰭、鱗片及粘液DNA溶液均有強烈的吸收峰(圖1)。尾鰭、鱗片及粘液DNA溶液的A260/A280比值分別為2.11、2.05和2.12;尾鰭、鱗片及粘液DNA溶液的A260/A230比值分別為2.26、4.5和2.17。電泳結果顯示，粘液DNA的片段大小與采用經典的蛋白酶K-酚氯仿法提取的尾鰭和鱗片DNA片段大小基本一致(圖2),都遠遠大于2000bp,3種不同組織(器官)的DNA都有清晰的主帶(DNA大片段)。鯽魚3種不同組織(器官)DNA的A260/A280比值(1.8~2.0)、A260/A230比值(>2.0)以及DNA電泳結果，表明在非損傷性方法采集到的魚類體表粘液中能夠分離到純度較高、分子量較大的DNA。圖1尾鰭(A)、鱗片(B)及粘液(C)DNA在波長為260nm紫外線照射下的吸收峰Fig.1Absorptionpeakofultraviolet(260nm)ofDNAisolatedfromcaudalfin(A),scales(B)andmucus(C)圖2尾鰭、鱗片及粘液DNA電泳結果M為分子量(Marker);泳道1、2為尾鰭DNA;泳道3、4為鱗片DNA;泳道5、6為粘液DNAFig.2ElectrophoresisresultofDNAextractedfromcaudalfin,scalesandmucussampledfromcrucianMrepresentedmolecularmarker;Lane1and2showedtheDNAisolatedfromcaudalfin;Lane3and4indicatedtheDNAextractedfromscales;Lane5and6showedtheDNAisolatedfrommucus2.2Cytb和D-Loop分子標記檢測為了驗證獲得的鯽魚體表粘液DNA是否為魚類DNA以及能否用于后續的研究，本實驗用分離到的鯽魚體表粘液DNA為模板，擴增了魚類Cytb基因中的部分片段。實驗結果顯示，與用尾鰭、鱗片DNA為模板的擴增結果一樣，從粘液DNA中也同樣擴增出預期的475bp大小的Cytb片段(圖3)，且在Cytb基因片段的擴增實驗中，空白對照無擴增，顯示擴增實驗無污染，反應體系工作正常。因此，該實驗表明通過非損傷性方法采集的魚類體表粘液樣品中分離到的DNA中含有魚類基因組DNA，能夠用于后續分析。圖3尾鰭、鱗片及粘液DNA的Cytb分子標記檢測結果M為分子量標準(Marker);泳道1為擴增實驗的空白對照;泳道2、3是以尾鰭DNA為模板的擴增結果;泳道4、5是以鱗片DNA為模板的擴增結果;泳道6、7是以粘液DNA為模板的擴增結果Fig.3AmplifiedfragmentsofCytbusingtheDNAextractedfromcaudalfin，scalesandmucusastemplateDNAinPCRMrepresentedmolecularmarker;Lane1showedtheamplifiedresultofblankcontrolinthisexperiment;Lane2and3indicatedtheamplifiedresultusingthetemplateDNAofcaudalfin;Lane4and5showedtheamplifiedresultusingthetemplateDNAofscales;Lane6and7indicatedtheamplifiedresultusingthetemplateDNAofmucus圖4尾鰭、鱗片及粘液DNA的D-Loop分子標記檢測結果M為分子量標準(Marker);泳道1為擴增實驗的空白對照;泳道2、3是以尾鰭DNA為模板的擴增結果;泳道4、5是以鱗片DNA為模板的擴增結果;泳道6、7是以粘液DNA為模板的擴增結果Fig.4AmplifiedfragmentsofD-LoopusingtheDNAextractedfromcaudalfin,scalesandmucusastemplateDNAinPCRMrepresentedmolecularmarker;Lane1showedtheamplifiedresultofblankcontrolinthisexperiment;Lane2and3indicatedtheamplifiedresultusingthetemplateDNAofcaudalfin;Lane4and5showedtheamplifiedresultusingthetemplateDNAofscales;Lane6and7indicatedtheamplifiedresultusingthetemplateDNAofmucus采用一對特異擴增魚類線粒體D-Loop1000bp片段的弓物儀U煥章，2002)，以粘液DNA為模板進一步擴增鯽魚線粒體D-Loop片段。以粘液DNA為模板的擴增結果與以尾鰭、鱗片DNA為模板的擴增結果一樣，都擴增出預期1000bp的D-Loop片段(圖4),而且以3種不同組織(器官)的DNA為模板的擴增條帶亮度(擴增終產物的量)均較亮，顯示粘液DNA與尾鰭、鱗片DNA的擴增效率較高，說明無損取樣獲得的粘液DNA能用于魚類D-Loop片段遺傳多樣性分析。圖5尾鰭心)鱗片(B)及粘液(C)DNAD-Loop片段的realtimePCR結果Fig.5AmplifiedresultsofD-Loopusingcaudalfin(A),scales(B)andmucus(C)DNAastemplateDNAintherealtimePCR以鯽魚3種不同組織(器官)的DNA為模板，采用realtimePCR檢測D-Loop片段。實驗結果顯示，根據巖原鯉D-Loop序列設計的特異探針都能與從尾鰭、鱗片和粘液中獲得的DNA雜交，并且分別在17.24、18.42、17.17個循環(cyclesofthreshold)時收集到高于背景噪聲的D-Loop片段擴增信號，說明從魚類體表粘液中分離到的DNA濃度與從尾鰭、鱗片中獲得的DNA濃度相差不大(Ct值反映體系中的模板量)。3討論通過傷害性取樣方式如捕捉、損傷，甚至殺死生物個體等方式，采集大量的、滿足統計學要求數量的樣本，對有限的野生魚類資源尤其是瀕危野生魚類資源是極大的破壞，不利于瀕危魚類的保護。本文探索了一種新的非損傷性采樣方式，從魚類體表粘液中提取魚類基因組DNA的方法，同時采用魚類群體遺傳學中應用較廣泛的細胞色素b(Cytb)和線粒體D環控制區兩種分子標記檢測了分離到的粘液DNA,成功地從粘液DNA中擴增出與對照樣品DNA（尾鰭、鱗片DNA）片段大小一致的Cytb和D-Loop片段，說明從魚類體表粘液中提取的DNA用于魚類遺傳學研究是可行的。收集魚類體表粘液、脫落的鱗片，對魚類生長不造成傷害和損傷，這種取樣方式是一種非損傷性取樣;直接從魚類身體上采集少量的鱗片、剪取少量的鰭條對魚類生長不造成嚴重的傷害，這種方式是非傷害性取樣。體表粘液、鱗片和鰭條，這3種不同組織（器官）相比較而言，鰭條是魚類運動的重要器官，而鱗片對魚類體表有保護作用，因此這兩種組織（器官）的取樣對魚類的生存會有一定的影響。雖然魚類體表的粘液在魚類運動中起著減小對水的摩擦等作用，但是魚類會隨著不同環境和條件自動調節粘液的分泌量（劉德明，2011），因此采集少量的粘液提取魚類基因組DNA，對魚類是一種安全的非損傷性取樣。實時PCR中的探針能與鯽魚體表粘液中分離到的DNA雜交并能擴增出D-Loop片段，表明從魚類體表粘液中分離到魚類基因組DNA是可行和可信的。魚類基因組DNA的提取方法主要有經典的酚氯仿法、甲酰胺法、纏繞DNA以及普通試劑盒法（張亞平，1996瀏臻等，2004;夏紅軍等，2004）等，這些方法主要用于肌肉、肝臟、腎臟、血液和鰭條等組織（器官）中的DNA分離與純化，對樣品保存要求較高（如低溫、組織未腐爛腐等），存在樣品用量較大，實驗中的有機物（苯酚、乙醇）殘留相對較多，耗時費力等問題。由于魚類體表粘液中的DNA含量相對于肌肉、肝臟和腎臟等器官DNA的含量較少，而且考慮到對野生魚類資源的保護，因此在非損傷性取樣中也應盡量收集少量的粘液。對樣品量少、DNA含量低的粘液，我們選擇了微量樣品基因組DNA提取試劑盒（TIANampMicroDNAKit）來抽提粘液DNA。與酚氯仿等傳統方法相比，微量樣品基因組DNA提取試劑盒在優化的pH值條件下，采用carrierRNA、離心柱（硅膠薄膜）快速、有效地吸附DNA，大大提高了DNA分離效率，同時由于沒有采用有機試劑來分離、純化及沉淀DNA，所以獲得的DNA溶液中有機物等PCR抑制劑含量更低，在后續的PCR分析中能更高效地擴增基因片段。參考文獻胡光源，石振廣，張忠亮，等.2011.達氏鯉總DNA提取初探[J].黑龍江水產，2:26-28.劉德明.2011.魚類體表粘液流變行為的研究[D].浙江大學碩士學位論文.劉煥章.2002.魚類線粒體DNA控制區的結構和進化:以鳑敲魚類為例[J].自然科學進展，12(3):266-270.劉麗，劉楚吾，張明輝，等.2007.不