丙泊酚對體外培養發育期海馬神經元的神經毒性作用及機制研究第一部分原代大鼠海馬神經元的培養、鑒定及形態學觀察目的：通過對新生24h內SD乳鼠海馬神經元的培養，掌握大鼠海馬神經元體外培養方法；利用免疫熒光細胞化學方法鑒定神經元純度；觀察原代海馬神經元形態學特點，測定細胞生長曲線。方法：取新生24h內的SD乳鼠，用75%乙醇消毒，斷頭，無菌條件下分層剪開皮膚和顱骨，暴露兩側大腦半球，彎鑷取出大腦，置于預冷的DMEM液中，迅速分離出兩側海馬組織，在解剖顯微鏡下去除血管和被膜，移入溶有木瓜酶的DMEM中，置于培養箱(37°C,5%CO2)中消化30min。用玻璃吸管將組織塊移入加有10%血清的DMEM液中終止消化兩次，每次2min。然后將組織塊移入加有血清的DMEM液中，用進口槍頭輕輕吹打數次，靜置后取上清液，如此重復2次。取0.9ml按臺盼藍拒染法進行活細胞計數，制成密度為1×106/ml的細胞懸液,種植于基膜包被的24孔培養板中，每孔加150μl，置于37°C，5％CO2的培養箱內培養。4～6h后在倒置相差顯微鏡下觀察神經細胞生長情況，全量換含有1%N2、2%B27的Neurobasal培養液。此后每2d半量換液，并在倒置相差顯微鏡下觀察神經元生長情況。神經元培養7d后，4%PFA固定，0.3%Triton透膜，10%BSA封閉后滴加一抗β-Tubulin抗體(1:200稀釋)，4°C孵育過夜，加2%BSA稀釋的Dylight488標記的二抗，37°C孵育2h。10μg/ml的Hoechst33258復染細胞核，避光孵育20min。熒光顯微鏡下觀察。在高倍視野(×200)下隨機選取5個視野，計數陽性細胞數，換算為百分比，取均值作為神經元純度。將細胞接種于96孔板，每隔兩天測吸光度值，共測8次得出生長曲線。結果:1剛剛接種的細胞形態為圓形，體積小、透亮、呈懸浮狀態，單個均勻分布，培養4～6h后細胞已貼壁，呈圓形或橢圓形，已有細胞出現突起，少量細胞呈梭形。接種24h，細胞形態多呈梭形、三角形、椎體形，突起伸長，長短不一。接種48h，細胞多出現2～3個突起，且突起較長，扁平狀多邊形的神經膠質細胞數量較少。3d后細胞具有典型神經元形態，細胞突起增多伸長。5d后神經元開始形成神經元群落，突起已經形成比較稠密的纖維網絡。7～10d神經元胞體最豐滿，具有明顯的光暈，突起相互交織成更加密集的網絡。14d后細胞聚集現象較為明顯，培養板上出現的細胞間空白區域明顯。之后神經細胞逐漸退化，細胞邊緣光暈變淺變淡，突起逐漸退縮，部分細胞核具有明顯的固縮。2原代培養神經元形態典型，突起連接成網，細胞核染色清晰，β-TubulinⅢ陽性神經元所占比例為(91.21±0.02)%，能夠滿足進一步的實驗要求。3原代海馬神經元生長曲線測定顯示，海馬神經元體外培養條件下經歷了生長潛伏期(2～4d)，對數生長期(4～12d)，后進入生長平臺和衰退期，細胞生長處于停滯和衰退狀態。結論：1原代SD新生乳鼠海馬神經元，在培養10d后細胞形態逐漸成熟。在倒置相差顯微鏡下形態呈梭形、三角形、錐體形。2原代培養的神經元免疫熒光染色為β-tublinⅢ陽性細胞，其純度為(91.21±0.02)%。3原代海馬神經元的培養經歷了一個生長潛伏期、對數生長期、生長平臺期和衰退期。第二部分丙泊酚對發育期海馬神經元活力和凋亡的影響目的：通過給予不同濃度的丙泊酚培養神經元不同的時間后，采用MTT法測定丙泊酚對發育期的海馬神經元的活性影響；采用流式細胞技術測定不同濃度的丙泊酚培養24h對海馬神經細胞凋亡率和周期的影響；采用Hoechst33258染色觀察神經元的凋亡情況。方法：取原代培養4～5d的海馬神經元，分別加入10μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml、100μg/ml不同濃度的丙泊酚，作用12、24、48、72h后，測量MTT值。每次實驗均設原代培養基作為空白對照組。細胞活力=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)。根據MTT所得結果，在6孔板培養海馬神經元4～5d，加入40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml不同濃度丙泊酚，繼續培養24h，收集細胞標本，通過流式細胞技術檢測海馬神經元的凋亡和周期；Hoechst33258染色測定凋亡，細胞培養同流式檢測，其分組同MTT檢測各組。結果：1MTT法檢測細胞活力結果表明，丙泊酚對海馬神經元活力的影響具有濃度和時間的交互作用(F=11.116,P<0.01)。當給藥濃度相同時，丙泊酚作用海馬神經元不同的時間，對其活力的影響具有顯著性差異(F=18.565,P<0.01)，其中丙泊酚在處理12h和48h后無顯著性差異。當作用時間相同時，不同濃度的丙泊酚對細胞活力的影響具有顯著性差異(F=889.074,P<0.01)，與對照組相比10μg/ml丙泊酚在各個作用時間上均無顯著性差異。2流式細胞技術檢測凋亡率表明，各濃度丙泊酚處理海馬神經元24h對其凋亡率的影響具有顯著性差異（F=76.577,P<0.01）。各濃度丙泊酚與對照組相比，均有統計學差異，且隨濃度的增加神經元凋亡率增加。流式細胞技術檢測細胞周期結果表明，不同濃度丙泊酚作用于海馬神經元24h對細胞周期的G0/G1期和S期的影響具有顯著性差異（F=138.456,P<0.01;F=114.158,P<0.01），40、60、80μg/ml濃度均有統計學差異。隨著丙泊酚作用濃度的增加，G0/G1期的細胞比率逐漸下降，S期的細胞比率逐漸增高，G2/M期細胞比率在所有組別中有統計學差異（F=14.131,P<0.01），40、60μg/ml與對照組相比無統計學差異。3Hoechst33258熒光染色細胞核表明隨著丙泊酚濃度的增加，細胞核變形，呈折縫樣或呈波紋狀的細胞核逐漸增多，部分染色質凝聚、邊緣化，100μg/ml時細胞數明顯減少，細胞核甚至裂解成碎塊。結論：丙泊酚對發育期海馬神經元活力具有抑制作用且呈時間和濃度依賴性，兩者有交互性。不同濃度丙泊酚對發育期海馬神經元的凋亡率的影響顯著，且隨濃度的增加而增加，而且可促進發育期海馬神經元由G0/G1期進入S期，但不能進入G2/M期，細胞增殖停滯于S期。第三部分Rho信號通路在丙泊酚致發育期海馬神經元毒性中的作用目的：采用RT-PCR技術檢測Rho信號通路在丙泊酚神經毒性中的作用。方法：取原代培養4～5d海馬神經元進行實驗，分為對照組、80μg/ml丙泊酚處理組、80μg/ml丙泊酚加10μMY27632混合組、10μMY27632組，即C組、P組、P+Y組和Y組，培養時間為24h。利用RT-PCR技術分析各實驗組RhoA、Rac1、CDC42和PAK1表達的改變。結果：RT-PCR分析顯示：P組與C組相比RhoA的表達明顯增高（P<0.01），RAC1、PAK1表達明顯降低（P<0.01），CDC42降低（P<0.05）；P+Y組與P組相比RhoA的表達明顯降低（P<0.01），CDC42表達明顯升高（P<0.01），RAC1、PAK1的表達增高，但無統計學差異；P+Y組與Y組相比RhoA的表達明顯升高（P<0.01），RA