3水環境中人口標記物可替寧含量的測定液相色譜-串聯質譜法本標準規定了水環境樣品中可替寧的測定方法。本標準適用于水環境樣品中可替寧含量的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成文本必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T603化學試劑試驗方法中所用制劑及制品的制備GB/T6041質譜分析方法通則GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法HJ/T91.1污水監測技術規范3定義3.1水環境waterenvironment水環境是指自然界中水的形成、分布和轉化所處空間的環境，是指圍繞人群空間及可直接或間接影響人類生活和發展的水體，其正常功能的各種自然因素和有關的社會因素的總體。本文件中的水環境指的是生活污水、工業廢水和自然水體（地表水和地下水）。3.2人口標記物populationmarker人口標記物是經過人類身體代謝產生和排出體外的物質，在污水流行病學中，它能夠用于服務人口數的估算。4方法原理參見DB43/TXXXX-2021。5試劑和材料5.1試劑5.1.1通用要求除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑和實驗一級用水。本標準中所用試劑和溶液的配制，在未注明規格和配制方法時，均應按GB/T603之規定。45.1.2可替寧標準溶液(ρ=1mg/ml）：可用標準物質配制或直接購買有證標準溶液。5.1.3可替寧標準儲備溶液(ρ=10mg/L）：將可替寧的標準溶液用甲醇稀釋，配制成濃度為10mg/L的標準儲備溶液。于0~4℃避光、密封保存，使用時應恢復至室溫，并搖勻。5.1.4可替寧氘代內標標準溶液(ρ=0.1mg/ml）：可用標準物質配制或直接購買有證標準溶液。5.1.5可替寧氘代內標儲備溶液(ρ=1mg/L）：將可替寧的氘代內標標準溶液用甲醇稀釋，配制成濃度為1mg/L的氘代內標儲備溶液，于0~4℃避光、密封保存，使用時應恢復至室溫，并搖勻。5.1.6可替寧氘代內標使用液①(ρ=400μg/L）將可替寧氘代內標儲備溶液用甲醇稀釋，配制成濃度為40μg/L的氘代內標使用液，于0~4℃避光、密封保存，使用時應恢復至室溫，并搖勻。5.1.7可替寧氘代內標使用液②（4μg/L）：將4μg/L氘代內標儲備溶液用甲醇稀釋，配制成濃度為4μg/L的氘代內標使用液，于0~4℃避光、密封保存，使用時應恢復至室溫，并搖勻。5.1.8甲醇：質譜級5.1.9乙腈：質譜級5.1.10濃鹽酸：優級純5.1.11甲酸：質譜級5.1.125%氨水甲醇溶液：將濃氨水與甲醇（5.1.8）以5:95的體積比混勻。5.1.1310%甲醇溶液：將甲醇（5.1.8）與水以1:9的體積比混勻。5.1.140.1%甲酸水溶液：將甲酸（5.1.11）和水以1:999的體積比混勻。5.1.15磷酸鹽緩沖溶液：稱取3.024g磷酸二氫鉀和4.053g磷酸氫二鉀，到20ml水中，混勻，0~4℃保存。5.1.165%甲醇溶液：將甲醇（5.1.8）與水以5:95的體積比混勻。5.1.17甲酸-甲醇溶液：將500ml甲醇（5.1.8）5.1.18異丙醇+乙腈（1+1）：將異丙醇和乙腈（5.1.9）以1:1的體積比混勻。5.1.19氮氣：純度≥99.99%。5.2材料5.2.1色譜柱：C18反相高效液相色譜柱3.0mm×150mm,2.7μm或其他等效柱。5.2.2固相萃取柱：離線方法固相萃取柱參考型號為WatersMCX3cc/60mg，在線方法的參考型號為OasisHLBDirectConnectHP（2.1mmI.D.×30mmL.,20μm）。5.2.3水系濾膜：0.45μm或0.22μm。5.2.4有機系濾膜：0.22μm。6儀器和設備6.1真空抽濾裝置6.2固相萃取裝置6.3氮吹濃縮或者真空離心濃縮裝置6.4液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀57分析步驟7.1樣品前處理7.1.1離線固相萃取法將待測樣品恢復至室溫，充分混勻，加入濃鹽酸調節pH至小于2。使用水系濾膜過濾，移取濾液50ml，加入100μL混合氘代內標使用液①（5.1.6），混勻后進行固相萃取，固相萃取參數見下表1，萃取完成后將洗脫液置于濃縮裝置中40℃濃縮至盡干，用10%甲醇溶液（5.1.13）200uL復溶，過0.22μm有機濾膜，待測。以實驗用水為空白樣品，空白樣品與樣品同時、同步驟處理。表1固相萃取條件參數序號步驟溶劑體積(ml)流速(ml/min)1活化432活化水433上樣/5014淋洗425洗脫5%氨水甲醇427.1.2在線固相萃取法將待測樣品恢復至室溫，充分混勻，加入濃鹽酸調節pH至小于2。過水系濾膜，移取10ml過濾后水樣，加入0.5ml磷酸緩沖鹽（5.1.15），混勻，準確移取0.9ml混勻水樣，加入4μg/L的可替寧氘代內標溶液（5.1.7）100μL，混勻后經0.22μm有機濾膜過濾，置于樣品瓶中，待測。以實驗用水為空白樣品，空白樣品與樣品同時、同步驟處理。7.2儀器檢測參考條件7.2.1離線固相萃取法儀器參考條件a)柱溫：40℃;b)流動相A相：0.1%甲酸水溶液；c)流動相B相：乙腈；d)流速：0.4ml/min；e)進樣量：5μL；f)洗脫：梯度洗脫，梯度洗脫條件見表2；g)掃描方式：正離子掃描；h)檢測方式：多重反應監測；i)可替寧及其氘代內標的定性、定量離子對和碰撞能量條件見表3。6表2離線固相萃取法梯度洗脫條件時間（min）流動相A（%）流動相B（%）0.0095.05.02.0095.05.03.0085.06.0045.055.07.0085.085.00.00.0表3可替寧及其氘代內標的定性、定量離子對和碰撞能量條件序號母離子（m/z）子離子（m/z）碰撞能(V)1可替寧80.12898.1242可替寧-D380.14020注：對于不同的質譜儀器，參數可能存在差異，測定前應將質譜參數優化至最佳。7.2.2在線固相萃取法儀器參考條件a)柱溫：40℃;b)流動相A相：0.1%甲酸水溶液；c)流動相B相：乙腈；d)流速：0.4ml/min；e)洗脫：梯度洗脫，梯度洗脫條件見表4；f)進樣量：400μL；g)在線固相萃取條件，萃取液A：水；萃取液B：5%甲醇溶液；萃取液C：甲酸-甲醇溶液；萃取液D：異丙醇+乙腈（1+1）；在線固相萃取程序見表5；h)掃描方式：正離子掃描；i)檢測方式：多重反應監測；j)可替寧及其氘代內標的定性、定量離子對和碰撞能量條件見表2。表4在線固相萃取法梯度洗脫條件時間（min）流動相A（%）流動相B（%）0.0095.05.05.0095.05.06.0085.09.0045.055.085.085.00.020.000.07表5在線固相萃取程序時間（min）萃取液A（%）萃取液B（%）萃取液C（%）萃取液D（%）流速（ml/min）0.010.00.00.03.02.800.00.00.03.02.840.00.00.03.02.850.00.00.02.05.000.00.00.02.05.010.00.00.02.00.00.00.02.00.00.00.02.00.00.00.02.00.00.00.00.520.000.00.00.00.57.2.3儀器調諧按照儀器使用說明書在規定時間和頻次內對液相色譜-三重四級桿串聯質譜儀進行儀器質量數和靈敏度校正，以確保儀器處于最佳測試條件。7.2.4標準曲線建立取與樣品等量的實驗用水，添加可替寧標準儲備溶液（5.1.3使得可替寧的濃度為1ng/L、5ng/L、10ng/L、50ng/L、100ng/L、500ng/L、1000ng/L、2500ng/L、5000ng/L，作為標準曲線添加樣品，與樣品平行操作，得到標準曲線溶液，按儀器條件進樣分析，記錄保留時間和峰面積，建立標準曲線。7.2.5試樣和空白測定試樣和空白樣品按照與繪制標準曲線相同的儀器分析條件進行測定。8結果計算與表示8.1計算含量記錄標準曲線和樣品中目標物與相應氘代內標的保留時間和定量離子對峰面積值，以標準曲線中目標物與相應氘代內標的定量離子對峰面積比為縱坐標、標準曲線中目標物的含量為橫坐標進行線性回歸，得到線性方程。根據樣品中目標物及相應內標的定量離子對峰面積值，按公式（1）計算出樣品中目標物的含量。pi=(Y-a)/b