2發酵液的預處理和固液分離

Chapter2Pretreatmentandsolid-liquidseparationofbroth

2.1發酵液的預處理2.2發酵液的固液分離2.3細胞破碎待處理雜質的影響金屬離子粘稠物蛋白質2.1.1.1發酵液雜質的去除1.無機離子的去除(首先考慮：離子交換法)Ca2+Mg2+Fe2+草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀（注意回收草酸）

；三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡合物；4Fe3++3K4Fe(CN)6→Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+

黃血鹽，→普魯士藍沉淀Fe3+赤血鹽，→滕氏藍沉淀3Fe2++2K3Fe(CN)6→Fe3[Fe(CN)6]2↓+6K+

2.蛋白質的去除（1）Savage去除蛋白質（蛋白質處于兩相之間）正丁醇：氯仿=1：4（5）該法條件溫和，可避免多糖的降解，但除蛋白質效率低。（2）三氯乙酸去除蛋白質向多糖溶液加入1/5體積10%的三氯乙酸溶液磁力攪拌30

min，離心去除沉淀。缺點是易引起某些多糖的降解。在280nm出測定光吸收值（3）蛋白質酶去除蛋白質

2.1.1.2改善培養液的性能（1）加熱法除去某些熱敏性雜蛋白，降低黏度，有利過濾（如糖液熱過濾）。取決于產品的熱穩定性、能耗。一般加熱65-80℃。（2）調節pH值（3）凝聚和絮凝凝聚：中和電荷，通常細菌的表面都帶有負電荷工業上常用陽離子型。無機鹽類：Al2(SO4)3，KAl(SO4)2?18H2O,Fe2(SO4)3，FeSO4，ZnSO4,AlCl3,ZnCl2金屬氫氧化物或氧化物：

Fe(OH)3,Al(OH)3,Ca(OH)2；CaO等高價金屬。

絮凝絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對分子質量可高達數萬至一千萬以上，長鏈狀結構，其鏈節上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子（如—COOH）或陽離子（如—NH2）基團以及不帶電荷的非離子型基團。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。絮凝劑種類陰離子型陽離子型非離子型聚丙烯酸鈉（無毒，食品醫藥可用）和聚苯乙烯磺酸聚丙烯酸二烷基胺乙酯和聚二丙基四胺鹽聚氧化乙烯聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（PAM）是目前工業應用最廣泛的高分子絮凝劑之一。陰、陽、兩性、非離子型：分別用陰、陽、非離子單體和丙烯酰胺共聚而成的線形離分子聚合物。優點：種類多，用量少，ppm級，絮凝體粗大，效果好，速度快。缺點：聚丙烯酰胺本身無毒，但是其單體有毒。

特別是陽離子型，食品醫藥謹用。食品和醫藥工業常用絮凝劑陰離子型：聚丙烯酸鈉（無毒，食品醫藥可用）和聚苯乙烯磺酸；無機高分子聚合物絮凝劑：聚合鋁鹽、聚合鐵鹽；天然有機高分子絮凝劑：丹寧，明膠，殼聚糖。聚合氯化鐵2.1.2

發酵液的固液分離

重力沉降浮選雙水相萃取微孔過濾：固液相分離不完全，濃縮液中

70-80%水（常規過濾固相含水30-40%）工業上常用過濾離心2.1.2.1

過濾

（1）影響過濾速度的因素菌種發酵條件真菌細菌放線菌菌種對過濾的影響

：菌絲粗，易過濾，不需特殊處理，可用真空轉筒過濾機。如青霉菌的菌絲直徑可達10μm。：菌絲細而分支，交織成網絡狀，過濾困難，一般須預處理。鏈霉素菌絲：0.5-1.0μm。（抗生素約70%是放線菌產生）：菌體更細小，過濾十分困難，如不用絮凝等方法預處理，很難用過濾和分離法操作。0.5~5μm真菌放線菌細菌過濾助劑過濾助劑可解決兩個問題濾餅的可壓縮性問題小粒子如菌絲碎片和細菌細胞，會滲入到轉鼓真空過濾預覆蓋層內部，堵塞部分孔。常用的過濾助劑

硅藻土、珍珠巖、活性白土助濾劑兩種加入方法預先鋪一層助濾劑(1~2mm)助濾劑用量等于懸浮液中固體含量（2）過濾設備板框過濾機真空轉鼓過濾機加壓葉濾機帶式過濾機袋式過濾機板框過濾機板框過濾機優點板框壓濾機的過濾面積大；過濾推動力(壓力差)能較大幅度地進行調整，并能耐受較高的壓力差；結構簡單，價格低；動力消耗少等優點。缺點不能連續操作，設備笨重，勞動強度大；衛生條件差；非生產的輔助時間長，阻礙了過濾效率的提高。真空轉鼓過濾機優點：能連續操作，能實現自動化控制缺點：壓差較小，主要適用于霉菌發酵液的過濾。帶式壓濾機PBF系列連續水平真空帶式過濾機

緊湊帶式過濾機加壓葉濾機（立式）適合于固體含量少于0.1%2.1.2.2離心優點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好，操作時衛生條件好；缺點：設備投資高、能耗大。項目低速離心機高速離心機超離心機轉速（r/min)2000-600010000-2600030000-12000離心力（g）2000-70008000-800000100000-600000細胞

細胞核

細胞器

蛋白質

表2.3離心機的種類和適用范圍離心力計算離心轉速r=5000

r/min，半徑R=30

cm，離心力？gZg=8385gZ=1.118×10-5×(r)2×R超離心法

分為：差速離心，區帶離心。差速離心(differentialcentrifugation)

主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。區帶離心（Zonalcentrifugation）

密度梯度制作：先調配不同濃度（密度）的蔗糖溶液，然后在離心管中以濃度從大到小層層加入即可。將一定濃度的蔗糖溶液經一定時間的高速離心后可制成連續的蔗糖密度梯度。CsCl和NaBr在離心力的作用下可自動形成密度梯度。三足式離心機碟片式離心機管式離心機2.2細胞破碎

胞內產物：胞內酶（青霉素酰化酶，堿性磷酸酯酶），脂類，甾族化合物（萃取法提取），遺傳工程菌生產的蛋白質及某些抗生素。圖2.8真核細胞結構示意圖細胞壁葉綠體高爾基體線粒體核糖體內質網核細胞膜2.2.1細胞的結構動物、植物和微生物細胞的結構相差很大。生物細胞

類型G+細菌G-細菌酵母菌霉菌植物細胞組成肽聚糖(40-90%)多糖胞壁酸蛋白質脂多糖(1-4%)肽聚糖(5-10%)脂蛋白脂多糖(11-22%)磷脂蛋白質葡聚糖(30-40%)甘露聚糖(30%)蛋白質(6-8%)脂類(8.5-13.5%)多聚糖(幾丁質)(80-90%)脂類蛋白質初生壁次生壁（纖維素，半纖維素，木質素）圖2.9細胞破碎機理2.2.3細胞破碎技術2.2.3.1機械破碎高壓勻漿器球磨機超聲波破碎非機械方法：輔助方法2.2.3.2化學和生物化學滲透（1）酸堿處理；（2）化學試劑處理；（3）酶溶2.2.3.3物理滲透法（1）滲透壓沖擊；（2）凍結-融化法工業上常用實驗室常用2.2.3.1機械破碎（1）高壓勻漿法細胞懸浮液細胞勻漿液碰撞環圖2.11高壓勻漿器結構簡圖閥閥座破碎原理：細胞懸浮液在高壓作用下從閥座與閥之間的環隙高速（可達450m/s)噴出后撞擊到碰撞環上，細胞在受到高速撞擊作用后，急劇釋放到低壓環境，從而在撞擊力和剪切力等綜合作用下破碎。操作壓力通常為50-70MPa。團狀或絲狀真菌：堵塞較小的革蘭氏陽性菌：太小含有包含體的基因工程菌：太堅硬不宜采用高壓勻漿法的細胞類型（2）球磨法球磨機研磨是常用的一種方法，它將細胞懸浮液與玻璃小珠或氧化鋯一起快速攪拌或研磨，使達到細胞的某種程度破碎。這些裝置的主要缺點是在破碎期間樣品溫度迅速升高，通過用二氧化碳來冷卻容器可得到部分解決。微珠填充率是細胞的80-85%，微珠與目標細胞的直徑比30-100之間。細胞懸浮液微珠冷卻劑冷卻劑細胞勻漿液攪拌槳液珠分離器圖2.13珠磨機結構簡圖玻璃珠氧化鋯實驗室規模的細胞破碎設備有Mickle高速組織搗碎機、Braun勻漿器；中試規模的細胞破碎可采用膠體磨處理；在工業規模中，可采用高速珠磨機（瑞士WAB公司和德國西門子機械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法適用于細胞懸浮液和植物細胞的大規模處理。膠體磨德國進口珠磨機（立式）高速組織搗碎機

細胞的破碎是由于超聲波的空穴作用，從而產生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質中的懸浮細胞上造成了剪切應力，促使細胞內液體發生流動，從而使細胞破碎。

特點

超聲波破碎法是很強烈的破碎方法，適用于多數微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細菌比G+細菌易破碎，對酵母菌的效果較差。該法在實驗室小規模細胞破碎中常用。（3）超聲波法超聲波破碎儀2.2.3.2化學和生物化學滲透酸堿處理可以使蛋白質水解，細胞溶解或使某些組分從細胞內滲漏出來。化學試劑處理

表面活性劑：十二烷基磺酸鈉（SDS)，TritonX-100,十四烷基胺鹽(CTAB);

螯合劑：乙二胺四乙酸（EDTA），與金屬離子結合，如陰性菌外層Mg2+、Ca2+處理的方法;

有機溶劑:如苯、甲苯、丁醇、丙酮、氯仿及尿素。這些試劑容易引起生化物質破壞，還會帶來分離和回收化學物質的問題。酶溶法

利用酶反應，分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而達到破壁的目的。優點：專一性強，發生酶解的條件溫和。缺點：酶水解費用較貴，一般只適用于小規模的實驗室研究。

（1）細菌：溶菌酶lysozyme

革蘭氏陽性菌：溶菌酶革蘭氏陰性菌：溶菌酶+EDTA（破壞脂多糖）（2）酵母：Zymolyase，葡聚糖酶或甘露糖酶（3）植物細胞壁：纖維素酶可將化學法與機械法結合起來。溶菌酶、多糖水解酶預處理面包酵母，然后高壓勻漿法處理6次，破碎率95%以上。另一種酶解方法，溶胞酶是由微生物本身產生的。影響自溶過程的因素有溫度、時間、pH緩沖液濃度、細胞代謝途徑等。例

酵母45~50℃，保溫20小時。

谷氨酸菌：加0.028MNa2CO3和0.018MNaOH，pH10，3%懸浮液，加熱至70℃，保溫攪拌20min，自溶。特點自溶法在一定程度上能用于工業規模，但是，對不穩定的微生物容易引起所需蛋白質的變性，自溶后的細胞培養液過濾速度也會降低。自溶作用干燥法熱空氣干燥：適用于酵母，25-35℃熱空氣吹干后的酵母有部分自溶，然后用水、緩沖溶液或其它溶劑抽提。真空干燥：適用于細菌。冷凍干燥：適用于不穩定的生化物質，將冷凍干燥后的菌體在冷凍條件下磨成粉，然后用緩沖溶液抽提。一般配成10-40%的菌懸液進行冷凍干燥，經凍干后的細胞滲透性能大大變化，便于抽提。2.2.3.3物理滲透法（1）滲透壓沖擊（Osmoticshock）是較溫和的一種破碎方法，將細胞放在高滲透壓的介質中(如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)，達到平衡后，介質被突然稀釋，或者將細胞轉入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入細胞內，引起細胞壁的破裂。特點滲透壓沖擊的方法僅對細胞壁較脆弱的菌，或者細胞壁預先用酶處理，或合成受抑制而強度減弱時才是合適的。如：動物細胞，革蘭氏陰性菌。（2）凍結-融化法（反復凍融法）

將細胞放在低溫下突然冷凍和室溫下融化，反復多次而達到破壁作用。冰凍使膜的疏水鍵結構（雙脂質和蛋白質組成）裂開，增加了細胞親水性，另外胞內冰粒是細胞溶脹。

特點對于細胞壁較脆弱的菌體，可采用此法。但通常破碎率很低，即使反復循環多次也不能提高收率。另外，還可能引起對凍融敏感的某些蛋白質的變性。分類適應性機械法高壓勻漿法可達較高破碎率，可大規模操作，不適合絲狀菌、革蘭氏陽性菌和含包含體的遺傳工程菌球磨法可達較高破碎率，可較大規模操作，大分子目的產物易失活，適用于所有微生物破碎超聲波法對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，僅適用于實驗室操作，不適合大規模操作非機械法化學