一例對水產性基因復合致不良反應的基因診斷

中國的許多聽力損失家庭希望通過重新出生有健康聽力的后代。但經歷了生育及培養聾兒的艱辛之后,這些家庭對于再生育往往充滿了憂慮與恐懼,耳聾發生的原因以及如何判斷后代的聽力狀態是他們最為關注的問題,他們迫切地需要準確的診斷技術及專業的指導。研究表明,至少50%的先天性耳聾由遺傳性因素導致,即遺傳性耳聾。非綜合征性耳聾(nonsyndromichearingimpairment,NSHI)占遺傳性耳聾的70%,約77%的NSHI為常染色體隱性遺傳方式。在已確定與NSHI相關的基因中,GJB2基因(gapjunctionproteinbeta-2gene,GJB2gene)、SLC26A4基因(SLC26A4gene或PDSgene)和線粒體基因(mtDNA)的病理性突變導致了大部分的遺傳性耳聾[3~9],所占比例分別約為21%、14.5%和3.8%。因此,通過耳聾基因檢測可以為我國近40%的聾人明確遺傳學診斷,并為耳聾產前診斷的實踐提供科學的理論依據。本研究通過對一耳聾家庭進行產前診斷的系統實踐,總結出耳聾產前診斷的具體內容、流程及意義,報道如下。1對象和方法1.1目標家庭中的先證者為男性,2歲,先天性耳聾;父母均為聽力正常者,雙方家族均無此類似病史。1.2銀耳基因檢測1.2.1對先證者進行詳盡的體格檢查、聽力學及影像學(顳骨CT)檢查。1.2.2采集先證者及其父母的外周血各5ml,組織DNA提取、GJB2、SLC26A4基因全序列檢測方法詳見文獻,mtDNAA1555G的檢測應用解放軍總醫院聾病分子診斷中心與威海澳麥爾基因科技有限公司合作研制的mtDNAA1555G突變檢測試劑盒[制劑文號:總聯制字(2005)FP31020]。此家庭在接受檢測之前,簽署了耳聾基因檢測知情同意書。.1.2.3明確先證者及其父母的基因型后,向此家庭提供詳盡的耳聾遺傳信息。1.2.4母親懷孕后自愿行耳聾產前診斷,在簽署耳聾產前診斷知情同意書后,于妊娠10周行產前診斷取材:超聲引導下羊絨毛膜取樣。1.2.5產前診斷取材后,提取胎兒組織DNA。羊絨毛膜提取DNA方法如下:①提取絨毛組織少許直接放入1.5ml離心管用眼科手術剪剪碎;②每管加入SET300μl,10%SDS30μl,PK(蛋白酶K)15μl,50℃過夜(16h以內);③加飽和NaCl100μl混合,離心6000轉15min,取上清液移入另一離心管;④加飽和酚500μl混合,離心6000轉15min,取水相移入另一離心管;⑤加飽和酚250μl,氯仿240μl,異戊醇10μl混合,離心6000轉15min,取水相移入另一離心管;⑥氯仿480μl,異戊醇20μl混合,離心6000轉15min,取水相移入另一離心管;⑦加冷無水乙醇800μl混合,離心10000轉2min,倒掉上清液,風干,加100μl超純水凍存;⑧SET:取1MNaCl20ml,1MTris·cl2ml,0.5MEDTA200μl,加水至200ml;(9)PK濃度:10mg/ml。1.2.6胎兒組織DNA提取后,檢測相應位點即父母與先證者所確定的突變位點,判斷胎兒的基因型,根據檢測結果向父母提供遺傳信息及生育指導。2蝌蚪骨ct檢測2.1先證者雙耳為極重度感音神經性聾,聽性腦干反應(auditorybrainstemresponse,ABR)顯示雙耳100dBnHL均未引出反應;40Hz聽覺相關電位(40Hzauditoryevent-relatedpotential,40HzAERP)顯示雙耳1kHz100dBnHL;顳骨CT(ComputedTomography)顯示顳骨發育無異常;全身檢查無其他系統異常。2.2常見耳聾基因檢測結果見圖1:先證者為GJB2235delC/512insAACG復合雜合突變,父親為GJB2512insAACG雜合突變,母親為GJB2235delC雜合突變,均為攜帶者。檢測結果提示先證者為GJB2復合突變引起的常染色體隱性遺傳耳聾,父母均為攜帶者,再生育風險為25%,在懷孕早期可行羊絨毛膜檢測幫助判斷胎兒的突變基因攜帶狀況。2.3產前診斷結果見圖1,胎兒為GJB2235delC雜合突變,即僅攜帶一個母系突變,結果提示:胎兒與先證者的基因型不同,理論上不會發生與先證者相同的聽力狀態,胎兒出現耳聾的風險等同于正常出生人群。父親:GJB2512insAACG(hetero)母親:GJB2235delC(hetero)2.4隨訪結果:胎兒已出生,女孩,2個月時新生兒聽力篩查證實聽力正常。3銀耳產前診斷流程耳聾產前診斷是應用耳聾基因檢測技術了解胎兒攜帶耳聾基因的情況,從而做出是否為遺傳性耳聾的診斷。由于線粒體耳聾其肯定的母系遺傳規律,只做預測,無須產前診斷,只要告知線粒體致聾突變攜帶者家庭的母系后代終生絕對禁止使用氨基糖甙類抗生素,就可以在家庭內避免絕大部分藥物性耳聾的發生。因此,目前耳聾產前診斷的對象為常染色體隱性遺傳的GJB2與SLC26A4耳聾家庭。通過對這一耳聾家庭進行產前診斷的具體實踐,耳聾產前診斷流程總結如下:門診就醫行相關檢查,包括常規查體、聽力學檢查及顳骨CT,根據檢查結果,給予初步遺傳咨詢與指導;簽署知情同意書,對先證者行耳聾基因檢測;根據檢測結果,確定先證者相關耳聾基因的診斷;確定先證者為遺傳性耳聾后,對其父母行耳聾基因檢測確定基因型以驗證先證者的突變基因分別來自父母;再次行遺傳咨詢與指導;簽署產前診斷知情同意書,母親懷孕后根據妊娠期不同階段采取相應的胎兒組織:妊娠早期(約9~12周)羊絨毛膜取樣,妊娠中期(約16~20周)羊水取樣,妊娠晚期(約22~37周)臍帶血取樣;對胎兒行相關耳聾基因的診斷;根據診斷結果進行遺傳學生育指導。若常見耳聾基因檢測為陰性,那么由常見耳聾基因突變導致耳聾的可能性大大降低,由環境因素導致耳聾的幾率增高;若常見耳聾基因檢測為陽性,特別是確定為GJB2和SLC26A4基因突變導致的耳聾時,由于其為常染色體隱性遺傳,多數情況下其父母再生育聾兒的風險為25%(因為我國絕大多數耳聾家庭父母為聽力正常者),再次懷孕時可進行胎兒的產前診斷,胎兒有75%的可能會僅攜帶一條或不攜帶突變的等位基因,預測其不會重復第一個聾兒的聽力結構,胎兒有25%的風險將會與第一個聾兒的基因型相同,理論上提示其出生后將患遺傳性耳聾,應盡早進行選擇。耳聾產前診斷目的的真正體現以及整個流程的良好實施,依賴以下幾個條件:①嚴格執行知情同意的原則,整個流程符合相關規范;②耳聾產前診斷最好是確定了先證者相關的聾病基因,進行詳盡的遺傳咨詢后,再決定是否受孕和接受產前診斷;③產前診斷取材最好是在孕早期實施,若在懷孕中/晚期取材,當家庭得到陽性結果