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替米沙坦片在健康男性人體的藥物動力學(xué)研究

替米薩坦是血管緊張素受體ag1的抗劑。它可以選擇性地防止各種組織(腎臟、血管平滑肌和腎上腺)中的血管緊張素與at1受體結(jié)合,防止血管緊張素引起的血管收縮和血液中的乙醛醇分泌。其優(yōu)點(diǎn)是不抑制ACE,不影響對緩激肽的反應(yīng),也不與其他激素受體和離子通道結(jié)合或產(chǎn)生阻斷作用,從而減少了咳嗽等副作用,臨床上主要用于原發(fā)性高血壓的治療。替米沙坦片原由德國BoehringerIngelheim公司開發(fā),1999年初在美國和德國上市,以后陸續(xù)在歐洲其他國家上市,商品名為“美卡素”,目前我國已有進(jìn)口替米沙坦片。為研究北京柏雅方舟醫(yī)藥科技有限公司和天津裕龍藥業(yè)有限公司共同研發(fā)的替米沙坦片的生物等效性,我們參照文獻(xiàn)建立測定血漿中替米沙坦?jié)舛鹊母咝б合嗌V法,分析18名健康男性志愿者分別口服國產(chǎn)片和進(jìn)口片后血藥濃度,比較兩種片劑的生物利用度,并對國產(chǎn)替米沙坦片進(jìn)行生物等效性評價(jià)。1試驗(yàn)藥品與藥品高效液相色譜儀(惠普Agilent1100,配G1321A熒光檢測器、G1313A自動進(jìn)樣器、G1311A自動調(diào)配泵、G1316A可調(diào)柱溫恒溫箱和自動脫氣機(jī),Agilent色譜化學(xué)工作站),旋渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠),電子分析天平(瑞士SARTORIUS),高速離心機(jī)(美國MICRO12-24),真空干燥箱(德國MMM-GROUP);試驗(yàn)制劑:替米沙坦片(北京柏雅方舟醫(yī)藥科技有限公司和天津裕龍藥業(yè)有限公司研發(fā),20mg/片,批號:20041206),參比制劑:美卡素(德國BoehringerIngelheim公司,40mg/片,批號:107567)。對照品:替米沙坦對照品(北京柏雅方舟醫(yī)藥科技有限公司和天津裕龍藥業(yè)有限公司研發(fā),批號:040511,含量>99.5%),內(nèi)標(biāo)物:扎來普隆(北京德眾萬全藥物技術(shù)開發(fā)公司,批號:010902,含量>99.6%),乙腈(色譜純,Dikma),水為三蒸水,其余試劑均為分析純。2方法和結(jié)果2.1常規(guī)治療及生化檢查健康男性志愿者18人,年齡20~28歲,身高168~175cm,體重57~70kg。所有受試者試驗(yàn)前、試驗(yàn)后均進(jìn)行常規(guī)體檢和血液生化檢查。試驗(yàn)前受試者心、肝、腎功能均未見異常。試驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審議通過,志愿者試驗(yàn)前簽署知情同意書,受試者在試驗(yàn)前2周和試驗(yàn)期間停服任何藥物,并禁煙和酒。2.2多次給藥間隔時(shí)間受試者于試驗(yàn)日的前一天晚上開始禁食12h,第二天早晨7:30空腹開始試驗(yàn)。采用自身對照、隨機(jī)(按照隨機(jī)表數(shù)字)交叉的方法,分別一次性口服受試藥片(T)80mg,或參照片(R)80mg,250ml溫開水送服,服藥4h后給予統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。前后兩次給藥間隔時(shí)間為2w。服藥前和服藥后0.25,0.5,0.75,1,1.5,2,3,4,6,8,12,24,36,48,60,72h分別于前臂靜脈取血5ml,立即加入含肝素抗凝試管中,輕輕混勻,3000r·min-1離心5min,分離血漿貯存于-30℃冰箱待測。2.3緩沖液及色譜條件色譜柱:Dikma鉆石柱(250mm×4.6mm,5μm);流動相:乙腈-0.03mol·L-1NH4AC緩沖液=45:55;激發(fā)波長:300nm,發(fā)射波長:380nm;流速:0.8ml·min-1;柱溫:25℃。在該色譜條件下替米沙坦和扎來普隆的保留時(shí)間分別約為6.3min和8.9min。HPLC圖譜見圖1。2.4乙酸乙酯法取300μl血漿至10ml磨口玻璃離心管中,加入40μl濃度為0.3mg·L-1扎來普隆乙腈溶液,搖勻,再加入3ml乙酸乙酯,振蕩1min,3000r·min-1離心10min,取上清液至5ml磨口玻璃離心管中,50℃真空干燥至干,300μl乙腈溶解殘?jiān)?取上清夜30μl進(jìn)樣。2.5樣品處理方法取系列濃度的替米沙坦對照品溶液20μl分別加入0.3ml空白血漿中,使血藥濃度相當(dāng)于1,2,5,10,50,100,250,500μg·L-1,每一濃度點(diǎn)為5個(gè)樣本,以下操作同“樣品處理方法”。以替米沙坦對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y),替米沙坦對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,得線性方程:Y=0.0976X+0.0293,r=0.9999,線性范圍:1~500μg·L-1,最低定量濃度為1μg·L-1。2.6回收率及樣品測定取健康人空白血漿0.3ml數(shù)份,分別加入內(nèi)標(biāo)、替米沙坦對照品溶液,使血漿中替米沙坦?jié)舛确謩e為2,100,500μg·ml-1,每一濃度配制5份樣品。將血樣按“2.5”項(xiàng)下方法處理后作HPLC分析,記錄峰面積,將所得的藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值R代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程,計(jì)算方法回收率。另取低、中、高3個(gè)濃度的替米沙坦對照品溶液,用甲醇稀釋后,直接進(jìn)樣并記錄峰面積,以此為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算提取回收率。取上述各濃度血漿樣品,在1d內(nèi)重復(fù)5次和分散于2w內(nèi)重復(fù)5次測定其濃度,計(jì)算日內(nèi)、日間誤差及相對回收率。結(jié)果見表1。2.7不同凍融條件下樣品穩(wěn)定性按“2.5”方法分別配制低(2μg·L-1)、中(100μg·L-1)、高(500μg·L-1)濃度樣品,分別在室溫條件(室溫6h、室溫12h、室溫24h),凍融條件(凍融1次、2次、3次),長期凍存條件(6d、12d、24d)下進(jìn)行色譜測定,結(jié)果濃度RSD均小于6%,表明樣品穩(wěn)定。2.8質(zhì)控樣品的制備按“2.5”方法配制100μg·L-1濃度的36個(gè)血漿樣品置零下20℃凍存?zhèn)溆?此即為質(zhì)控樣品。每天檢測血樣品前須先檢測質(zhì)控樣品,如果相對回收率均在85%~115%內(nèi)時(shí),即可認(rèn)為儀器檢測正常,否則須檢查整個(gè)操作過程以及儀器原因。2.9實(shí)測值和實(shí)測值所有數(shù)據(jù)均用表示。血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用3P97藥物動力學(xué)程序進(jìn)行房室模型擬合并計(jì)算藥物動力學(xué)參數(shù),達(dá)峰時(shí)間(tmax)和達(dá)峰濃度(Cmax)采用實(shí)測值,藥時(shí)曲線下面積(AUC)采用梯形方法計(jì)算實(shí)測值(AUC0-T和AUC0~∞,其中AUC0~∞用CT/ke計(jì)算)。所得藥物動力學(xué)參數(shù)均采用配對t檢驗(yàn)進(jìn)行參比藥與供試藥之間的比較,其中AUC0~T和AUC0-∞相對生物利用度(F)采用下式計(jì)算:2.10藥動學(xué)和生物等效性18例受試者中,試驗(yàn)期間有2例在服藥時(shí)出現(xiàn)一過性疲乏,但很快消失,未見其他不良反應(yīng),試驗(yàn)結(jié)束后復(fù)查心肝腎功能均正常。2.11血藥濃度-時(shí)間曲線和藥物動力學(xué)參數(shù)18例健康志愿者單次口服2種替米沙坦片劑后的藥時(shí)曲線見圖2。18例健康志愿者單次口服2種替米沙坦制劑后的血藥濃度數(shù)據(jù)經(jīng)3P97程序擬合符合二室開放模型。藥物動力學(xué)參數(shù)和相對生物利用度結(jié)果見表2。2.12生物等效性比較單次口服替米沙坦片80mg供試片與參比片后,主要藥動學(xué)參數(shù)(AUC0-72,AUC0-∞,Cmax,tmax,t1/2,AUC0~∞)在兩制劑間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),AUC0-∞,Cmax的90%可信區(qū)間分別為(0.92,1.13),(0.90~1.10),均在等效范圍內(nèi)。結(jié)果見表功,表明兩制劑具有生物等效性。3替米沙坦片藥物提取的安全性評價(jià)替米沙坦的生物樣本分析方法主要有LC-MS、放免和高效液相色譜法。本實(shí)驗(yàn)考慮到替米沙坦分子結(jié)構(gòu),選用熒光色譜法。試驗(yàn)中選用乙腈-水作為流動相,考察了加入不同濃度和pH的緩沖鹽對色譜峰的影響。當(dāng)選用pH低于5.0的磷酸鹽緩沖液時(shí),保留時(shí)間太短,色譜峰前傾;當(dāng)選用pH高于6.0的磷酸鹽緩沖液時(shí),保留時(shí)間又太長,柱效低,色譜峰拖尾。最后確定乙腈:0.03mol·L-1NH4AC緩沖液=45:55作為流動相,替米沙坦保留時(shí)間適當(dāng),并且峰對稱性良好。本實(shí)驗(yàn)曾嘗試用奎硫平、曲唑酮、利培酮等藥物作內(nèi)標(biāo)物,或因提取率低,或出峰時(shí)間不理想,或峰型差,而未成功,當(dāng)改用扎來普隆時(shí),扎來普隆在乙酸乙酯中的提取率高,在該系統(tǒng)中檢測靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定,不與替米沙坦發(fā)生相互作用,逐選用扎來普隆作為內(nèi)標(biāo)物。本實(shí)驗(yàn)用乙酸乙酯做為提取劑,用乙腈定容進(jìn)行色譜分析,僅取300μl血漿就達(dá)到了試驗(yàn)要求,最低定量濃度為1μg·L-1。由于取樣量少且僅用3ml提取劑就可滿足提取,提取回收率達(dá)90%以上。根據(jù)本研究的結(jié)果,供試藥和參比藥比較,tmax,Cmax,AUC0~24,AUC0~∞經(jīng)多因素方差分析無顯著性差異(P>0.05),說明國產(chǎn)替米沙坦片與德國BoehringerIngelheim藥廠生產(chǎn)的美卡素80mg生物等效,按實(shí)測值A(chǔ)UC0~24計(jì)算,供試藥替米沙坦片的相對生物利用度為(112.20±25.87)%。試驗(yàn)過程中,有2例受試者服藥后出現(xiàn)一過性疲乏,是否由藥物引起,還有待進(jìn)一步研究。替米沙坦體內(nèi)藥時(shí)曲線的個(gè)體差異,可能與其通過母體化合物與葡糖苷酸結(jié)合,主

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