放線桿菌治療豬胸膜肺炎的研究

豬感染的所得稅性肺炎是由放射免疫感染引起的重要呼吸道疾病。這種疾病幾乎覆蓋了所有豬州，死亡率很高，平均日增重，飼料轉化率降低，屠宰損失和干預成本增加。這是國際上公認的破壞現代養豬業的五大疾病之一，這給不同國家的養豬業帶來了巨大的經濟損失。臨床在爆發豬傳染性胸膜肺炎或因換圈、合圈導致爆發此病風險增加時期都應給予有效的抗生素。泰樂菌素是大環內酯類畜禽專用抗生素,對豬支原體病、胸膜肺炎放線桿菌病及豬弧菌性痢疾有較好的療效,并且有顯著的促生長作用。試驗在體外藥敏試驗的基礎上,采用氣管接種Ⅰ型胸膜肺炎放線桿菌建立了豬傳染性胸膜肺炎的人工感染模型,并評價泰樂菌素注射液對其的療效。1材料表面1.1特效藥市售泰樂菌素注射液,10mL∶0.5g。1.2放線桿菌疫苗健康長白×大白二元雜交仔豬,8周齡,體重15kg左右,未曾接種豬胸膜肺炎放線桿菌疫苗。隨機選取5頭進行鼻黏膜采樣和胸膜肺炎放線桿菌分離,并用ELASA試劑盒檢測所有試驗豬的抗體水平,選擇健康、傳染性胸膜肺炎抗體陰性的豬用于試驗。1.3基本日糧參照家畜營養需求標準配制不含任何抗菌藥物的飼料作為各試驗組日糧。1.4血清自由基免疫胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)培養基,121℃高壓滅菌20min,使用前加入8%新生小牛血清(56℃滅能30min)和100μg/mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)。1.5培養背景的制備血清Ⅰ型胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP),菌號為259,購自中國獸醫藥品監察所。將凍干菌種開啟后接種于TSB培養基中,于37℃、200r/min搖床培養12h,涂片、鏡檢、純化,接種TSA培養基,置37℃溫箱中培養16h后取出,置4℃冰箱中保存,備用。攻毒前挑取1~2環接種至TSB培養基中,37℃培養7h后用生理鹽水稀釋,平皿計數,根據計數結果決定用菌量。1.6藥物貯存液分別配制酒石酸泰樂菌素、延胡索酸泰妙菌素、替米考星、氟苯尼考、鹽酸多西環素、恩諾沙星、鹽酸沃尼妙林等藥物貯存液,濃度均為5120μg/mL。2方法2.1最小抑菌濃度測定結果參考美國臨床和實驗室標準化研究所(CLSI)批準的抗菌藥物敏感試驗的執行標準,培養基為MH肉湯加入5%的新生牛血清和100μg/mLNAD,用肉湯微量稀釋法測定上述抗菌藥對APP的最小抑菌濃度。2.2臨床治療和效果觀察2.2.1不攻毒、不給藥將30頭試驗豬隨機分為3組,每組10頭:健康對照組不攻毒、不給藥;感染對照組只攻毒、不給藥;藥物治療組在攻毒后使用泰樂菌素治療,劑量為按體重10mg/kg。2.2.2豬氣管接種量選擇藥物治療組和感染對照組用豬胸膜肺炎放線桿菌菌液進行人工感染,每頭豬的氣管接種量為按體重8×107cfu/kg。健康對照組每頭豬經氣管接種等量的生理鹽水。接種后隨時觀察,當豬體溫升高1~1.5℃時開始給藥,治療組豬只肌注泰樂菌素注射液,每天2次,連用4d。2.2.3剖檢觀察與檢測各試驗組的豬隔離飼養(條件相同),分別于試驗開始和試驗結束時稱量每頭豬的體重。人工感染后2,4,6,8,12,24小時時測量直腸體溫,以后每隔12h測量1次,并觀察豬只的呼吸、食欲、精神狀態等臨床表現。記錄各組豬的發病數及死亡數,對死豬及試驗結束時所有存活豬進行剖檢,取肺臟、肝臟、腎臟、脾臟、心臟涂APP瓊脂平皿培養基,37℃培養12h,檢查是否有細菌生長。對檢出的細菌觀察菌落形態,挑取典型菌落進行涂片、鏡檢及PCR擴增,以檢查是否為豬胸膜肺炎放線桿菌。2.3結果評價指標2.3.1放線桿菌感染死亡鑒定出現典型的豬傳染性胸膜肺炎臨床癥狀,尸體剖檢有典型病變特征,取肝臟、腎臟、脾臟、心臟可分離到胸膜肺炎放線桿菌,即判定為感染死亡。死亡豬頭數占試驗豬頭數的百分比即為病死率。2.3.2主、對照組均屬治療用藥組臨床癥狀消失,精神、食欲、體溫、呼吸等恢復正常,增重接近或超過健康對照組的均屬治愈。各組豬治愈頭數占試驗頭數的百分比即為治愈率。2.3.3療效判定標準試驗豬人工感染后未出現臨床癥狀或出現臨床癥狀,但耐過或隨著用藥時間的延長癥狀減輕直至恢復而未死亡的則判定為有效。試驗結束后每組豬存活頭數占試驗頭數的比例即為有效率。2.3.4復興率計算試驗開始和結束時每組豬的平均體重,設定健康對照組豬的增重率為100%,計算其他各組豬的相對增重率。2.4數據分析和處理根據試驗結果用計算機統計軟件(SPSS16.0)計算各組豬病死率、治愈率、有效率和相對增重率之間的差異顯著性。3結果3.1血清型養殖菌株mic的變化經藥敏試驗,酒石酸泰樂菌素、延胡索酸泰妙菌素、替米考星、氟苯尼考、鹽酸多西環素、恩諾沙星、頭孢噻呋鈉、鹽酸沃尼妙林對血清Ⅰ型胸膜肺炎放線桿菌的MIC值分別為16,4,1,0.5,0.5,0.0156,0.0078,2μg/mL。3.2剖檢及分離試驗結果各組豬氣管注射胸膜肺炎放線桿菌后的平均體溫變化見圖1。泰樂菌素治療組在60~144h體溫顯著低于感染對照組(P<0.05),且趨于正常體溫;156~168h體溫稍有回升,但未見明顯發燒狀況,相繼觀察數天,每頭豬的食欲、精神狀態、呼吸等均恢復正常。攻毒后約3小時,感染對照組有9頭豬開始出現精神輕度沉郁和呼吸急促等癥狀,直腸溫度升高0.5~1.5℃;6h后,7頭豬的呼吸更加急促,開始出現明顯的腹式呼吸,體溫升高1.5~2.2℃,最高體溫達41.9℃,食欲減退甚至廢絕,呼吸困難,站立不穩,呈犬坐姿勢,張口呼吸,最后死亡。病死豬通常于口腔和鼻孔流出大量的血色分泌物。經尸體剖檢可見胸腔積有深紅色血樣液體,心包積液,心臟肥大;肺臟暗紅色、充血、腫大、質脆易碎、切面不整,流出大量血色液體;氣管和支氣管內充滿帶血色的黏液性泡沫樣滲出物;脾臟有不同程度的腫大、壞死,X光顯示肺部有不同程度的實變區;心臟腫大,與剖檢癥狀相符;病程稍長的豬主要表現為雙側或一側肺臟出現硬實的肺炎區,肺炎病灶多呈化膿性病灶,肺臟表面有白色纖維素性滲出物甚至與胸腔黏連,有的胸腔內有大量黃色膠胨樣物質;肝臟略腫大,表面有壞死點。脾臟、肝臟呈暗紅色,病理切片顯示肺臟有嚴重的出血和水腫,腎臟、脾臟有不同程度的出血。本試驗最急性感染的豬死亡多發生在24~36h,在攻毒后24,36,48小時時分別有2,2,1頭豬死亡,另有1頭豬在攻毒后4天死亡。取所有病死豬的肺臟、肝臟、心臟、腎臟、脾臟等接種TSA培養基可分離到大量胸膜肺炎放線桿菌。試驗結束時感染對照組尚有4頭豬存活:2頭豬轉為慢性胸膜肺炎,表現食欲減退,被毛雜亂、無光澤,增重減慢,驅趕后咳嗽等,剖檢能分離到胸膜肺炎放線桿菌;2頭自愈,其臨床表現與健康對照組豬相似。泰樂菌素治療組豬經剖檢后有1頭能分離到胸膜肺炎放線桿菌。各組試驗結果見表1。泰樂菌素治療組的治愈率和相對增重率均極顯著高于感染對照組(P<0.01),病死率極顯著低于感染對照組(P<0.01)。4豬面膜肺炎感染臨床資料藥敏試驗結果表明,酒石酸泰樂菌素對胸膜肺炎放線桿菌血清Ⅰ型的MIC為16μg/mL。據曹繼軍等報道,泰樂菌素對豬肺炎支原體、鏈球菌分離株、豬大腸桿菌分離株、金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌分離株、大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌C44103、禽巴氏桿菌分離株的MIC值分別為0.5,64,256,2,16,32,128,128μg/mL。本試驗中,對胸膜肺炎放線桿菌最為敏感的是頭孢噻呋和恩諾沙星,較為敏感的是氟苯尼考、多西環素、替米考星等,最后是鹽酸沃尼妙林、延胡素酸泰妙菌素和酒石酸泰樂菌素。泰樂菌素對支原體最為敏感,其次對金黃色葡萄球菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌較敏感。試驗采用氣管接種Ⅰ型胸膜肺炎放線桿菌成功地建立了豬胸膜肺炎的人工感染模型。與感染對照組相比,泰樂菌素治療組臨床癥狀有很大程度的改善,雖有1頭還處于帶菌狀態,但大大降低了病死率,發病豬的咳嗽、呼吸困難等癥狀得到了緩解,精神狀態、食欲恢復正常。從圖1和表1可以看出,在用5%泰樂菌素注射液治療豬傳染性胸膜性肺炎時能起到有效的治療作用,推薦給藥劑量為按體重10mg/kg,2次/d,連續治療不少于4d。大環內酯類抗生素一般的藥動學特征是血漿中藥物濃度低,但表觀分布容積較大,在許多組織中蓄積并持久存在,比如在肺組織中藥物濃度是血漿中的60倍。有資料顯示,大環內酯類血漿藥物濃度的傳統藥動學參數不能很好地運用于肺部感染或由兼性細胞內病原體感染的治療。如替米考星在豬或牛體內的血漿藥物濃度遠遠低于一般呼吸道病原菌的MIC值。然而,大量研究表明,替米考星對治療這些病原菌引起的呼吸道疾病是有效的。單劑量(10mg/kg)皮下注射替米考星72h后,肺組織中的藥物濃度仍高于溶血性不動桿菌的MIC值(3.15μg/mL)。馬單劑量(10mg/kg)肌肉注射,各樣點平均峰濃度分別為血液中性粒細胞(66.01±15.97)μg/mL、支氣管肺泡灌洗細胞(20.1±5.1)μg/mL、肺上皮細胞襯液(2.91±1.15)μg/mL、肺組織(1.90±0.65)μg/mL和血漿(0.19±0.09)μg/mL,平均消除半衰期分別為47.9h、62.2h、73.3h、193.3h、18.4h。豬肌肉注射泰樂菌素0.25小時達最高血藥濃度616ng/mL,而給藥后12,24小時肺組織中藥物濃度分別