高效液相色譜-串聯質譜法測定血漿中青蒿素的藥動學研究

青艾酒是中國科學家在20世紀70年代發明的一種新結構的抗癲癇藥物。自上市以來，這種藥物在世界上挽救了數億只瘧疾患者的生命。它被稱為抗癲癇藥物發展史上的第三個里程碑，它被稱為奎寧和氯仿后的第三個里程碑。青蒿素的發現,是中國科學家為人類拯救生命做出的重要貢獻。由于這類藥物與以往的抗瘧藥結構和作用機制完全不同,速效又安全,且與現有藥物均無交叉抗藥性,幾十年來青蒿素類抗瘧藥一直是WHO關注的重點。青蒿素類藥物由于化學結構的特殊性,一直沒有理想的檢測方法,為此,本研究建立了人體內青蒿素濃度的液相色譜-串聯質譜(LC-MS-MS)的分析法,并將其用于中國健康志愿者體內的藥代動力學研究。藥品、試劑與儀器1藥品、試劑與儀器青蒿素片,規格:每片250mg,批號:20051021-1,由昆明制藥集團股份有限公司提供;青蒿素標準品,含量:99.0%,批號:100202-200402,中國生物制品藥品檢定所提供;內標:替米沙坦,含量:99.5%,批號:020801,北京致至醫藥科技發展有限公司提供。Q-TrapTM三重四極桿串聯質譜儀,配有離子噴霧離子源以及Analyst1.3.2數據處理系統,美國AppliedBiosystem公司產品;1100高效液相色譜輸液泵,美國Agilent公司產品。2入院前未服用其他藥物2.1受試者選擇健康男性受試者10人,年齡:(34.3±3.16)歲,身高:(1.67±0.06)m,體質量:(61.2±6.11)kg。試驗前經全面體檢,肝、腎功能、血、尿常規、心電圖、血清學檢查均正常。半月內未服用任何藥物,3個月內未參加過其他藥物試驗者。試驗前簽署書面知情同意書。2.2分組、給藥與服本研究為單劑開放試驗設計,試驗方案經中國人民解放軍307醫院倫理委員會批準。受試者藥前禁食10h,給藥劑量為1000mg(4片),溫開水250mL1次口服;給藥2h后方可飲水,4h后統一進低脂膳食。于給藥前(0h)、給藥后15、30、45min及1、1.5、2、3、4、6、8、12、18、24h,在肘靜脈取血5mL,置肝素試管中,3000r·min-1離心10min,分離血漿,于-20℃保存備用。3質譜條件和檢測方法3.1分析條件色譜ZorbaxextendC18色譜柱(4.6mm×150mm,5μm,美國Agilent公司);流動相:甲醇-10mmol·L-1乙酸銨(80∶20);流量:1.2mL·min-1(分流體積比1∶1);柱溫:40℃;進樣量:10μL。質譜離子源:離子噴霧離子化源;離子噴射電壓:5500V;溫度:450℃;源內氣體1(GS1,N2),壓力:448.18kPa;氣體2(GS2,N2),壓力:448.18kPa;氣簾氣體(N2)壓力:137.90kPa;正離子方式檢測;掃描方式為多重反應監測(MRM);碰撞氣(N2)設置為Medium;青蒿素和內標替米沙坦的解簇電壓(DP)分別為100、90V;碰撞能量(CE)分別為11、60eV;用于定量分析的離子反應分別為m/z283.3→m/z209.1和m/z515.20→m/z276.10。3.2在混合中添加乙烯-二氯甲烷固相液5.取血漿樣品100μL置具塞試管中,加入內標溶液100μL(40μg·L-1替米沙坦),補加甲醇-水(50∶50)混合溶液100μL,混勻;加入乙醚-二氯甲烷(60∶40),渦流混合1min,往復振蕩10min(每分240次),離心5min(15000r·min-1);取上層有機相于另一試管中,25℃氮氣流下吹干,殘留物加入流動相150μL立即溶解,渦流混合,進樣10μL進行LC-MS-MS分析。4標準曲線范圍4.1標準曲線制備在健康人空白血漿中,加入內標100μL及不同量的標準系列溶液100mL,使青蒿素濃度分別為4、10、30、100、300和1000μg·L-1。按樣品處理與測定方法進行測定,待測物與內標物的峰面積比值為縱坐標,用加權(W=1/x2)最小二乘法進行回歸運算,得回歸方程:Y=7.81×10-4X+1.21×10-3,γ=0.9990。根據標準曲線,本方法的線性范圍為4~1000μg·L-1;最低定量限為4μg·L-1。4.2準確度和精密度在空白人血漿中,加入不同量的標準系列溶液100mL,制備青蒿素低、中、高3個濃度(10、100、800μg·L-1)的質量控制(QC)樣品,每濃度6樣本,連續測定3天,根據當日的工作曲線,計算QC樣品的測得濃度,根據QC樣品結果,計算本法的準確度與精密度。血樣中,低、中、高日內變異分別為8.21%、4.07%、7.16%;日間變異分別為6.49%、4.58%、9.91%。方法學相對回收率分別為(93.3±9.81)%、(86.1±5.29)%、(89.2±3.50)%。4.3血漿青蒿素濃度檢測依據“標準曲線”項下方法,制備穩定性QC樣品,每一濃度測定3樣本,經反復3次,于-20℃冰凍,室溫溶解后,測定樣品濃度。凍融后,測定血漿青蒿素濃度分別為(9.69±0.71)、(107.67±3.51)和(787.33±83.03)μg·L-1。所有凍融試驗測定值與標示濃度的相對偏差(RE%)均<15%。4.4青蒿素和內標替米沙坦標準溶液的配制取空白血漿100mL,按“樣品處理”項操作,得色譜圖1A;將一定濃度的青蒿素和內標替米沙坦標準溶液加入空白血漿中,同法操作,得色譜圖1B;取受試者給藥后收集的血漿樣品,同法操作,得色譜圖1C。結果表明,空白血漿中的內源性物質不干擾青蒿素和內標替米沙坦的測定。5auc0-的測量以梯形面積法計算AUC0-tn;Cmax、tmax為實測值。AUC0-∞=AUC0-tn+Ctn/ke;其他藥代動力學參數采用中國藥理學會數學藥理委員會編制的3P97藥代動力學程序軟件計算。結果1血藥濃度-時間曲線10名受試者空腹口服青蒿素片1000mg的平均血藥濃度-時間曲線,見圖2。2藥房動態參數按統計處理方案,計算每個受試者的藥代動力學參數,10名受試者空腹口服青蒿素片1000mg的平均藥代動力學參數,見下表。質譜條件分析青蒿素類藥物的化學結構中,缺少可利用的功能基團,本身只有紫外末端吸收,如用紫外吸收光譜法測定,結果不穩定。國外報道,主要采用高效液相n=10,mean±SD色譜法結合電化學檢測器,在裝置上要求比較嚴格。液相色譜-質譜聯用技術,是20世紀70年代發展起來的將液相色譜分離技術與質譜檢測手段結合。本實驗建立了簡單、快速、高靈敏度的高效液相色譜-串聯質譜檢測青蒿素的方法,并進行了人體內藥代動力學的研究,該方法的標準曲線、最低定量限、精密度、準確度及穩定性均達到生物樣品測定的要