微生物在農藥污染治理中的應用

中國是農業和畜牧業的主要國家之一。每年使用的農藥量為50.60萬噸。這種植物包括草屑素、殺菌劑、殺菌劑和其他農業化學品。農藥的利用效率很低,其中約80%的農藥直接進入環境。由于長期、大量和不合理的使用,農藥在發揮其保障作物產量巨大功效的同時,也對環境造成了污染,嚴重影響食品安全和人們的身體健康。在農藥污染治理方面,微生物因其種類豐富、分布廣泛、適應性強和代謝途徑多樣的特點逐漸顯現出自身的優勢。圍繞著農藥降解性微生物資源、代謝機制及農藥殘留污染修復,本課題組進行了大量的研究工作,形成系統的農藥殘留微生物修復技術體系,獲得國家科學技術進步獎二等獎(2005-J-201-2-03-D01)。在南京農業大學110周年校慶之際,筆者將近10年來在農藥殘留微生物降解方面的工作進行綜述以志紀念。1降解性微生物資源高效降解性微生物是農藥殘留微生物修復技術的核心,獲得有用的農藥微生物降解資源在農藥污染治理方面顯得格外重要。由于農藥的種類繁多,而微生物的降解一般具有特異性,因此需要針對不同的農藥品種進行降解性微生物的分離篩選。近10年來,本實驗室圍繞農業生產中常用的除草劑、殺蟲劑、殺菌劑及其他有機污染物,篩選獲得大量的降解性微生物資源(表1),并建立較為全面的降解性微生物菌種資源庫。從降解的目標化合物的角度分析,有機磷殺蟲劑、菊酯類殺蟲劑、磺酰脲類除草劑、對硝基苯酚降解菌資源較為豐富(圖1)。從降解性微生物的分類地位看,在這些降解菌中,Pseudomonassp.占到了高達30%的比例,Sphingomonassp.和Paracoccussp.被分離到的機會也較多(圖2)。大量的高效降解性微生物資源為污染物的微生物代謝機制研究及污染土壤的微生物修復提供了重要的菌種資源。在降解性微生物資源的分離過程中獲得了多株微生物的新菌種,如FlavobacteriumhaoraniiLQY-7、SphingobiumwenxiniaeJZ-1、SphingobiumfaniaeJZ-2、Rhodococcusjialingiaedjl-6-2、LysobacterruisheniiCTN-1、SphingobiumqiguoniiX23,分別用我國著名的微生物學家及土壤學家簡浩然、陳文新、樊慶笙、王家玲、焦瑞身和趙其國的名字進行了命名。這些新微生物資源的分離為探索微生物多樣性提供了重要的材料。2降解酶基因檢測在微生物降解農藥的代謝途徑中一般有多種降解酶的參與,對編碼這些降解酶的基因進行克隆分析可以幫助闡明微生物對農藥的代謝機制。本課題組從多株降解性微生物中克隆到一系列的降解酶基因,包括甲基對硫磷水解酶基因mpd、磺酰脲類除草劑水解酯酶基因sulE、六六六降解基因簇lin、酰胺類除草劑水解酶基因ampA、菊酯類農藥水解酶基因pytH及對硝基苯酚降解基因簇pnp。在降解酶基因克隆過程中,發展了一種新的染色體步移方法SEFAPCR(self-formedadaptorPCR),可以高效地克隆目標序列兩側的未知序列。2.1水生動物聯絡導導的pcr擴增在克隆降解酶編碼基因的過程中,常常需要對菌株進行適當的遺傳操作,從保守或已知序列進行染色體步移是經常采用的方法。Self-formedadaptorPCR(SEFAPCR)是Wang等建立的由已知序列擴增未知序列的一種PCR技術。SEFAPCR是基因組步行PCR設計思想的延伸,集連接介導PCR的高特異性和TAILPCR技術的簡單性于一身。SEFAPCR在擴增中總共用到了4條引物。Sp1、Sp2和Sp4是根據已知序列設計的特異性高退火(如70℃)的引物。Sp3是一條能夠與已知序列部分退火配對的特殊引物,是整個SEFAPCR的關鍵所在。采用SEFAPCR成功地擴增了多種植物、真菌、細菌已知序列的側翼序列,特別是該PCR擴增過程具有較高的特異性,且擴增的目的條帶比較長。管莉菠等利用該方法成功地克隆出了PseudomonasputidaGM6菌株的多聚磷酸鹽激酶基因ppk,并對該基因的表達情況進行了研究。李娜等和何健等分別以總DNA為模板,利用該PCR方法克隆了靈芝鯊烯合酶基因的啟動子序列和中度嗜鹽菌Halomonassp.BYS-1四氫嘧啶合成基因(ectABC)及其上游序列。由于基因組步移技術在遺傳操作中的重要性,因此SEFAPCR在側翼序列克隆領域將會得到更加廣泛的利用。2.2pnp基因序列分析崔中利等分離到了1株甲基對硫磷降解菌Plesiomonassp.M6,該菌具有有機磷水解酶活性,可水解甲基對硫磷產生對硝基苯酚(p-nitrophenol,PNP),這與Rani等研究的甲基對硫磷降解途徑一致,但M6卻不能將對硝基苯酚進一步降解。通過鳥槍法從菌株M6基因組文庫中篩選到該水解酶基因,并將其命名為mpd。該基因與已報道的編碼甲基對硫磷水解酶的基因opd完全不同,序列比對結果也表明,mpd基因序列與opd基因無同源性。PseudomonasputidaDLL-E4可以進一步降解甲基對硫磷分解產生的PNP。Shen等通過SEFAPCR擴增DLL-E41,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶(PnpC)基因的側翼序列,獲得12kb的DNA片段。序列分析發現該片段中含有10個參與對硝基苯酚代謝的開放閱讀框架(圖3),并將其命名為pnp基因簇。在該基因簇中,pnpA編碼的是一個依賴FAD和NADH的單組分對硝基苯酚4-單加氧酶PnpA,在NADH和FAD存在的情況下,將對硝基苯酚轉化為對苯醌(p-benzoquinone)。pnpC編碼的是1,2,4-苯三酚1,2-雙加氧酶,可將1,2,4-苯三酚轉化為馬來酰乙酸。pnpC1C2編碼的PnpC1C2是對苯二酚(HQ)雙加氧酶(PnpC1C2)多組分蛋白復合體,催化對苯二酚生成4-羥基黏糠酸半醛。pnpR是lysR家族調節基因,在pnp基因簇中,pnpR是一個參與對苯二酚降解的正向調控子。劉衛東對1,2,4-苯三酚(BT)1,2-雙加氧酶(PnpC)的晶體結構進行了深入研究。發現PnpC由6個較長α螺旋和7個β折疊及轉角組成。氨基酸截短試驗說明,PnpCN端起始的3個α螺旋區對PnpC的酶活力是必需的。2.3不同結構的創新基因磺酰脲類除草劑是一類超高效除草劑,使用量低,但其殘留造成的危害較為嚴重。Hang等研究了HansschlegeliazhihuaiaeS113對磺酰脲類除草劑的降解,發現這一家族的除草劑可以通過去酯化轉化成無除草活性的相應的酸,這與Lu等的研究結果一致,并從S113中克隆到了1個與磺酰脲類除草劑去酯化代謝有關的酯酶基因sulE。通過對SulE基因測序及其表達蛋白SulE氨基酸序列分析發現,該基因含有1194個堿基,G+C摩爾分數為51.09%,編碼398個氨基酸。SulE含有信號肽序列,切割位點在第37位的Ala和第38位的Glu之間,SulE是一個同源二聚體,每個亞基相對分子質量為41×103,等電點(pI)為8.3。SulE含有α/β水解酶的保守結構域,屬于α/β水解酶超家族。SulE具有α/β水解酶家族蛋白典型三聯體催化活性位點SerHis-Glu(Ser245、His369和Glu28);但是在催化位點的Ser周圍沒有該家族特征序列(Gly-X1-Ser-X2-Gly);因此,初步確定SulE是α/β水解酶家族的一個新成員。氯乙酰胺類除草劑是目前除草劑中用量排行第3的除草劑,其主力品種包括乙草胺、丁草胺等,其微生物降解也受到關注。Paracoccus屬的微生物對酰胺類除草劑具有較好的降解能力。Zhang等從Paracoccussp.FLN-7中克隆到1個編碼酰胺水解酶的基因ampA。AmpA可以水解酰胺類除草劑敵稗,并可以作用于多種酰胺類化合物及含酰胺鍵的有機磷農藥。該酶的氨基酸序列與已知酰胺酶的一致性較低(小于22%),但其活性中心的結構卻與其他酰胺酶一樣是保守的(Ser154-Ser178-Lys79)。AmpA結構特性及其廣泛的底物范圍使得它在轉基因抗除草劑植物育種方面具有巨大的應用潛力。2.4lin2結構及功能基因的擴增馬愛芝等從長期受六六六污染的土壤中分離得到1株能以HCH為唯一碳源的高效降解菌株Sphingomonassp.BHC-A。BHC-A菌株在12h以內能夠完全礦化質量濃度均為5mg·L-1的α-、β-、γ-、δ-HCH4種異構體,特別是對β-HCH的降解在國際上也屬少例。Wu等以菌株Sphingomonassp.BHC-A為材料,通過Tn5轉座子插入突變法,篩選到1株完全喪失β-HCH降解功能的菌株。通過構建BHC-A45的基因組文庫,篩選到1株含有Tn5轉座子序列的陽性克隆,對陽性克隆的轉座子側翼進行測序,發現了1個鹵代烷烴脫鹵酶基因linB2。與S.paucimobilisUT26脫鹵酶LinB一樣,LinB2可將β-HCH轉化為β-2,3,4,5,6-五氯環己醇(β-PCHL),不同的是,LinB2還可將β-PCHL繼續降解為β-2,3,5,6-四氯1,4-環己二醇(β-TDOL)。LinB是一個α/β水解酶家族中的氯代烷烴脫氯酶,與來源于XanthobacterautotrophicusGJ10的鹵代烷烴脫鹵酶(DhlA)、Moraxellasp.B的鹵代乙酸脫鹵酶(DehH1)及Pseudomonassp.CF600的2-羥基黏糠酸半醛水解酶(DmpD)具有顯著相似性。BLAST比對結果顯示,LinB2的氨基酸序列與S.japonicumUT26LinB具有97%的同源性。LinB2結構預測分析結果表明,在類似連接酶區域具有與LinB相同的催化位點(Asp-108、His-272和Glu-132);同時還發現,在LinB和LinB2的相同氨基酸位點處有7個氨基酸殘基不同。在LinB中為Ala-81、Ala-112、Ile-134、Ala-135、Ile-138、Ala-247和Met-253,而在LinB2中為Thr-81、Val-112、Val-134、Thr-135、Leu-138、His-247和Ile-253。通過對這7個氨基酸中的每個氨基酸進行定點突變分析,結果表明每個氨基酸的改變都會明顯減弱LinB2β-HCH和β-PCHL降解活性,氨基酸突變數目越多,減弱效果越明顯,而當這個7個氨基酸完全突變時,LinB2已經完全喪失了β-HCH和β-PCHL降解活性;因此,推測這7個氨基酸殘基差異可能是導致LinB無LinB2β-PCHL降解活性的原因。2.5ctn水降解氯酶Liang等從長期施用百菌清的土壤中分離到1株高效降解百菌清的Ochrobactrumsp.CTN-11,該菌可在無其他碳源的情況下,48h內可將50mg·L-1的百菌清完全降解。與以前報道的百菌清高效降解菌TB1相比,菌株CTN-11的降解效率明顯高于TB1。菌株TB1需在其他碳源存在的情況下,于120h內將30mg·L-1的百菌清完全降解。對菌株CTN-11來說,添加碳源可增強降解,但并不是降解所必需的。研究表明,菌株CTN-11可通過水解脫氯將CTN降解為對魚類和無脊椎動物微毒的羥基百菌清(CTN-OH),但CTN-OH卻不能被進一步降解。為了進一步研究CTN水解脫氯的代謝過程,Wang等分離到了另1個CTN降解菌Pseudomonassp.CTN-3,該菌株具有水解脫氯酶活性。從CTN-3中克隆到1個編碼CTN水解脫氯酶的基因chd,與目前報道的唯一一個水解脫氯酶(4-氯-輔酶A脫鹵酶)代謝途徑顯著不同。在厭氧和有氧條件下,該酶均可進行水解脫氯反應,并且不需要輔因子如輔酶A和ATP的存在。該研究為鹵化芳香族化合物水解脫鹵機制的研究提供了一個更好的脫氯酶。2.6擬除蟲菊酯農藥擬除蟲菊酯是一類重要的殺蟲劑,這一家族的農藥結構復雜,其微生物降解受到關注。Wang等分離到1株Sphingobiumsp.JZ-1菌株,JZ-1可以通過水解作用降解多種擬除蟲菊酯農藥。從JZ-1中克隆到1個羧酸酯酶基因pytH,該基因編碼1個相對分子質量31×103的菊酯水解羧酸酯酶(PytH),與已發現的菊酯水解酶沒有任何同源性,與α/β折疊水解酶家族的同源性為20%左右,顯示PytH是一個新的農藥水解酶。3污染物降解中中間代謝產物的檢測微生物通過一系列的生理生化過程來分解農藥等污染物,通過中間代謝產物的分析可以重構微生物的降解代謝途徑。現代儀器分析手段的引入,如GC-MS、LC-MS以及核磁共振等技術,可以有效地檢測污染物降解過程中的中間代謝產物。目前,很多降解微生物的代謝途徑已被發現,微生物降解轉化數據庫(biocatalyst/biotransformationdatabase,UM-BBD)收錄了超過200種污染物的降解代謝途徑。我們在已知降解微生物代謝途徑的基礎上分別對氯乙酰胺類除草劑、菊酯殺蟲劑、百菌清殺菌劑的降解代謝途徑做了一系列深入的研究,使人們更加詳細地了解微生物對農藥的降解并為農藥的環境修復提供了基礎。3.1氯乙酰胺類從碳源生長規律分析氯乙酰胺類除草劑是酰胺類除草劑的重要成員,Zhang等從水稻土中分離到1株氯乙酰胺類除草劑高效降解菌Paracoccussp.FLY-8。菌株FLY-8可降解并利用6種氯乙酰胺類除草劑作為碳源進行生長,降解率從大到小依次為甲草胺、乙草胺、異丙草胺、丁草胺、丙草胺、異丙甲草胺。分析了氯乙酰胺類除草劑的分子結構對降解率的影響,發現側鏈烷基越長,降解效率越低。在FLY-8降解過程中檢測到了甲草胺、2-氯-N-(2,6-二乙基苯基)乙酰胺及2,6-二乙基苯胺等中間代謝產物。由于FLY-8能夠利用苯胺進行生長,推測丁草胺是通過圖4中的降解代謝途徑實現完全礦化。該研究為菌株FLY-8在氯乙酰胺類除草劑及含有該類除草劑環境的原位生物修復的使用提供了重要的潛在可能性。3.2-苯氧基苯甲醛和3-四甲基環丙酸酯Guo等從擬除蟲菊酯生產廢水的活性污泥中分離到1株廣譜的菊酯降解菌SphingobiumfaniaeJZ-2,可降解甲氰菊酯、氯氰菊酯、氯菊酯、氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和聯苯菊酯。菌株JZ-2具有菊酯水解酶活性,通過酯鍵斷裂降解甲氰菊酯,生成3-苯氧基苯甲醛和2,2,3,3-四甲基環丙酸(圖5)。3-苯氧基苯甲醛、3-苯氧基苯甲酸、原兒茶酸鈉和鄰苯二酚是甲氰菊酯降解的中間產物。3-苯氧基苯甲酸和鄰苯二酚通過鄰位裂解途徑被進一步氧化。3.3-pnpa和4-苯三酚的分離和代謝硝基酚類化合物是重要的環境污染物,其中的4-硝基苯酚(PNP)被列為優先控制污染物。根據PseudomonasputidaDLL-E4對硝基苯酚降解過程中關鍵酶的功能及代謝中間產物分析,我們建立了P.putida中硝基酚類化合物的代謝途徑。假單胞菌DLL-E4通過PNP-4-單加氧酶PnpA將PNP轉化為對苯二酚(HQ),在HQ雙加氧酶的作用下進行開環,并在一系列酶的作用下轉化成β-酮己二酸,進入到三羧酸循環(TCA)。DLL-E4可以PNP為唯一碳源進行生長,但不能降解其類似物4-硝基鄰苯二酚(4-NC)。當同時存在對硝基苯酚和4-硝基兒茶酚時,則二者均可以被利用。功能分析表明PnpA可以作用于PNP和4-NC,但4-NC單獨不能誘導PnpA的表達,因此菌不能利用4-NC為唯一碳源進行生長。4-NC轉化生成的1,2,4-苯三酚(BT)可以被PnpC開環,進入到HQ的代謝途徑中。通過對pnp基因簇功能驗證結合質譜分析,我們認為該基因簇編碼了2個硝基苯酚類化合物代謝途徑:PNP降解的對苯二酚途徑和4-NC降解的偏三苯酚途徑(圖6),不同于現在已報道的來源于其他微生物的PNP代謝途徑。4微生物殘留降解研究表明,農藥噴施到田間后,其殘留會造成嚴重的農田環境面源污染,造成農產品品質下降,進而影響人類的身體健康。生物修復是一種低成本的環境友好型面源污染修復技術。大量的研究結果顯示農藥降解菌在實驗室純培養條件下可以高效地降解化學農藥。因此,研究降解菌在田間條件下對農藥殘留的降解,可以為其在生物修復中的應用提供理論依據和實際指導。張瑞福等和蔣建東等以韭菜中的農藥為對象,研究了微生物降解技術在農藥殘留降解方面的重要作用。研究發現,施用高效農藥殘留降解菌劑能顯著降低韭菜中農藥殘留的含量;在一定范圍內,降解率隨著菌劑用量的增加而升高,同時控制降解菌使用時間不會對蟲害的防治產生不利的影響。Huang等將Pseudomonassp.IM-4接種至咪草煙處理過的滅菌土壤,與未接菌相比,咪草煙的降解率提高5倍;將IM-4接種至咪草煙處理過未滅菌土壤,與對照相比,咪草煙降解率提高3倍,并發現菌株IM-4可減緩咪草煙對玉米的毒害作用。這些研究為無公害農產品的生產提供了新的思路。施用到土壤中的降解性微生物與土著微生