中國(guó)強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良

1型患者的分子診斷研究成人最常見(jiàn)遺傳性神經(jīng)肌肉病隱襲起病，緩慢進(jìn)展死亡原因：呼衰、心律失常常顯遺傳臨床異質(zhì)性強(qiáng)，常合并多系統(tǒng)損害強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良1型(DM1)1/5004/100,0005/100,000LesscommonRare/absent0.46/100,000患病率地區(qū)、種族差異；平均8-12/100,000遺傳基礎(chǔ)(CTG)n序列異常擴(kuò)展DM1:50-400019q13.32動(dòng)態(tài)突變疾病正常:3-37DMPK基因3’非翻譯區(qū)臨床表現(xiàn)骨骼肌：肌強(qiáng)直，肌無(wú)力，肌萎縮心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)：心律失常晶狀體：白內(nèi)障內(nèi)分泌系統(tǒng)：胰島素抵抗，性腺功能減退中樞神經(jīng)系統(tǒng)：日間嗜睡，認(rèn)知障礙輕型DM1(mildDM1)經(jīng)典/成年發(fā)病型DM1(classical/adult-onsetDM1)DM1臨床分型青少年型DM1(juvenileDM1)先天型DM1(congenitalDM1)先天型DM1CTG重復(fù)數(shù)：730-4,300主要為母系遺傳出生前可有羊水過(guò)多和胎動(dòng)減少，出生發(fā)病或嬰兒期發(fā)病嚴(yán)重全身無(wú)力，肌張力低，呼吸困難，足畸形等，肌強(qiáng)直不明顯特征性倒‘V’字形上唇，稱(chēng)為帳篷或魚(yú)嘴樣上唇，主要由面肌無(wú)力引起較其它類(lèi)型重，死亡率高；新生兒期過(guò)后病情可逐漸改善，發(fā)展為成年型DM1；常伴智力低下、運(yùn)動(dòng)和語(yǔ)言發(fā)育遲緩、吞咽困難等青少年型DM1發(fā)病年齡較早突出表現(xiàn)：面肌無(wú)力常見(jiàn)，構(gòu)音障礙、手肌強(qiáng)直和智能發(fā)育遲緩易漏診：無(wú)明顯神經(jīng)系統(tǒng)異常及陽(yáng)性家族史經(jīng)典DM1CTG重復(fù)數(shù)：100-1000主要表現(xiàn)：成年起病，骨骼肌受累明顯（肌強(qiáng)直、肌無(wú)力和肌萎縮）骨骼肌受累多以遠(yuǎn)端為主多系統(tǒng)受累常見(jiàn)，其中白內(nèi)障發(fā)生率最高輕型DM1CTG重復(fù)數(shù)：50-150臨床表現(xiàn)輕微，僅輕度肌強(qiáng)直，肌無(wú)力、肌萎縮不明顯EMG可有肌源性損害部分檢出白內(nèi)障日間嗜睡可為主要表現(xiàn)DM1——三核苷酸重復(fù)疾病(TRD)Southernblot

TPPCRCTGPCRTRD動(dòng)態(tài)突變：長(zhǎng)度變異，即重復(fù)序列拷貝數(shù)增加，也叫多態(tài)性突變遺傳早現(xiàn)：后代患者CTG重復(fù)數(shù)更多，臨床表現(xiàn)更重，發(fā)病年齡更早大多數(shù)情況下，CTG重復(fù)數(shù)越小，臨床癥狀越輕，發(fā)病年齡越大CTG重復(fù)數(shù)體細(xì)胞變異CTG序列突變頻率高，易發(fā)生不穩(wěn)定重復(fù)重復(fù)數(shù)每年可增加50-80個(gè)組織差異性：肌肉、心臟、腎臟最高；血中最低體細(xì)胞崁合：CTG重復(fù)數(shù)在成年期增加CTG重復(fù)數(shù)重復(fù)序列狀態(tài)表型5-35（正常范圍）穩(wěn)定正常36-50（前突變）可能不穩(wěn)定無(wú)臨床表現(xiàn)51-150（致病突變）不穩(wěn)定輕型/經(jīng)典DM1>150（致病突變）不穩(wěn)定經(jīng)典/青少年型/先天型DM1CTG重復(fù)數(shù)與表型關(guān)系DM1——分子診斷的必要性臨床表現(xiàn)復(fù)雜，輕型、不典型或癥狀前者易漏診或誤診鑒別診斷、篩查無(wú)癥狀家屬正確分子診斷為研究發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)常用分子診斷方法PCR

&片段長(zhǎng)度分析SouthernblotTP-PCRSmall-poolPCRRNA-FISHPCR

&片段長(zhǎng)度分析CTG重復(fù)數(shù)達(dá)4000以上，GC含量高，僅用于重復(fù)數(shù)較小（50-100左右）者Southernblot前初篩PCR產(chǎn)物出現(xiàn)兩個(gè)正常電泳帶，可除外DM1僅一條正常電泳帶，需限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)全基因組DNA酶切后行Southernblot，發(fā)現(xiàn)超過(guò)正常范圍異常帶，確診DM1SouthernblotCTG重復(fù)數(shù)100以上，PCR無(wú)法可靠擴(kuò)增重復(fù)片段全基因組DNA，限制性?xún)?nèi)切酶酶切，探針行Southernblot常用限制性?xún)?nèi)切酶：EcoRⅠ,BamHⅠ,NcoⅠ,BglⅠ常用探針：pGB2.6,pMDY1,cDNA25,p5B1.4Southernblot&PCR檢測(cè)所有DM1突變，無(wú)假陽(yáng)性操作過(guò)程復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，一般實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展需大量基因組DNA目前國(guó)內(nèi)獲得商品化探針較難Smear：由于存在體細(xì)胞嵌合，全基因組DNA行Southernblot在電泳帶中往往出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，準(zhǔn)確計(jì)算CTG重復(fù)數(shù)困難Small-poolPCR基因組DNA稀釋?zhuān)鄠€(gè)小池完成三核苷酸重復(fù)序列擴(kuò)增PCR產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)Southernblot雜交檢測(cè)準(zhǔn)確定量重復(fù)片段長(zhǎng)度變異，適于研究DM1患者CTG重復(fù)序列不穩(wěn)定性和體細(xì)胞嵌合現(xiàn)象操作難度大，過(guò)程繁瑣，不適于常規(guī)基因診斷TripletRepeatPrimedPCR(TP-PCR)半定量檢測(cè)法引物：P1（帶5’熒光）、P2、P3、P4CTG和P4CAG反應(yīng)一：引物P1和P2，擴(kuò)增DMPK基因CTG重復(fù)序列區(qū)域，穩(wěn)定擴(kuò)增重復(fù)數(shù)100以下序列反應(yīng)二：引物P1，P3，P4，擴(kuò)增重復(fù)數(shù)100以上序列PCR產(chǎn)物：毛細(xì)管電泳，可視化分析反應(yīng)二原理擴(kuò)增反應(yīng)早期P4結(jié)合到大等位基因三核苷酸重復(fù)序列多個(gè)位點(diǎn)形成復(fù)合物P4耗盡后P3和復(fù)合物繼續(xù)擴(kuò)增，復(fù)合產(chǎn)物含5’熒光自動(dòng)激光熒光測(cè)序儀使最終產(chǎn)物可視化，判斷是否有超過(guò)正常范圍的CTG重復(fù)數(shù)RNA-Fish2006年EmanuelaBonifazi等報(bào)道用RNA-熒光原位雜交方法(RNA-Fish)對(duì)DM1進(jìn)行產(chǎn)前診斷對(duì)DM1母親絨膜絨毛取樣培養(yǎng)細(xì)胞行RNA-Fish檢測(cè)特征性細(xì)胞表型，細(xì)胞核出現(xiàn)含突變DMPK基因轉(zhuǎn)錄本的局灶性包涵體CTG重復(fù)數(shù)大于200時(shí)，RNA-Fish方法在滋養(yǎng)層細(xì)胞分裂間期核中可有效檢測(cè)到特異的包涵體國(guó)內(nèi)現(xiàn)狀較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)沒(méi)有建立DM1正確的分子診斷方法多限于病例報(bào)道，診斷也多局限于臨床、電生理和肌肉活檢2011年起，許多單位開(kāi)始應(yīng)用TP-PCR做DM1基因診斷實(shí)驗(yàn)對(duì)象

時(shí)間

2009年3月—2013年3月

來(lái)源64例臨床擬診DM1患者5名無(wú)癥狀親屬28名健康對(duì)照臨床診斷臨床表現(xiàn)：肌強(qiáng)直、肌無(wú)力、肌萎縮±多系統(tǒng)損害肌電圖：肌強(qiáng)直電位+肌源性損害基因診斷PCR&SouthernblotTP-PCR診斷方法TP-PCR提取外周血DNAPCR+Southernblotα-32p標(biāo)記探針地高辛標(biāo)記探針實(shí)驗(yàn)流程位置用途命名序列（5’→3’）ForwardPCR(DMPK)P1CCAGCTCCAGTCCTGTGATCReversePCR(DMPK)P2TGCACAAGAAAGCTTTGCACForwardProbeamplificationPro1TCACCCTACGTCTTTGCGACReverseProbeamplificationPro2ATCACAGGACTGGAGCTGGForwardTP-PCRp1-FAMAGAAAGAAATGGTCTGTGATCCCReverseTP-PCRp2GAACGGGGCTCGAAGGGTCCTTGTAGCCGUniversalTP-PCRp3RTACGCATCCCAGTTTGAGACGWithinTP-PCRp4CTGTACGCATCCGAGTTTGAGACGTGCTGCTGCTGCTGCT引物序列探針制備——DMPK基因限制性酶切位點(diǎn)圖指標(biāo)DM1患者(N=62)年齡(歲)36.32±13.14性別(男/女)35/27發(fā)病年齡(年)27.12±13.94病程(年)7.92±7.47陽(yáng)性家族史(%)37(59.68%)肌強(qiáng)直

(%)58(93.55%)肌力(檢查15塊肌肉,MRC量表)123.70±13.83肌萎縮(%)43(69.35%)肌酸激酶(IU/L)291.33±150.74白內(nèi)障

(%)44(70.97%)糖耐量異常或糖尿病

(%)10(16.13%)性腺功能異常

(%)34(54.84%)1°房室傳導(dǎo)阻滯(%)13(20.97%)62例基因診斷DM1患者資料62例臨床擬診DM1患者1名無(wú)癥狀親屬2名健康對(duì)照(純合子)一條正常等位基因條帶兩條正常等位基因條帶64例臨床擬診DM1患者5名無(wú)癥狀親屬28名健康對(duì)照PCR2例臨床擬診DM1患者4名無(wú)癥狀親屬26名健康對(duì)照PCR

&電泳產(chǎn)物測(cè)序31513正確診斷8例DM1患者，漏診3例

排除1例臨床擬診患者及其2名無(wú)癥狀親屬排除2名健康對(duì)照Southernblot12例臨床擬診DM1患者2名無(wú)癥狀親屬2名健康對(duì)照Southernblot

地高辛標(biāo)記探針Smear1,2,8擴(kuò)增條帶15漏診4,10,13TP-PCR可見(jiàn)異常擴(kuò)增峰(4,10,13)

α-32p標(biāo)記探針Smear23,24,25,26排除20,21,22漏診無(wú)TP-PCR無(wú)異常擴(kuò)增峰(20,21,22)61例臨床擬診DM1患者1名無(wú)癥狀親屬超過(guò)160個(gè)堿基處有三聯(lián)擴(kuò)增峰(stutter峰)超過(guò)160個(gè)堿基處無(wú)stutter峰64例臨床擬診DM1患者5名無(wú)癥狀親屬28名健康對(duì)照TP-PCR3例臨床擬診DM1患者4名無(wú)癥狀親屬28名健康對(duì)照2例經(jīng)PCR排除DM11例經(jīng)Southernblot排除DM1TP-PCR（陰性）（陽(yáng)性）Stutter峰Stutter峰小結(jié)61例臨床擬診DM1患者1名無(wú)癥狀親屬確診為DM1分子診斷TP-PCR診斷準(zhǔn)確率高，未發(fā)現(xiàn)假陰性3例經(jīng)分子診斷排除DM1的臨床擬診患者Southernblot漏診的3例患者，均經(jīng)TP-PCR確診為DM1漏診原因：探針敏感度DM2初篩陰性考慮為其他類(lèi)型強(qiáng)直性肌病DM1研究出發(fā)點(diǎn)臨床診斷正確率非100%，確診須測(cè)定CTG重復(fù)數(shù)致病等位基因重復(fù)片段長(zhǎng)、GC含量高，分子診斷有難度國(guó)內(nèi)報(bào)道多為臨床診斷，缺乏完整有效的分子診斷方法選擇PCR結(jié)合Southernblot、TP-PCR兩種方法，進(jìn)行DM1分子診斷方法研究遇到的困難和思考Southernblot需DNA量多、質(zhì)量要求高，操作麻煩，不適合臨床開(kāi)展國(guó)內(nèi)獲得探針困難，本研究?jī)H能根據(jù)酶切圖譜原理使用PCR法制備正常人DMPK基因CTG重復(fù)片段側(cè)翼的一段序列作為探針，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該探針有效，但敏感性、特異性和穩(wěn)定性有待于進(jìn)一步驗(yàn)證

TP-PCR法設(shè)計(jì)思路巧妙，較Southernblot省時(shí)省力

需DNA