抗軟海綿酸單克隆抗體的制備與鑒定

腹瀉性核毒（sd）是由紅藻和原甲藻產生的脂肪多環醚類天然化合物。主要營養成分是軟海綿酸（oa）及其衍生物。引起的人類中毒的癥狀包括腹瀉、惡心嘔吐和胃痛。腹瀉性核毒的主要成分是軟海綿酸（oa）及其衍生物。引起的人類中毒的癥狀包括腹瀉、惡心嘔吐和胃痛。腹瀉性核毒是由磷酸酯酶刺激引起的。這是蛋白質磷酸酶pp1a和pp2a的強抑制劑。這是一種很強的致癌促癌劑，可以增加胃腸道腫瘤的形成。目前,腹瀉性貝毒的分析方法主要有生物小鼠法、高效液相色譜法、以及一些免疫化學方法。生物小鼠法簡便易行,不需要儀器設備,但不能區別毒素的種類和結構、干擾大、不精確;高效液相色譜分析法可準確給出毒素的含量和種類,檢測限可低至ng/g,已被許多國家采用為標準方法,缺點是樣品前處理繁瑣費時,儀器昂貴,且需要專門的分析技術人員;酶聯免疫吸附試驗方法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)利用抗體對抗原的特異性結合,加入酶標記或熒光標記的二抗,經底物顯色,用紫外或熒光酶標儀測定的免疫化學方法,具有靈敏度高,特異性強,儀器設備簡單易掌握,樣品前處理相對簡單等優點,適于現場監測和大量樣本快速篩查,近年在分析化學領域受到極大的重視和迅速發展。本研究用軟海綿酸與牛血清白蛋白和卵清蛋白偶聯制備免疫抗原和包被抗原,用其免疫小鼠制備單克隆抗體,建立了貝類中軟海綿酸殘留量的間接競爭ELISA分析方法。1材料和方法1.1細胞培養和抗鼠二抗amol-1333,5e培養基BALB/c小鼠購自大連醫科大學動物實驗中心;軟海綿酸、水溶性碳化二亞胺[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carboimidehydrochloride,EDC]、N-羥基琥珀酰亞胺(N-Hydroxysuccinimide,NHS)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)、卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)、弗氏完全和不完全佐劑、HAT(hypoxanthineaminopterinthymidinemedium)培養液、胎牛血清、聚乙烯醇(polyvinylalcohol,PVA)、聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)均購自Sigma公司;RPMI-1640培養基購自Gibco公司;辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標記羊抗鼠二抗購自華美公司。所用儀器Thermolabsystems酶標儀和洗板機、JASCO紫外/可見分光光度計V-550。1.2方法1.2.1偶聯物摩爾分子比的測定將軟海綿酸(OA)溶于1ml的二甲基亞砜中,加入EDC和NHS,25℃反應1.5h后,加入溶于硼酸鹽緩沖液(pH9.0)的牛血清白蛋白(BSA),25℃反應3h。將反應混合物移入透析卡中透析3天,4℃,每12h換液1次。通過測定反應前后的自由氨基數,得到偶聯物的摩爾分子比。透析物分裝后,-20℃保存。OA-OVA偶聯方法相同。1.2.2小鼠sda的合成以OA-BSA為免疫原,免疫兩只6~8周齡的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用200μlOA-BSA與等體積弗氏完全佐劑,充分乳化,腹腔注射小鼠,第2、4、6、8、10和12周取同量OA-BSA與等體積不完全弗氏佐劑充分乳化,腹腔注射。取尾血測定小鼠血清效價,待效價大于要求值后,融合的前4天,取100μgOA-BSA的PBS溶液腹腔注射加強免疫。1.2.3酶標羊抗鼠二抗h7.4用OA-OVA偶聯物作為包被抗原,用碳酸鹽緩沖液(pH9.6)稀釋到適當濃度添加到96孔酶標板,每孔100μl,4℃過夜;棄去殘液,洗滌96孔酶標板(洗液PBST:1%吐溫-20溶于pH7.4的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液)3次;用1%的PVA-PBS溶液300μl封閉,37℃3h;封閉好的96孔酶標板可保存在4℃數周待用;測定時,棄去封閉液,洗板3次,加入稀釋的血清或細胞上清,每孔100μl,37℃溫箱中孵育1h;從溫箱中取出酶標板,洗板,加入適當稀釋的酶標羊抗鼠二抗,每孔100μl;37℃溫箱中孵育40min;洗板,每孔加底物溶液(鄰苯二胺、pH5.0的磷酸鹽-檸檬酸緩沖液和30%H2O2,臨用前現配制)100μl,37℃顯色10~15min,以0.5mol/LH2SO4每孔50μl中止反應,492nm波長測量吸光度值。1.2.4peg融合添加量取生長狀態良好的對數生長期骨髓瘤SP2/0細胞(2×107/ml)與免疫的小鼠脾細胞(1×108/ml)按1∶5的比例混合,加入PEG融合;在20%胎牛血清的HAT培養基中選擇培養,3天后換半液,5~7天有細胞克隆形成,取細胞培養液上清進行ELISA檢測,選取陽性細胞孔,用有限稀釋法克隆,篩選可穩定分泌抗軟海綿酸(OA)單克隆抗體的雜交瘤細胞系。1.2.5雜交瘤細胞術檢測強陽性孔的雜交瘤細胞經3~4次有限稀釋法克隆培養,用ELISA法檢測培養上清,至陽性率達到100%,所得細胞株即為分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經擴大培養后,部分細胞用含10%二甲基亞砜的完全培養液懸浮,液氮保存,其它細胞轉至培養瓶中擴大培養。1.2.6雜交瘤細胞懸液的制備取8周齡健康BALB/c雌性小鼠,腹腔注射0.5ml液體石蠟,1~2周后可用;1500r/min離心收集對數生長期的陽性雜交瘤細胞,懸浮于生理鹽水中,加適量青霉素和鏈霉素,懸浮細胞濃度為106/ml;在石蠟處理的小鼠腹腔內注射0.5ml雜交瘤細胞懸液;注射后7~10天可見小鼠腹部明顯膨大,用大號針頭刺入小鼠腹部,收集腹水,3000r/min離心10min,收集上清液即為含單克隆抗體腹水,用間接ELISA法測定腹水效價,-85℃凍存待用。1.2.7elisa-4-3-ms-elisa反應將陽性雜交瘤細胞的腹水做系列稀釋,用ELISA方陣確定最佳稀釋濃度;將OA-OVA偶聯物用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋到適當濃度,以100μl/孔包被酶標板,4℃過夜;1%PVA-PBS封閉后,每孔加入適當濃度的OA標準溶液(溶解于0.01mol/LpH7.4的PBS)和稀釋的腹水各50μl,其余步驟同ELISA分析血清方法;中止反應后用酶標儀測定492nm吸光值。以加入不同濃度OA標準品孔的吸光值與空白對照孔吸光值比(結合率)為縱坐標,相應的OA標準品濃度值為橫坐標,繪制標準曲線。1.2.8甲醇-水萃取法將一定量的軟海綿酸標準品添加到扇貝肉中,80%的甲醇-水萃取,用上述間接競爭ELISA法檢測樣品中OA的含量。實測值與實際OA添加量相除,即為樣品的回收率。2結果2.1a與載蛋白質結合的分子比根據自由氨基測定的結果,OA與BSA和OVA的結合比分別是27∶1和12∶1。2.2免疫大鼠血清效果以OA-BSA為免疫抗原,免疫8次的兩只BALB/c小鼠的血清對OA-OVA的效價均大于2×104。2.3陽性混合腫瘤的細胞株2.3.1elisa篩選取免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合,每只鼠滴種8塊96孔板,融合率達到90.1%,經ELISA篩選,陽性率為2.2%。3次克隆后分別獲得4株陽性雜交瘤細胞株,命名為Mab13#、Mab10#、Mab11#和Mab7#,經過細胞體外連續傳代十幾代及凍存2個月后復蘇,ELSIA效價檢測顯示抗體分泌仍呈強陽性,效價與原代細胞一致,證明這4株雜交瘤具有穩定分泌抗體的能力。2.3.2雜交瘤抗體的制備擴大培養后,細胞上清液的滴度見表1,結果表明雜交瘤能分泌較高濃度的單克隆抗體。通過小鼠體內誘生的方法,4株雜交瘤細胞均能誘導出高效價的含抗OA單克隆抗體的腹水,其滴度結果見表2。2.4間接競爭法分析2.4.1ova的稀釋度及使用濃度用點陣法確定了競爭ELISA法包被抗原OA-OVA最佳稀釋度是1∶1000;腹水的稀釋倍數是1∶6000;HRP標記羊抗鼠二抗的使用濃度為1∶1000;底物顯色的時間為12min。2.4.2標準曲線的繪制以抗原OA標準溶液濃度為橫坐標,結合率為縱坐標,繪制標準曲線(見圖1)。OA濃度與其結合率之間有較好的線性關系,r=0.9824,最低檢出限為31.2ng/ml。2.4.3elisa方法的回收率取一定量的OA標準液,添加到扇貝肉中,加入萃取液,使其終濃度分別為50、83.3和125ng/ml,用建立的間接競爭ELISA方法測定萃取液中OA的濃度。50ng/ml濃度測定6次的平均回收率為88.3%,83.3ng/ml濃度測定4次的平均回收率為87.2%,125ng/ml濃度測定5次的平均回收率為112.3%;50ng/ml濃度測定6次的變異系數為7%,83.3ng/ml濃度測定4次的變異系數為12%,125ng/ml濃度測定5次的變異系數為5.4%。3elisa檢測對于抗腹瀉性貝毒的主要成分軟海綿酸單克隆抗體的成功制備并應用于OA的分析檢測,可能因為軟海綿酸分子量相對較小,分子結構是長鏈狀,分子內可以用來與蛋白質載體偶聯的功能基團少,合成高質量的人工抗原較困難;OA標準品價格昂貴,來源渠道少,限制了關于建立ELISA分析方法的研究。本實驗成功的合成了OA和BSA、OVA偶聯的2種抗原,分別用做免疫抗原與檢測抗原,本文利用制備的單克隆抗體建立了OA間接競爭ELISA分析方法,可用于海洋貝類中OA的