摘要生物離子通道因其具有高度的選擇性與特異性，可以實現對不同的分子與離子的分離篩選，但其必須依靠磷脂雙分子層，具有不穩定性，這就大大限制了它的應用。近年來,隨著生物技術和納米科學的不斷進步，基于納米材料構筑的功能分子分離篩選系統愈發成為相關領域的研究熱點。人們利用納米材料機械強度高、形貌和表面功能化多樣性，以及與生物分子和其活動區域相似的尺度和維度等優點，設計和開發了具有多靈敏度和選擇性的生物器件。本文工作主要包括以下兩個方面：1.在陽極氧化鋁（AAO）納米孔道內可控的修飾單分散性的金納米顆粒(AuNPs)。本實驗利用聚多巴胺（PDA）的粘附性和還原性與氯金酸的氧化性，通過簡單真空抽濾的方法在AAO納米孔道內壁上修飾單分散的金納米顆粒。同時，通過調節聚多巴胺溶液的濃度、氯金酸溶液的濃度等實驗條件，成功地調節和控制了AAO孔道內表面附著的金納米顆粒的尺寸（30-80nm）和分布密度（109-1012m-2）。2.對AAO孔道進行功能化修飾，構筑了基于AAO納米孔道為基底的分子分離篩選體系。利用金原子與巰基結合形成Au-S鍵，本實驗首先在修飾金顆粒的AAO孔道內選擇性的修飾了疏水分子二十二烷基硫醇（C22H46S），在電化學驅動之后，檢測親水分子亞甲基藍與疏水分子阿米替林跨膜運輸濃度。結果顯示經疏水分子功能化修飾的AAO孔道能夠較好的分離篩選親、疏水分子。其次在修飾金顆粒的AAO孔道內分別選擇性的修飾L/D-半胱氨酸（L/D-Cys），在電化學驅動后，檢測牛血清蛋白(BSA)分子分別通過L-Cys與D-Cys修飾的AAO孔道的跨膜運輸濃度。結果顯示經手性半胱氨酸修飾的AAO孔道對BSA有選擇運輸性。關鍵詞：納米材料、金納米顆粒、尺寸密度可控、功能化修飾、分子分離篩選

AbstractBiologicalionchannelscanseparateandscreendifferentmoleculesandionsbecauseofitshighselectivityandspecificity,buttheymustrelyonphospholipidbilayers,whichisunstableandgreatlylimitsitsapplication.Inrecentyear,withthecontinuousdevelopmentofbiotechnologyandnanoscience,functionalmolecularseparationandscreeningsystemsbasedonnanomaterialconstructionhavebecomearesearchhotspotinrelatedfields.Biomaterialswithmultiplesensitivitiesandselectivitieshavebeendesignedanddevelopedusingtheadvantagesofhighmechanicalstrength,morphologicalandsurfacefunctionaldiversityofnanomaterials,andsimilarscalesanddimensionstobiomoleculesandtheiractiveregions.Thispapermainlyincludesthefollowingtwoaspects:Monodispersegoldnanoparticles(AuNPs)arecontrollablymodifiedinanodizedaluminum(AAO)nanochannels.Inthisexperiment,themonodispersegoldnanoparticlesweremodifiedontheinnerwalloftheAAOnanoporebysimplevacuumfiltrationusingtheadhesionandreducibilityofpolydopamine(PDA)andtheoxidizingpropertyofchloroauricacid.Atthesametime,byadjustingtheconcentrationofpolydopaminesolutionandtheconcentrationofchloroauricacidsolution,thesize(30-80nm)anddistributiondensity(109-1012m)ofgoldnanoparticlesattachedtotheinnersurfaceofAAOchannelweresuccessfullyadjustedandcontrolled.FunctionalmodificationofAAOporestoconstructamolecularseparationscreeningsystembasedonAAOnanopores.TheAu-Sbondwasformedbythecombinationofagoldatomandasulfhydrylgroup.Inthisexperiment,thehydrophobicmoleculebehenylthiolwasselectivelymodifiedintheAAOchannelofthemodifiedgoldparticle.Afterelectrochemicaldriving,thetransmembranetransportconcentrationofthehydrophilicmolecularmethyleneblueandthehydrophobicmoleculeamitriptylinewasmeasured.TheresultsshowthattheAAOporesfunctionalizedbyhydrophobicmoleculescanbeusedtoisolateandscreenpro-andhydrophobicmolecules.Secondly,L/D-cysteine(L/D-Cys)wasselectivelymodifiedintheAAOchannelofthemodifiedgoldparticles.Afterelectrochemicaldriving,Transmembranetransportconcentrationsofbovineserumalbumin(BSA)moleculesthroughL-CysandD-CysmodifiedAAOchannelsweremeasured.TheresultsshowthattheAAOchannelmodifiedbychiralcysteinehasaselectivetransportabilitytoBSA.Keyword:Nanomaterials；goldnanoparticle；controllablesizeanddensity；functionalmodification；molecularseparationandscreening目錄第一章概述 51.1納米孔的概述 51.1.1生物納米孔 51.1.2固態納米孔 61.2固態納米孔/納米通道的制備 61.2.1徑跡刻蝕法 71.2.2模板法 71.2.3聚焦離子束（FIB）技術 71.3固態納米孔/納米通道生物功能化 81.4智能固態納米孔/納米通道的應用 91.4.1、能量轉換 91.4.2分子與離子的分離篩選 111.5選題的意義及內容 121.5.1選題意義 121.5.2研究內容 12二、實驗部分 132.1實驗思路 132.2實驗試劑及儀器 142.3實驗步驟 152.3.1AAO孔道內修飾納米金顆粒的實驗具體步驟 152.3.2改變PDA及HAuCl4濃度，對AAO孔道金顆粒進行調控的實驗步驟 162.3.3修飾金顆粒的AAO膜特異性修飾修飾疏水及其對親、疏水分子的分離 162.3.4修飾金顆粒的AAO膜特異性修飾手性分子及其對牛血清蛋白的分離 18三、實驗結果與討論 193.1AAO膜孔道內修飾金納米顆粒SEM形貌的表征 193.2、不同PDA濃度、HAuCl4濃度對孔道內金顆粒尺寸及密度的影響 203.2.1不同PDA濃度對金顆粒的尺寸及密度分布的影響 203.2.2、不同HAuCl4濃度對金顆粒的尺寸及密度分布的影響 213.2.3同時改變PDA、HAuCl4濃度對金顆粒的尺寸及密度分布的影響 223.3、AAO孔道內選擇性修飾疏水分子的表征及其對親、疏水分子篩選 233.3.1修飾二十二烷基硫醇的AAO膜的SEM孔道形貌表征 233.3.2修飾二十二烷基硫醇的AAO膜的接觸角表征 243.3.3修飾二十二烷基硫醇的AAO膜對親、疏水分子篩選 263.4AAO孔道內選擇性的修飾手性分子及其對BSA分子選擇性運輸 28總結與展望 29致謝 30參考文獻 31

第一章概述1.1納米孔的概述孔徑介于1-100nm，且大于孔的深度或處于同一數量級的孔狀納米結構稱為納米孔。反之，當孔深遠大于孔徑的結構稱為納米通道[1]。納米孔根據其材料可以分為兩大類：1、生物納米孔；2、固態納米孔；1.1.1生物納米孔生物納米孔是生物分子中形成的天然納米孔道，如生物膜離子通道、溶血素（α-hemolysin，目前應用最為廣泛的生物孔道材料，如圖1所示）跨磷脂雙層細胞膜形成的離子通道等，是生物體中控制信號分子[2]、遺傳物質以及細胞或細胞器內外環境之間能量的運輸[3]的重要結構。它們被稱為膜蛋白嵌入細胞膜內，通過各種功能參與生物體的許多的生命過程[4]。作為極其敏感的機電元件，它們主要通過跨膜離子運輸的方式來維持生物體的正常生理條件。例如，當大腦處于靜止狀態時，存在于神經細胞中的配體門控離子通道被關閉，而當特定神經遞質與通道上的分子識別位點結合時，它們可被打開以允許特定離子通過。此外，感覺系統中存在的蛋白質通道可以直接響應特殊分子或物理刺激。例如，香草素受體可以對外界的刺激進行響應。這些蛋白質納米孔也可以在體外實現許多重要的功能。經過幾十年的發展，生物納米孔已被廣泛研究并應用。例如，OxfordNanoporeTechnologies已經用于一種商業便攜式設備，通過蛋白質納米孔進行分子分析。該裝置適用于分析DNA、RNA、蛋白質和小分子，操作簡單方便，分析效果好。這些蛋白質納米孔已得到很好的發展和總結[5-7]。然而，生物離子通道必須依賴脆弱的磷脂雙層，具有不穩定性，這不可避免地限制了它們在現實世界中大規模的應用。圖1：α-溶血素生物蛋白孔1.1.2固態納米孔固態納米孔是在薄膜上人為制造的納米級孔隙，常用仿生固態納米孔道根據材料劃分主要分為有機孔道、無機孔道以及復合孔道[8-9]。如圖2所示。目前，有機孔道材料應用最廣泛的主要是聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethyleneterephthalate,PET）。采用重離子徑跡刻蝕技術，可以實現不同結構、尺寸的PET納米孔道的制備[10-12]。無機孔道材料主要包括陽極氧化鋁膜（AAO）、氮化硅、玻璃等材料[13-15]。復合孔道材料是指通過物理化學技術，將不同孔道材料結合在一起形成的一種納米孔道材料。另外，根據基底膜上納米孔的數量劃分，分為單納米孔材料（膜上只有一個孔道）和多納米孔材料（膜上有兩個或兩個以上的納米孔道）兩種[11]。與生物納米孔相比，固態納米孔具有孔徑可調，機械強度高，力學、化學性能穩定等優勢，并且可通過多種制備工藝制得，可以實現納米孔的大規模制備與加工。通過改變納米孔大小[16]、表面電荷[17]和極性[18]可改變固態納米孔的表面與孔道的性質，使其具有特異性，可以選擇性地分離篩選與運輸物質。另外，通過調節納米孔的孔徑，可以對較大的分子和器件進行檢測，例如DNA、DNA-蛋白質復合物等，成為新的納米材料的表征手段。圖2：仿生孔道分類1.2固態納米孔/納米通道的制備三種常見的固態孔結構分別是納米孔、納米通道以及納米管，我們使用納米孔/納米通道來代表所有這些類型的固態孔結構。近年來，由于結構和功能與生物離子通道的相似性，固態納米孔和納米通道都引起了廣泛的關注，與生物納米孔相比，固態納米孔/納米通道具有孔徑可調，機械強度高，力學、化學性能穩定等優勢。所以，科學家致力于設計和構建與生物離子通道具有共同特征的固態納米孔/納米通道。固態納米孔的常用制備方法包括：1.2.1徑跡刻蝕法徑跡刻蝕法包括兩個步驟，首先是形成潛徑跡區。高能離子穿過固體有機薄膜，將自己的能量傳遞給固體膜中的低能電子，并釋放出二次電子流，二次電子迅速沿著固體膜的徑跡向外擴散，使能量逐漸轉變成原子的運動，實現固體膜的加熱。釋放出的熱量使固體膜形成一個密度小、化學活性大的特殊區域，這個區域稱為潛徑跡區（圖1.12）。其次是化學刻蝕。在刻蝕前，用365nm/254nm的紫外光輻照具有潛在徑跡的有機薄膜，正反面各紫外輻照1h，使潛徑跡區域化學活性增大，更容易蝕刻。然后，將紫外輻照后的膜與刻蝕液反應，由于經過高能離子輻射的區域化學活性大，刻蝕速度遠遠大于其他位置，在一定的條件限制下，該區域被刻蝕液溶解，其他區域未被溶解，從而形成特定形狀的孔道。徑跡刻蝕法常用于有機固態孔道的制備，例如苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚碳酸酯(PC)，聚酰亞胺(PI)等。目前人們利用并控制不同的刻蝕條件，已經得到了各種形狀結構的有機納米孔道[19]。1.2.2模板法在特定的模板膜上沉積所需要的孔道材料，然后去掉模板，制備所需材料的固體孔的方法稱為模板法。一般模板法所用到的模板主要有：徑跡刻蝕法制備的有機固態多孔膜[20]，分子篩[22]，陽極氧化鋁（AAO）多孔膜[21]等。以AAO多孔膜為例，首先將AAO多孔膜為模板，在模板上沉積待成孔的物質，成型后，再將表面的沉積物按需要進行處理，最后應用化學腐蝕手段去除模板孔道，就可以得到所需材料的納米通道。1.2.3聚焦離子束（FIB）技術聚焦離子束技術近20年來發展起來的新型刻蝕技術，是用于光刻掩模版修補和集成電路修飾而專門設計的一種精細加工技術。利用FIB技術制備納米孔的基本原理是：利用離子束與晶體表面的作用，在離子束聚焦位置刻蝕掉晶體原子或分子，形成納米孔洞。當一束具有幾千電子伏特的離子束轟擊材料表面時，將產生兩種截然不同的效應。一種是原子尺寸的沖蝕過程，即瓣射。離子束將材料表面最外層的原子和分子刻蝕掉，形成一個小洞／小孔，通過該途徑產生的納米孔技術稱作濺射刻蝕。另一種效應是離子束刺激材料表面原子或分子的橫向遷移，沿表面移動的原子或分子進入已形成的小孔內，縮小甚至封閉住小孔。在表面原子或分子橫向遷移的過程中，當達到預設納米孔尺寸時，通過反饋機理的提示終止此過程。因而，轟擊材料在這兩種效應的作用下，產生一定尺寸的納米孔。除了用于硅基材料的刻蝕外，這種技術還可用于刻蝕Al、Cr、W及聚合物材料，如聚甲基丙稀酸甲酯（PMMA）和聚酷亞胺（PI）等[21]。1.3固態納米孔/納米通道生物功能化到目前為止，有許多工作已經說明了固態離子納米通道/納米孔的最新發展，包括多樣的制備方法[23]，功能化[24]，和具體的應用[25]。但很少關注生物分子功能化。近幾年，生物分子及其類似物功能化修飾的固態離子納米通道/納米孔快速發展。生物分子具有許多優點：（1）核酸堿基互補配對，生物分子適體/靶標，抗原/抗體，酶/反應物，生物素/抗生物素蛋白和β-環糊精/氨基酸的特異性識別[26]；（2）對外界刺激的特異性反應[27]（如構象或電荷狀態隨pH值、金屬/重金屬離子、光和氧含量等變化而變化）；（3）結構擴增[28]；（4）高效酶促反應[29]。同時，固態納米通道/納米孔系統是有利的平臺。第一，它們可以改變離子電流作為監測生物反應例如：特殊識別，外部刺激反應等的信號[30]。其次，納米通道/納米孔為納米尺度的功能分子和分析物之間的相互作用提供了一個限制的區域[31]，這導致在納米通道/納米孔中產生了反應物容易和頻繁傳輸的動力學效應，提高了反應常數。當固態納米通道/納米孔被生物分子功能化后，在實際應用中有兩個主要特征[32]：特異性和信號放大，這是由于生物分子的優勢和固態離子納米通道/納米孔的特性的結合，這兩個特征與高度特異性和敏感性傳感[33]，仿生運輸[34]，和能量轉換的應用有關。當納米通道/納米孔用生物分子功能化時，對于實現以上提到的功能的相關技術是十分重要的。這些技術涉及界面化學的許多基本機制，基本包括三種方式：（1）直接鍵合。根據生物分子官能團的不同，所選納米通道/納米孔材料（如聚合物，陽極氧化鋁和玻璃）性質的差異，以及修飾功能分子方法的不同，采用傳統的兩步/三步法或改進版本。（2）間接鍵合。納米通道/納米孔的原始表面被新物質（例如Au）覆蓋，然后在新產生的界面上進行功能化修飾。（3）非鍵合。通過靜電作用將生物分子引入納米通道/納米孔或者甚至直接注入孔道內。本論文中使用的是陽極氧化鋁（AAO）無機膜，在AAO內壁修飾金納米顆粒，主要采用的第二種方式。間接鍵合首先是覆蓋納米通道/納米孔的原始官能團，并且隨后在新產生的表面上進行生物分子的功能化。常見的間接鍵合是將Au固定在納米孔/納米通道的外表面或內壁，由于Au與巰基（-SH）可形成Au-S鍵[35]，因此，可以將含有巰基的生物分子固定在納米通道/納米孔外表面或內壁上。通常，通過濺射或電化學方法沉積Au層。此外，利用聚多巴胺修飾納米孔/納米通道的外表面或內壁是另一種常見的間接鍵合方式。通過真空抽濾或浸泡等方式，將聚多巴胺（PDA）覆蓋在納米通道/納米孔的原始化學表面上，由于聚多巴胺具有強的粘附性且存在許多官能團，例如兒茶酚，亞胺和胺等，其對于修飾特定的生物分子是十分重要的。PDA層還可以通過原位還原HAuCl4誘導Au納米顆粒的形成，使納米孔金屬化，進而利用Au-S鍵使Au粒子表面官能化。1.4智能固態納米孔/納米通道的應用當溶液中的生物分子通過納米孔/納米通道，或生物分子固定于納米孔/納米通道時，在一定濃度的電解質溶液中，會有兩種效應產生：靜電效應[37]和空間位阻效應[38]。靜電效應是對于荷電生物分子而言，當荷電生物分子通過特異性識別或共價鍵合于納米孔壁時，會引起表面電荷密度或電荷性質的改變。此時，納米孔壁與傳輸離子之間的相互作用也會發生相應的變化從而改變納米孔中離子傳輸速率?？臻g位阻效應是對尺寸比較大的分子而言，當足夠大的生物分子引入納米孔／納米通道后，會阻塞納米孔／納米通道，從而導致離子自由輸運空間和輸運量的減小。當采用一定的檢測手段時，所檢測到的離子傳輸量的變化可以間接對納米空腔內固定的生物分子進行定性和定量分析。因此，納米孔中的很多傳感應用都是基于這兩種效應發展起來的[39]。綜上所述，納米孔／通道材料的應用研究主要包括以下幾個方面：1.4.1、能量轉換能源的開發與利用是人類社會發展的基礎。當今世界，不可再生能源的儲量急劇下降，能源危機是當今世界面臨的一大難題。為了解決這個問題，我們必須開發利用可再生能源及尋找能源轉換的新方法。近年來，受生物離子通道的啟發，仿生固態納米孔/通道技術得到迅猛的發展，也為能量轉換器件的小型化提供了基礎[40,41]?；诩{米孔道的能源轉換方法是利用納米孔道在納米尺度上特有的物理化學性質，將環境中存在的清潔能源轉換為電能。與傳統的發電與能量轉換設備相比，它不需要機械轉動裝置，減少了驅動轉動裝置的能量消耗，同時也為電源部件的小型化和集成化提供了新思路?；诩{米孔道的能量的轉換體系分為三類：1）基于納米孔道的機械能-電能轉換將孔道表面帶有凈余電荷的納米孔置于電解質溶液時，會在溶液層中形成靜電場,使溶液中的反離子聚集在表面附近形成一個離子分布。在有限區域內,例如微納孔道內,這樣的兩層不同帶電的區域形成表面雙電荷層，通過外部機械壓力將電解質溶液推過納米孔道，使得電解質溶液在通過孔道內表面附近雙電荷層時發生電荷分離，從而產生動電流和動電勢?；谶@種孔道雙電荷層的機電轉換思路最早在20世紀60年代被提出[42]。與傳統的發電機相比，納米流體發電裝置的設備簡單，只需要納米孔道，電解質溶液，以及一定的壓力差三個條件就能夠實現機-電能量間的轉換，減小了驅動機械設備的能量消耗，提高了能量轉化效率。因此近年來，關于納米流體電池的研究日益熱門。2）基于仿生智能納米孔道的鹽差能轉換鹽差能是混合不同的鹽溶液來釋放能量，屬于吉布斯自由能的一種，是清潔可再生能源，對環境友好。理論上均勻混合1m3的具有不同鹽濃度的海水和河水,將產生1.7MJ的能量[46]。傳統的方法是通過具有選擇透過性的離子交換膜進行海水和淡水的混合,被稱為反向電滲析技術，這是由Pattle[43]獨立提出,當時他所得到的功率密度只有0.005mW/cm2，Weinstein和Leitz[44]使用一組交替排列陰離子和陽離子交換膜作為溶液混合膜組,所得到的功率密度仍然僅有0.017mW/cm2，所以此方法得到的功率密度低，難以滿足實際需要，而且離子交換膜的成本昂貴，壽命短，限制了這種技術的發展。受到生物離子通道可以高效率地產生和積累來自環境中的能源,實現能量的轉換、存儲與利用的啟發，科學家開始用具有規則形狀及電荷選擇性的固態納米孔代替了離子交換膜，用反向電滲析的方法將鹽差能轉換為電能稱為納流體反向電滲析[45]。郭維等[46]在實驗上得到的單納米孔道的能量輸出功率達到26pW,當孔密度達到108~1010/cm2時，功率密度可以達到3~260mW/cm2,比現有使用離子交換膜材料的反向電滲析體系高出了2~4個數量級。之所以能夠很大程度上提高反滲透體系的工作效率，主要原因在于直通的納米孔道大大降低了通道對電解質流體的流阻,從而提高了單位時間通過孔道的離子通量,提高了功率密度。固態納米通道制備簡單，價格低廉，為高效的利用鹽差能提供了可能性。3）基于仿生智能納米孔道的能源轉換體系細菌視紫紅質，是一種色素蛋白，它具有利用和轉換光能的能力。在太陽光驅動下，它能夠通過一系列的跨膜質子泵和質子通道將光能轉換成為光電流。在這個過程中，離子通道具有十分重要的作用。受此啟發，郭維等[45]將光酸分子引入到含有仿生質子通道的特殊設計的光電化學池中,通過對納米通道構型和表面電荷的調控，成功的將光能轉化為了電能。但目前轉換效率太低，還需要進一步研究。ATP-酶（又稱三磷酸腺苷酶）廣泛存在于體內，它能夠將ATP水解為ADP與磷酸根離子并釋放能量，為生物的生命活動提供能量。受此啟發，科學家模仿植物光合作用，通過將ATP-酶在聚合物多孔膜一側上的組裝，使得膜兩端的質子濃度不同造成質子的流動，將光能轉換為化學能[47]。1.4.2分子與離子的分離篩選納米通道對分子和離子的分離篩選是由分子與離子的特性以及納米通道內表面的性質決定的。根據分子與離子的尺寸大小、親疏水性能、帶電荷情況、特異性等特性的不同，可通過調整納米通道的孔徑、修飾親疏水分子、修飾帶電分子，特異性識別分子等方法實現不同分子通過納米孔的難易程度不同，從而達到目標分子、離子分離的目的。Martin小組采用0.6nm金納米管膜對大分子釕聯吡啶Ru(bpy)32+及小分子甲基紫精MV2+在納米管內的遷移行為進行研究，發現小分子MV2+很快的通過了納米管膜，而大分子兩周都無法通過金納米管膜，從而實現了基于分子尺寸大小的完全分離[48]。Jirage等[49]將孔徑小于1nm的納米通道膜置于U型池中間，把分子量為79的吡啶和分子量為24的喹啉放在滲透池中，通過吸光度變化觀察接收池中兩種分子數量的變化。結果表明，只有體積較小的吡啶分子透過納米通道膜進入接收池中，而體積較大的喹啉分子卻沒有透過納米通道膜，從而實現將大小分子分離。Lee等通過調控陰離子表面活性劑在金納米管壁的吸附，從而調控納米管壁的親疏水性質，建立了基于電位調控不同親疏水性質的離子選擇性傳輸的方法[50],Lee等通過硫醇化學將兩性分子L-半胱氨酸固定于金納米管的內壁，通過調控pH來改變納米管中L-半胱氨酸的荷電性質，從而實現pH調控納米管內不同荷電離子的選擇性傳輸[51]。Martin等[52]將乙醇脫氫酶固定在聚碳酸酯膜納米通道內，這種酶對苯丙氨酸具有識別能力，可以將D型和L型苯丙氨酸分離開來。并且證明納米通道的內徑越小，分離系數越高，當納米通道為30nm時，分離系數高達4.9。1.5選題的意義及內容1.5.1選題意義生物納米通道廣泛存在于生物體的膜結構中，對于生物體的物質傳輸、能量傳輸、信號傳遞等生命活動起著至關重要的作用,并且生物納米孔道具有特異性與選擇性等優點，可以應用于分子分離篩選等方面，然而它必須依賴于磷脂雙分子層才能發揮作用，穩定性差，而且它的孔徑固定。因此限制了它在外在環境中的應用。近十幾年來，受生物納米通道的的啟發，固態納米孔/納米通道技術逐漸發展起來。相比于生物納米通道，其具有孔徑可調、結構堅固穩定、物理性能穩定等優點。而且固態納米孔/納米通道可通過功能化修飾很大程度上模仿生物納米通道，為研究生物納米通道提供了新的思路。目前，仿生固態納米孔/通道能夠較好的分離篩選分子量差別大、帶電荷情況不同的分子與離子，但對于分子量接近，帶電荷情況相似的分子與離子的分離篩選效果不理想，在此背景下，本實驗通過對AAO進行功能化修飾，建立一個以AAO為模板的分子分離篩選體系。旨在通過在孔道內修飾不同的功能分子對分子量接近、帶電荷情況相似的，但親、疏水性能不同或手性分子進行分離篩選1.5.2研究內容本論文主要通過對納米孔的分類，固態納米孔/納米通道的制備方法、生物功能化及應用幾個方面對納米孔進行了綜述，并探究了無機納米孔AAO通過功能化修飾對分子分離篩選的作用。實驗的主要內容包括以下三個方面：1.選取陽極氧化鋁模板（AAO,孔徑80-100nm）作為基底，利用聚多巴胺（PDA）溶液的粘附性與強還原性（將氯金酸（HAuCl4）中Au3+還原為Au），在AAO孔道的內壁上修飾金納米顆粒。2.通過改變PDA濃度、HAuCl4濃度及兩者同時改變對AAO孔道內金納米顆粒的分布密度、尺寸大小進行有效的調控，旨在AAO膜孔道內修飾密度高、粒徑大的金納米顆粒。3.Au可與巰基形成穩定的Au-S鍵，在修飾有金顆粒的AAO孔道內選擇性的修飾帶巰基的功能分子，通過修飾疏水分子二十二烷基硫醇，探究其對電荷相同、尺寸類似的親、疏水分子的篩選；通過修飾手性分子（L-半胱氨酸與D-半胱氨酸）探究其對牛血清蛋白(BSA)的選擇性運輸。二、實驗部分2.1實驗思路利用聚多巴胺（PDA）溶液具有強粘附性與強還原性，通過簡單的真空抽濾的方法，將PDA抽濾通過陽極氧化鋁（AAO）的孔道，使其在AAO內壁上形成一層薄膜。然后將此AAO膜浸泡在氯金酸（HAuCl4）溶液中，由于HAuCl4中的Au3+具有強氧化性，PDA可以將其還原為Au原子，并粘附在AAO膜的內壁，大量的金原子聚集在一起就形成了納米金顆粒（如圖2.1）。這樣就可以在AAO膜的孔道內修飾上分散性的金納米顆粒。我們通過改變PDA濃度與HAuCl4濃度等條件，實現了對孔道內的金納米顆粒尺寸大小、分布密度的調控。而且金顆粒的表面與AAO內壁的表面性質差別很大，AAO膜內壁修飾金納米顆粒后，就產生了性質迥異的兩個界面,進一步還原了生物通道不同區域實現不同功能的復雜結構，為修飾不同的生物分子提供了可能。為探究AAO膜納米孔在分子分離篩選的應用，本實驗利用金原子與巰基反應形成穩定的Au-S鍵的原理，一方面，在修飾完納米金顆粒的AAO膜中選擇性的修飾上帶巰基的疏水分子，在電化學的驅動下，檢測其對疏水分子及親水分子的通過情況。另一方面，在修飾完納米金顆粒的AAO膜中選擇性的修飾上帶巰基的手性分子，在電化學驅動下，檢測其對牛血清蛋白（BSA）的通過情況。圖2.1AAO孔道內金顆粒的生長機理圖2.2 實驗試劑及儀器本實驗所用到的相關實驗藥品如下表1所示，實驗儀器如表2所示表2.1實驗所用的相關試劑信息名稱純度/規格生產廠家亞甲基藍，三水98%國藥集團二十二烷基硫醇>98%東京化成工業株式會社阿米替林鹽酸鹽98%薩恩化學有限公司氯化鉀>99.8%國藥集團陽極氧化鋁模板孔徑80-100nm合肥普元納米科技有限公司37%濃鹽酸AR國藥集團氯金酸99%SigmaAldrich多巴胺鹽酸鹽99%AlfaAesar十二水合磷酸一氫鈉AR國藥集團二水合磷酸氫二鈉AR國藥集團牛血清蛋白2mg/mL生工生物工程股份有兩公司L/D-半胱氨酸98%北京百靈威科技有限公司表2.2實驗所用到的相關實驗儀器信息儀器名稱儀器型號生產廠家超聲波清潔機SB.120DT寧波新芝生物科技股份有限公司分析天平AL204電子天平梅特勒-托利多儀(上海)有限公司掃描電子顯微鏡SU8010株式會社日立制作所電化學工作站CHI660E上海振華科技有限公司循環水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)武漢科爾儀器設備有限公司移液槍GE29721GILSON電熱鼓風干燥箱DHG-9030A上海一恒科學儀器有限公司水浴鍋HH-1數顯恒溫水槽榮華儀器制造有限公司超純水儀NWUltra-pureWaterSystemHealForce接觸角測試儀DSA-100KRUSS熒光光譜儀FS5英國愛丁堡儀器公司2.3實驗步驟2.3.1AAO孔道內修飾納米金顆粒的實驗具體步驟：（1）V37%HCl:VH2O=1:2的鹽酸溶液的配制：用膠頭滴管取質量分數為37%的濃鹽酸1.5mL于5mL試管中，用移液槍移取3mL去離子水混合均勻待用；（2）AAO膜的預處理：將AAO膜浸泡在（1）中的鹽酸溶液中，每片約0.5mL。然后超聲處理2min,用去離子水沖洗AAO膜表面；（3）1mMHAuCl4溶液的配制與預熱：用200μL移液槍移取80μL50mMHAuCl4于試管中，加入3.92mL去離子水，混合均勻。用錫箔紙包好，置于35℃水浴鍋中預熱30min；（4）2mg/mL的PDA溶液的配制：用分析天平準確稱取60mg多巴胺固體，加入12mL去離子水震蕩混合均勻；（5）真空抽濾裝置的搭建：將一張濾膜放在抽濾漏斗上，用水將濾紙浸潤，通過用鑷子移動濾紙的位置除去濾紙與漏斗間的氣泡；（6）AAO膜的抽洗及多巴胺溶液的抽濾：將AAO膜置于濾膜上，加水浸沒膜表面，打開真空泵開關，用鑷子輕輕觸碰膜邊緣，檢查膜是否吸緊。用移液槍滴加約50μL的去離子水于膜表面，反復抽洗5次。然后將（4）中的多巴胺溶液加在膜上，每片膜加1.5mL（大約滴加30次）；（7）PDA與HAuCl4的氧化還原反應：將抽濾完多巴胺溶液的AAO膜置于2mL離心管，加入（3）中的氯金酸溶液（每片0.5mL）。然后用錫紙包好，超聲5min，置于35℃的水浴鍋中反應2h；（8）修飾后AAO膜的洗滌與烘干：取出反應完的AAO膜（顏色為暗紅色），用去離子水沖洗表面，然后在用去離子水抽洗10次以除去表面和孔道內殘留的溶液。將抽洗之后的AAO膜置于120℃烘箱內恒溫1.5h烘干；（9）利用掃描電鏡對AAO膜孔道內金顆粒尺寸及密度進行表征：將制好的AAO膜切開以露出截面，用導電膠將切開的AAO垂直粘在樣品臺上，噴碳，然后送入樣品室中，調節粗調、細調旋鈕聚焦，找到并放大樣品，觀察金納米顆粒的生長情況，從而對孔道內金顆粒的尺寸及大小進行分析；2.3.2改變PDA及HAuCl4濃度，對AAO孔道金顆粒進行調控的實驗步驟（1）一系列濃度的PDA溶液的配制：分別稱取0.8mg、8mg、20mg、80mg的多巴胺鹽酸鹽固體，加入4mL去離子水溶解，配制成0.2mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、20mg/mL四種濃度的多巴胺溶液；（2）一系列濃度的HAuCl4溶液的配制：分別取8μL、80μL、160μL、800μL的50mMHAuCl4原溶液，加入去離子水稀釋至4mL,配置成0.1mM、1mM、2mM、10mM四種濃度的HAuCl4溶液；（3）孔道內金納米顆粒尺寸及密度的調控：通過改變1中（3）（4）步驟中的PDA及HAuCl4的濃度（本實驗調節多巴胺濃度與氯金酸為：2mg/mL+0.1mM、2mg/mL+1mM、2mg/mL+10mM、0.2mg/mL+1mM、20mg/mL+1mM、5mg/mL+2mm六組），其他實驗步驟不變，重復1過程，從而探究PDA濃度與HAuCl4濃度對金顆粒生長的影響，找出金顆粒生長尺寸大，密度大的最佳濃度。2.3.3修飾金顆粒的AAO膜特異性修飾修飾疏水及其對親、疏水分子的分離（1）阿米替林鹽酸鹽（疏水分子）濃度曲線的滴定：分別配制10-2、10-3、8·10-4、5·10-4、4·10-4、2·10-4、10-4、5·10-5、2·10-5、10-5、5·10-6、10-6mol/L一系列濃度的阿米替林溶液（溶劑為0.1mol/L氯化鉀溶液），通過紫外分光光度計測出每個濃度吸收值，用origin做出濃度-吸收值曲線；（2）亞甲基藍（親水分子）濃度曲線的滴定：分別配制10-2、10-4、5·10-5、10-5、5·10-6、10-6mol/L一系列濃度的亞甲基藍溶液（溶劑為0.1mol/L氯化鉀溶液），通過紫外分光光度計測出每個濃度吸收值，用origin做出其濃度-吸收值曲線；（3）1mM的二十二烷基硫醇（C22H46S，疏水分子）溶液的配制：稱取3.42mg的C22H46S固體，加入10mL無水乙醇，用封口膜封住管口，超聲15min至完全溶解；（4）AAO孔道內特異性修飾二十二烷基硫醇分子：將修飾有金納米顆粒的AAO膜浸沒于（3）中配好的溶液（每片約0.5mL）,用錫箔紙包好，反應過夜；第二天取出，用去離子水沖洗幾次，除去表面的殘留溶液；（5）修飾二十二烷基硫醇分子的AAO膜的接觸角表征：取（4）制備的修飾二十二烷基硫醇分子的AAO膜置于潔凈的玻璃片上，用移液槍滴加一滴去離子水（6μL）于膜上，固定玻璃片于KRUSSDSA-100接觸角測量儀樣品臺上，測定接觸角，取0s、30s、60s、120s、300s與600s為時間點，記錄接觸角隨時間變化的規律。取AAO空白膜、修飾金顆粒的AAO膜做對比實驗。（6）修飾二十二烷基硫醇分子的AAO膜的SEM表征：將（5）中的膜切開以露出截面，用導電膠將切開的膜垂直粘在樣品臺上，噴碳，送入樣品室中，調節粗調、細調旋鈕聚焦，找到并放大樣品，觀察孔道內的結構特征。并取AAO空白膜、修飾金顆粒的AAO膜做對比實驗。（7）親、疏水分子的跨膜電化學驅動：親、疏水分子的跨膜電化學驅動的裝置如下圖2.1所示，其中電解液為0.1mol/L氯化鉀溶液，右側驅動原液為10-2mol/L阿米替林溶液或亞甲基藍溶液，驅動時所用的膜為修飾有二十二烷基硫醇的AAO膜，電極為鉑電極，驅動電壓為+2V，驅動時間40min，驅動完成后取出左側驅動液保存。將親、疏水分子通過AAO空白膜、修飾有金顆粒的AAO膜的跨膜電化學驅動作為對比實驗；（8）驅動液濃度的確定：將親、疏水分子通過修飾有二十二烷基硫醇的AAO膜、空白AAO膜、修飾有金顆粒的AAO膜所得到的三種驅動液進行紫外吸收值測定，根據（1）（2）所得到的濃度曲線，將驅動液的紫外吸收值帶入，算出每個驅動液的濃度；2.3.4修飾金顆粒的AAO膜特異性修飾手性分子及其對牛血清蛋白的分離（1）1mM的D-半胱氨酸與L-半胱氨酸溶液的配制：用分析天平分別稱取1.2116mg的D-半胱氨酸與L-半胱氨酸于15mL離心管中，然后用移液槍移取10mL的去離子水，震蕩溶解。其中D-半胱氨酸不易溶于水，需超聲15min；（2）修飾金顆粒的AAO膜孔道內分別特異性的修飾D-半胱氨酸與L-半胱氨酸：將修飾有金納米顆粒的AAO膜浸沒于（1）中配好的溶液（每片約0.5mL）中，用錫箔紙包好，反應過夜。第二天取出，用去離子水沖洗幾次，除去表面的殘留溶液；再用去離子水真空抽洗5次；（3）0.05mol/LPH=7.4的PBS緩沖液的配制：用分析天平稱取十二水合磷酸一氫鈉（Na2HPO4）0.35814g，二水合磷酸氫二鈉（NaH2PO4）0.078g，然后分別用20mL、10mL去離子水溶解。將兩者以4:1的配比(取Na2HPO4溶液16mL，NaH2PO4溶液4mL)混合均勻，現配現用；（4）100nmol/L的帶FITC熒光素BSA溶液的配制：用移液槍取2mg/mL的BSA原溶液17μL加入（3）中所配的PBS溶液5.083mL，震蕩均勻；（5）BSA濃度曲線的滴定：?。?）中100nmol/LBSA溶液，加pH=7.4的PBS溶液稀釋至50、25、10、5與1nmol/L五個濃度,然后用熒光光譜儀測出每個濃度下對應的熒光強度(其中激發波長為494nm,發射波長為521nm,狹縫寬度為5mm),測完每個濃度之后必須將裝液體的池子用去離子水洗凈吹干，才能進行下一次測量，之后用origin做出濃度-熒光強度曲線。（5）BSA分子的跨膜電化學驅動：BSA分子的跨膜電化學驅動的裝置與3.1（8）中相同，但其中電解液為pH=7.4的PBS緩沖液，右側驅動原液為100nmol/LBSA溶液，驅動時所用的膜為修飾D-半胱氨酸與L-半胱氨酸的AAO膜，其他條件相同。將BSA分子通過AAO空白膜、修飾有金顆粒的AAO膜的跨膜電化學驅動作為對比實驗；（7）驅動液熒光強度的測定：測定BSA分子通過修飾有D-半胱氨酸與L-半胱氨酸的AAO膜、空白AAO膜、修飾有金顆粒的AAO膜所得到的四種驅動液熒光強度，分析修飾D-半胱氨酸與L-半胱氨酸的AAO膜對BSA分子的運輸影響；三、實驗結果與討論3.1AAO膜孔道內修飾金納米顆粒SEM形貌的表征聚多巴胺（PDA）是具有強粘附性與還原性的物質。本實驗通過簡單的真空抽濾的方法，將聚多巴胺附著在AAO孔道內，形成一層薄層。然后利用聚多巴胺的還原性將HAuCl4中的Au3+還原為Au原子，在AAO孔道內聚集形成金顆粒。并且通過掃描電子顯微鏡（SEM）對修飾金顆粒的AAO膜表面及孔道內的形貌進行了表征。SEM結果如下圖3.1所示，AAO膜外表面基本沒有金納米顆粒，金納米顆粒僅存在于孔道內部。修飾了金顆粒的AAO膜表面基本沒有出現堵塞的情況，而呈現“開通”狀態，證明修飾金顆粒并不會造成AAO表面堵塞，從而排除了表面形貌改變對修飾金顆粒的影響。在AAO孔道內，可以看出金納米顆粒大多呈球粒狀分散的分布在孔道內壁，且直徑都略小于孔徑，說明孔并未被完全的堵塞,由圖3.1（C）可以看出金顆粒外有一層薄膜包附著，這層薄膜可能是PDA薄層。圖3.1（A）金納米顆粒修飾的AAO模板的頂部SEM圖（B）金納米顆粒修飾的AAO模板的底部SEM圖（C）金納米顆粒修飾的AAO模板的截面SEM圖（白點為納米金顆粒）3.2、不同PDA濃度、HAuCl4濃度對孔道內金顆粒尺寸及密度的影響3.2.1不同PDA濃度對金顆粒的尺寸及密度分布的影響PDA作為將Au3+還原為Au原子的還原劑，其濃度勢必會影響孔道內金顆粒的生長尺寸與密度。為研究其影響，如實驗操作2所示，本實驗中選用濃度分別為2、20mg/mL的2種PDA溶液完成AAO膜孔道內金納米顆粒的修飾，通過掃描電子顯微鏡（SEM）對修飾后的AAO膜孔道內進行表征，本工作中利用“NanoMeasurer”軟件對孔道內金顆粒的尺寸及數量進行整體的統計。結果如下圖3.2所示，一方面，隨著PDA濃度從2mg/mL升高到20mg/mL，每個濃度下的SEM圖片（表面積約為1.1·10-10·m-2）中金顆粒的平均數目分別為209和417個，對應的密度為1.9·1012和3.79·1012m-2提高了將近2倍，這由于PDA濃度升高，附著在AAO孔道內的PDA分子越多，從而還原產物金顆粒就越多。另一方面，隨著PDA濃度從2mg/mL升高到20mg/mL，金顆粒的尺寸分別為41.7和34.4nm，呈下降的趨勢。這是因為隨著PDA濃度增加，還原劑的數量增加，所生成的金晶核增加，但HAuCl4中Au3+的濃度固定，所以導致金顆粒的尺寸下降。圖3.2（A-B）PDA濃度分別為2mg/mL（A），20mg/mL（B）所對應的AAO膜孔道內金顆粒（AuNPs）分布的SEM圖（C-D）PDA濃度分別為2mg/mL（C），20mg/mL（D）所對應的AuNPs尺寸分布圖（E）金顆粒（AuNPs）尺寸及數目隨PDA濃度變化統計表3.2.2不同HAuCl4濃度對金顆粒的尺寸及密度分布的影響為研究HAuCl4濃度對AAO膜孔道內金納米顆粒生長尺寸及密度的影響，如實驗操作2所示，本實驗固定PDA濃度為2mg/mL，選用濃度分別為0.1mM、1mM、10mM的三種HAuCl4溶液完成AAO膜孔道內金納米顆粒的修飾，并將修飾金顆粒的AAO膜在掃描電子顯微鏡（SEM）下進行金顆粒尺寸及分布密度進行表征，結果如下圖3.3所示，隨著HAuCl4濃度由0.1mM上升到10mM，每個濃度下的金顆粒數目為0、219和68個，對應的密度為0、2·1012與6.2·1011m-2。而每個濃度下的尺寸為0、41.7和62.3nm，當HAuCl4為0.1mM時，并沒有Au顆粒的形成，這可能是因為Au3+的濃度太低，生成的Au原子太少，不足以聚集形成金顆粒。當HAuCl4濃度從1mM升至10mM時金顆粒密度下降了將近三倍，尺寸有明顯增加。這是因為PDA濃度一定，還原劑濃度一定，而Au3+的濃度增大，導致金顆粒的密度下降，而粒徑增大。圖3.3（A-C）HAuCl4濃度分別為0.1mM（A）、1mM（B）和10Mm（C）對應的AAO膜孔道SEM圖（D-E）HAuCl4濃度分別為1mM（D）和10mM（E）對應的AuNPs尺寸分布圖（F）AuNPs尺寸及數目隨HAuCl4濃度變化統計表3.2.3同時改變PDA、HAuCl4濃度對金顆粒的尺寸及密度分布的影響由以上實驗可知，通過增大PDA濃度可以單向的提高AAO孔道內金納米顆粒密度。反之，通過增大HAuCl4濃度可以單向的增大金顆粒的尺寸。為能夠雙向的調控金納米顆粒的尺寸與密度分布，在AAO孔道內修飾尺寸大、密度高的金顆粒。本實驗通過同時改變PDA、HAuCl4濃度為5mg/mL、2mM與PDA、HAuCl4濃度為2mg/mL、1mM對比，探究其對金納米顆粒的尺寸與密度分布的影響，從而確定最佳PDA、HAuCl4濃度。實驗結果如下圖3.4所示，由圖可知，當PDA、HAuCl4濃度為2mg/mL、1mM，對應的金顆粒尺寸與密度分別為41.7nm與1.9·1012m-2，當PDA、HAuCl4濃度為5mg/mL、2mM時，對應金顆粒的尺寸與密度分別為51.5nm與2.1·1012m-2，后者條件下的金顆粒尺寸與密度都大于前者，而且密度接近于PDA濃度為20mg/mL對應金顆粒密度，尺寸接近于HAuCl4濃度為10mg/mL對應的金顆粒尺寸，所以將PDA、HAuCl4濃度為5mg/mL、2mM作為本實驗中修飾金顆粒的最佳條件。圖3.4(A)PDA與HAuCl4為5mg/mL與2mM對應的AAO膜孔道SEM圖(B)PDA與HAuCl4為2mg/mL與1mM對應的AAO膜孔道SEM圖(C)PDA與HAuCl4為5mg/mL與2mM對應的AuNPs尺寸分布圖(D)PDA與HAuCl4為2mg/mL與1mM對應的AuNPs尺寸分布圖(E)AuNPs尺寸及數目隨PDA與HAuCl4濃度變化統計表3.3、AAO孔道內選擇性修飾疏水分子的表征及其對親、疏水分子篩選本實驗利用金原子與巰基反應生成穩定Au-S鍵的原理，將帶巰基的二十二烷基硫醇（疏水分子）選擇性的修飾在AAO膜孔道內的金顆粒上。并對其進行了接觸角表征以及SEM形貌表征。并通過電化學驅動的方式，探究修飾疏水分子后的AAO膜對親、疏水分子的分離篩選作用。3.3.1修飾二十二烷基硫醇的AAO膜的SEM孔道形貌表征實驗通過SEM對修飾二十二烷基硫醇的AAO孔道及表面形貌進行表征，探究修飾二十二烷基硫醇后是否改變膜的孔道及表面的形貌特征。并將AAO空白膜、修飾金顆粒的AAO膜作為對比實驗，結果如圖3.5所示，在修飾金顆粒的AAO膜修飾正二十二硫醇疏水分子并未堵塞AAO膜的表面，而且其孔道內金顆粒的分布也與修飾金顆粒的AAO膜相似。說明在修飾金顆粒的AAO膜內修飾正二十二硫醇疏水分子并未改變膜表面與孔道內的形貌。圖3.5(A)AAO膜孔道修飾金顆粒及二十二烷基硫醇示意圖(B-C)AAO膜表面(B)與孔道(C)SEM圖(D-E)修飾金顆粒的AAO膜表面(D)與孔道(E)SEM圖(F-G)金顆粒上修飾二十二烷基硫醇的AAO膜表面(F)與孔道(G)SEM圖3.3.2修飾二十二烷基硫醇的AAO膜的接觸角表征實驗通過對修飾二十二烷基硫醇的AAO孔道進行接觸角測試，探究修飾二十二烷基硫醇后的AAO膜表面與孔道內的親、疏水性質變化。結果如下圖所示，圖3.7為AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三種膜的接觸角隨時間變化圖，可以看出，修飾二十二烷基硫醇后，AAO膜表面接觸角變大，說明表面變疏水。根據圖3.8所示，在修飾金顆粒的AAO膜孔道內進一步修飾疏水分子二十二烷基硫醇，其接觸角隨時間的變化率進一步減小，當外界條件一致時，水分子難以滲透在金顆粒上修飾了二十二烷基硫醇的AAO孔道，說明由于二十二烷基硫醇的修飾，使得孔道內具有疏水性質。圖3.7AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三種膜的接觸角隨時間變化圖圖3.8AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三種膜接觸角歸一化后隨時間變化曲線3.3.3修飾二十二烷基硫醇的AAO膜對親、疏水分子篩選本實驗通過電化學驅動的方法，將親疏水分子溶液作為驅動原液，測定電化學驅動后所得的驅動液的紫外吸收峰的吸收值，通過濃度曲線計算得出親、疏水分子跨膜遷移的濃度，進行分析。如下圖3.6所示，對于親水分子亞甲基藍，其紫外吸收峰出現在291nm與669nm(本實驗取291nm作為吸收峰波長),并且濃度與紫外吸收值成正比。當將10-2mol/L亞甲基藍作為原液進行驅動時，通過AAO空白膜的驅動液紫外吸收值平均為3.65，濃度為1.04·10-4mol/L；通過修飾金顆粒AAO膜的驅動液紫外吸收值平均為2.64，濃度為7.57·10-5mol/L；通過修飾二十二烷基硫醇AAO膜的紫外吸收值平均為1.09，濃度為3.22·10-5mol/L。由此可以看出，經過電化學驅動后，親水分子亞甲基藍在空白AAO膜孔道內遷移最快，驅動液濃度最大，在修飾金納米顆粒的AAO膜孔道內遷移速度減慢，驅動液濃度隨之下降，在修飾二十二烷基硫醇的AAO膜孔道內遷移速度進一步降低，驅動液濃度最小。這是由于在空白AAO膜孔道內無阻礙，亞甲基藍分子遷移速度快。而在修飾金顆粒的AAO膜孔道內存在金納米顆粒，堵塞了部分孔道，使空間位阻增大，減小了孔道有效內徑，阻礙了亞甲基藍分子的遷移。而在修飾二十二硫醇分子的AAO孔道內，二十二硫醇分子造成的孔道內的疏水效應進一步的阻礙亞甲基藍分子的遷移。圖3.6(A)不同濃度亞甲基藍溶液對應的紫外吸收曲線(B)亞甲基藍溶液濃度-紫外吸收值曲線(C)經過電化學驅動后分別通過AAO空白膜、修飾金顆粒AAO膜與修飾二十二烷基硫醇AAO膜對應的驅動液濃度柱狀圖如下圖3.7所示，對于疏水分子阿米替林鹽酸鹽，其紫外吸收峰出現在239nm，濃度與紫外吸收值成正比。當將10-2mol/L的阿米替林鹽酸鹽做為原液進行電化學驅動時,通過AAO空白膜的驅動液紫外吸收值平均為0.82，濃度為6.4·10-5mol/L；通過修飾金顆粒AAO膜的驅動液紫外吸收值平均為0.09，濃度為9.1·10-6mol/L；通過修飾二十二烷基硫醇AAO膜的紫外吸收值平均為0.24，濃度為2.02·10-5mol/L，可以看出，經過電化學驅動后，疏水分子阿米替林在空白AAO膜孔道內遷移最快，驅動液濃度最大，在修飾金納米顆粒的AAO膜孔道內遷移速度減慢，驅動液濃度隨之下降，在修飾二十二烷基硫醇的AAO膜孔道內遷移速度提高，驅動液濃度相應增大。這是由于在空白AAO膜孔道內無阻礙，亞甲基藍分子遷移速度快。而在修飾金顆粒的AAO膜孔道內存在金納米顆粒，堵塞了部分孔道，使空間位阻增大，減小了孔道有效內徑，阻礙了亞甲基藍分子的遷移。而在修飾二十二硫醇分子的AAO孔道內，二十二硫醇分子造成的孔道內的疏水效應進一步的促進阿米替林分子的遷移。圖3.7：(A)不同濃度阿米替林溶液對應的紫外吸收曲線(B)阿米替林溶液濃度-紫外吸收值曲線(C)經過電化學驅動后分別通過AAO空白膜、修飾金顆粒AAO膜與修飾二十二烷基硫醇AAO膜對應的驅動液濃度柱狀圖綜上，在修飾金顆粒的AAO膜中修飾疏水分子二十二硫醇后，沒有改變孔道內的結構形貌，但使孔道內具有疏水的性質，并且能夠抑制親水分子亞甲基藍在孔道內遷移，促進疏水分子阿米替林的遷移。因此，該體系對親、疏水分子具有篩選作用。3.4AAO孔道內選擇性的修飾手性分子及其對BSA分子選擇性運輸本實驗利用Au原子與巰基結合形成穩定的Au-S鍵的原理，在修飾金顆粒的AAO膜表面分別選擇性的修飾上手性分子D-半胱氨酸與L-半胱氨酸，然后檢測經兩種手性分子修飾后的AAO膜在電化學驅動下對BSA跨膜運輸的影響。實驗測量BSA通過AAO空白膜、修飾金顆粒的AAO膜、修飾D-半胱氨酸分子的AAO膜與修飾L-半胱氨酸分子的AAO膜后分別所得的驅動液的熒光強度，通過BSA的濃度曲線計算出驅動液的濃度。本實驗中BSA中的熒光素為FITC，其激發波長為494nm,發射波長為521nm。結果如下圖3.8所示，通過修飾Au顆粒的AAO膜的BSA濃度最低，約為5.5nM，這是由于修飾Au顆粒使AAO膜的有效內徑減小，空間位阻增大，阻礙了BSA分子的遷移。而進一步在修飾金顆粒的AAO膜中修飾上D-半胱氨酸分子與L-半胱氨酸，發現通過兩種膜的BSA濃度都增大,分別為6.4nM與8nM，其中通過修飾L-半胱氨酸的AAO膜的BSA濃度與通過空白AAO膜的接近。而通過修飾D-半胱氨酸的AAO膜的BSA濃度最高，說明在修飾金顆粒的AAO膜中修飾上D-半胱氨酸與L-半胱氨酸，都能促進BSA在孔道內的運輸，但兩者的促進程度不同，D-半胱氨酸的促進程度明顯高于L-半胱氨酸。所以在AAO孔道內修飾手性分子L/D-半胱氨酸，對BSA分子的運輸展現出手性選擇性，其中修飾D-半胱氨酸的AAO孔道更有利于BSA分子的跨膜運輸。圖3.8(A)不同濃度BSA溶液對應的熒光光譜曲線(B)BSA溶液濃度-熒光強度曲線(C)經過電化學驅動后BSA分別通過四種膜對應的驅動液熒光光譜圖(D)經過電化學驅動后BSA分別通過四種膜對應的濃度柱狀總結與展望生物孔道因其具有高度的選擇性與特異性，被廣泛的應用在分子的分離篩選、分子的檢測領域，但因其穩定性的限制，設計和開發人工納米孔道材料越來越受到人們的關注。相比于生物材料，無機納米材料本身不僅具有穩定的物理性質、并且其形狀和表面功能化可調控，這就為智能納米孔道系統的設計和開發提供了良好的研究平臺。目前以納米孔道為基礎在其孔道進行功能化修飾建立分子離子分離篩選體系已經成為相關領域科研人員的研究重點。本文通過在AAO孔道內進行功能化修飾，探究其對分子的分離篩選作用，主要得到了以下結論：（1）孔道內金納米顆粒尺寸與密度的雙向調控。本工作利用聚多巴胺粘附性和還原性的雙重性質，結合氯金酸的強氧化性，采用真空抽濾的方法，在AAO納米孔道的內壁成功修飾了分散的金納米顆粒。此外，通過調節聚多巴胺溶液濃度，氯金酸濃度的條件，實現了AuNPs在納米孔道內生長的可控性。本實驗中金納米顆粒生長的最佳濃度為PDA5mg/mL、HAuCl42mM；（2）孔道內修飾疏水分子對親、疏水分子的分離篩選。利用Au原子與巰基結合形成Au-S鍵，在修飾Au顆粒的AAO膜修飾了疏水分子二十二烷基硫醇，經過電化學驅動，修飾了二十二烷基硫醇的AAO膜阻礙親水分子亞甲基藍的遷移，促進疏水分子阿米替林的遷移，從而實現了對親、疏水分子的分離篩選。（3）修飾手性分子對蛋白質的選擇性運輸。利用Au原子與巰基結合形成Au-S鍵，在修飾Au顆粒的AAO膜選擇性的修飾了D-半胱氨酸與L-半胱氨酸，經過電化學驅動，發現修飾了D-半胱氨酸的AAO膜比修飾L-半胱氨酸的AAO膜更容易通過BSA分子，對BSA分子的運輸具有選擇性。本實驗制備的疏水分子功能化的AAO膜納米孔道，阻礙親水分子遷移，促進疏水分子遷移，對親、疏水分子具有較好的分離篩選作用。但由于時間原因，沒有進一步探究親水分子功能化的AAO膜是否具有促進親水分子遷移，阻礙疏水分子遷移的性質。后續研究可以在AAO膜中修飾親水分子，探究其對親、疏水分子的分離篩選。本實驗制備的手性L-半胱氨酸與D-半胱氨酸功能化的AAO膜，雖然對BSA具有選擇性運輸，然而由于時間有限，很多影響條件尚未進行深入探討，例如驅動時間、驅動電壓、BSA濃度等，后續仍需深入探討，進一步完善此實驗。致謝轉眼間，大學生活已經接近尾聲。在大學這四年時光里，我的各種能力都得到了提高，綜合素養得到了提升，這四年也必將成為我最美好的回憶。我相信大學四年我所學到的知識與能力對我今后的發展有莫大的幫助。在做畢業設計這段時間里，首先我想感謝學校，感謝學校給我們提供良好的實驗平臺。其次我特別想感謝我的指導老師——高鵬程教授，在我做畢設實驗遇到困難時，高老師總是耐心地給我分析問題所在，并提出寶貴的意見。這樣我的實驗才能夠順利的完成。而且高老師對實驗嚴謹的態度，對科研堅持的精神，令我感到欽佩，值得我用一生去學習。然后，我特別感謝帶我的司志曉師兄，在我實驗中，師兄認真的交我各種實驗儀器與軟件的使用方法，讓我熟悉了各種儀器的基本操作。在我實驗遇到問題時，師兄也竭盡所能的幫助我。無論實驗上還是生活中，都給了我莫大的幫助。在這里，希望師兄實驗有所突破，學業有成。最后，我想感謝全部支持我的人，包括朋友、家人、同學。希望你們健健康康。參考文獻[1]李素娟.納米孔道材料的限域性質及其在生物分析中應用[D].南京大學,2010.[2]MacaraIG.Transportintoandoutofthenucleus[J].MicrobiolMolBiolRev,2001,65(4):570-594.[3]MarforiM,MynottA,EllisJJ,etal.Molecularbasisforspecificityofnuclearimportandpredictionofnuclearlocalization.[J].BiochimicaEtBiophysicaActa,2011,1813(9):1562-77.[4]Holland,E.M,Braun,etal.Thenatureofrhodopsin-triggeredphotocurrentsinChlamydomonas.I.Kineticsandinfluenceofdivalentions[J].BiophysicalJournal,1996,70(2):924-31.[5]HaqueF,LiJ,WuHC,etal.Solid-StateandBiologicalNanoporeforReal-TimeSensingofSingleChemicalandSequencingofDNA[J].Cheminform,2013,8(1):56-74.[6]DeamerDW,BrantonD.Characterizationofnucleicacidsbynanoporeanalysis.[J].AccountsofChemicalResearch,2002,35(10):817-25.[7]&AmpHB,CremerPS.progressStochasticsensorsinspiredbybiology[J].Nature,2001,413(6852):226-230.[8]Liu,N.W,Datta,A,Liu,C.Y,etal.FabricationofAnodic-AluminaFilmswithCustom-DesignedArraysofNanochannels[J].AdvancedMaterials,2005,17(2):222-225.[9]MussiV,FanzioP,RepettoL,etal.DNA-functionalizedSi3N4nanoporebiosensors[C]//NationalNanomedicineConference.2009.[10]UmeharaS,PourmandN,WebbCD,etal.Currentrectificationwithpoly-l-lysine-coatedquartznanopipettes[J].Nanoletters,2006,6(11):2486-2492.[11]ZhangH,TianY,JiangL.Fundamentalstudiesandpracticalapplicationsofbio-inspiredsmartsolid-statenanoporesandnanochannels[J].NanoToday,2016,11(1):61-81.[12]NishizawaM,MenonVP,MartinCR.Metalnanotubulemembraneswithelectrochemicallyswitchableion-transportselectivity[J].Science,1995,268(5211):700-702.[13]PerryJL,GuoP,JohnsonSK,etal.Fabricationofbiodegradablenanotesttubesbytemplatesynthesis[J].Nanomedicine,2010,5(8):1151-1160.[14]NozawaK,OsonoC,SugawaraM.BiotinylatedMCM-41channelsasasensingelementinplanarbilayerlipidmembranes[J].Sensors&ActuatorsBChemical,2007,126(2):632-640.[15]LiJ,SteinD,McMullanC,etal.Ion-beamsculptingatnanometrelengthscales[J].Nature,2001,412(6843):166-169.[16]JirageKB,HulteenJC,MartinCR.Nanotubule-BasedMolecular-FiltrationMembranes[J].Science,1997,278(5338):655-658.[17]ChunKY,StroeveP.Proteintransportinnanoporousmembranesmodifiedwithself-assembledmonolayersoffunctionalizedthiols[J].Langmuir,2002,18(12):4653-4658.[18]JirageKB,HulteenJC,MartinCR.Effectofthiolchemisorptiononthetransportpropertiesofgoldnanotubulemembranes.[J].AnalyticalChemistry,1999,71(21):4913-8.[19]MubarakAli.FunctionalizationandApplicationofIonTrackEtchedNanochannelsinPolymerMembranes[D].Ph.D.Dissertation,2009.[20]NishizawaM,MenonVP,MartinCR.Metalnanotubulemembraneswithelectrochemicallyswitchableion-transportselectivity.[J].Science,1995,268(5211):700-702.[21]JillianLPerry,PengGuo,ShannonKJohnson,etal.Fabricationofbiodegradablenanotesttubesbytemplatesynthesis[J].Nanomedicine,2010,5(8):1151-1160.[22]KeiichiroNozawa,ChieOsono,andMasaoSugawara.BiotinylatedMCM-41channelsasasensingelementinplanarbilayerlipidmembranes[J].SensorsandActuatorsB:Chemical,2007,126(2):632-640.[23]GuoW,TianY,JiangL.Asymmetriciontransportthroughion-channel-mimeticsolid-statenanopores.[J].AccChemRes,2013,46(12):2834-2846.[24]TianY,WenL,HouX,etal.Bioinspiredion-transportpropertiesofsolid-statesinglenanochannelsandtheirapplicationsinsensing.[J].[25]HoworkaS,SiwyZ.Nanoporeanalytics:sensingofsinglemolecules[J].ChemicalSocietyReviews,2009,38(8):2360-2384.[26]MengH,LiuH,KuaiH,etal.ChemInformAbstract:Aptamer‐IntegratedDNANanostructuresforBiosensing,BioimagingandCancerTherapy[