-/液相色譜—質譜聯用的原理及應用液質聯用與氣質聯用的區別:氣質聯用儀(GC-MS)是最早商品化的聯用儀器，適宜分析小分子、易揮發、熱穩定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標準譜庫對比。感謝閱讀液質聯用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問題：不揮發性化合物分析測定；極性化合物的分析測定；熱不穩定化合物的分析測定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測定；沒有商品化的譜庫可對比查詢，只能自己建庫或自己解析譜圖。感謝閱讀目前的有機質譜和生物質譜儀，除了GC-MS的EI和CI源，離子化方式有大氣壓電離（API）（包括大氣壓電噴霧電離ESI、大氣壓化學電離APCI、大氣壓光電離APPI）與基質輔助激光解吸電離。前者常采用四極桿或離子阱質量分析器，統稱API-MS。后者常用飛行時間作為質量分析器，所構成的儀器稱為基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（MALDI-TOF-MS）。API-MS的特點是可以和液相色譜、毛細管電泳等分離手段聯用，擴展了應用范圍，包括藥物代謝、臨床和法醫學、環境分析、食品檢驗、組合化學、有機化學的應用等；MALDI-TOF-MS的特點是對鹽和添加物的耐受能力高，且測樣速度快，操作簡單。精品文檔放心下載質譜原理簡介：質譜分析是先將物質離子化，按離子的質荷比分離，然后測量各種離子譜峰的強度而實現分析目的的一種分析方法。以檢測器檢測到的離子信號強度為縱坐標，離子質荷比為橫坐標所作的條狀圖就是我們常見的質譜圖。感謝閱讀常見術語:質荷比:離子質量(以相對原子量單位計)與它所帶電荷(以電子電量為單位計)的比值,寫作m/Z.謝謝閱讀峰:質譜圖中的離子信號通常稱為離子峰或簡稱峰.離子豐度:檢測器檢測到的離子信號強度.基峰:在質譜圖中，指定質荷比范圍內強度最大的離子峰稱作基峰.感謝閱讀總離子流圖；質量色譜圖；準分子離子；碎片離子；多電荷離子；同位素離子精品文檔放心下載總離子流圖:在選定的質量范圍內，所有離子強度的總和對時間或掃描次數所作的圖,也稱TIC圖.感謝閱讀質量色譜圖指定某一質量(或質荷比)的離子其強度對時間所作的圖.精品文檔放心下載利用質量色譜圖來確定特征離子，在復雜混合物分析及痕量分析時是LC/MS測定中最有用的方式。當樣品濃度很低時LC/MS的TIC上往往看不到峰，此時，根據得到的分子量信息，輸入M+1或M+23等數值，觀察提取離子的質量色譜圖，檢驗直接進樣得到的信息是否在LC/MS上都能反映出來，確定LC條件是否合適，以后進行MRM等其他掃描方式的測定時可作為參考。精品文檔放心下載1.0指與分子存在簡單關系的離子，通過它可以確定分子量.液質中最常見的準分子離子峰是[M+H]+或[M-H]-.謝謝閱讀-/在ESI中,往往生成質量大于分子量的離子如M+1,M+23,M+39,M+18......稱準分子離子,表謝謝閱讀示為:[M+H]+,[M+Na]+等碎片離子：準分子離子經過一級或多級裂解生成的產物離子.碎片峰的數目及其豐度則與分子結構有關,數目多表示該分子較容易斷裂,豐度高的碎片峰表示該離子較穩定,也表示分子比較容易斷裂生成該離子。謝謝閱讀多電荷離子：指帶有2個或更多電荷的離子,常見于蛋白質或多肽等離子.有機質譜中,單電荷離子是絕大多數,只有那些不容易碎裂的基團或分子結構-如共軛體系結構-才會形成多電荷離子.它的存在說明樣品是較穩定的.采用電噴霧的離子化技術,可產生帶很多電荷的離子,最后經計算機自動換算成單質/荷比離子。感謝閱讀同位素離子由元素的重同位素構成的離子稱為同位素離子.各種元素的同位素,基本上按照其在自然界的豐度比出現在質譜中,這對于利用質譜確定化合物及碎片的元素組成有很大方便,還可利用穩定同位素合成標記化合物,如:氘等標記化合物,再用質譜法檢出這些化合物,在質譜圖外貌上無變化,只是質量數的位移,從而說明化合物結構,反應歷程等謝謝閱讀如何看質譜圖：(1)確定分子離子,即確定分子量氮規則：含偶數個氮原子的分子，其質量數是偶數，含奇數個氮原子的分子，其質量數是奇數。與高質量碎片離子有合理的質量差，凡質量差在3~8和10~13，21~25之間均不可能，則說明是碎片或雜質。謝謝閱讀(2)確定元素組成，即確定分子式或碎片化學式高分辨質譜可以由分子量直接計算出化合物的元素組成從而推出分子式低分辨質譜利用元素的同位素豐度，例:感謝閱讀(3)峰強度與結構的關系豐度大反映離子結構穩定在元素周期表中自上而下，從右至左，雜原子外層未成鍵電子越易被電離，容納正電荷能力越強，含支鏈的地方易斷，這同有機化學基本一致，總是在分子最薄弱的地方斷裂。謝謝閱讀不同類型有機物有不同的裂解方式相同類型有機物有相同的裂解方式,只是質量數的差異需要經驗記憶。謝謝閱讀質譜解析的一般步驟(適于低分辨小分子譜圖,若已經是高分辨質譜圖得到元素組成更好)精品文檔放心下載(1)核對獲得的譜圖,扣除本底等因素引起的失真,考慮操作條件是否適當謝謝閱讀(2)綜合樣品其他知識：例如熔點，沸點，溶解性等理化性質，樣品來源，光譜，波譜數據等.謝謝閱讀盡可能判斷出分子離子。假設和排列可能的結構歸屬：高質量離子所顯示的，在裂解中失去的中性碎片，如M-1，M-15，M-18，M-20，M-31......意味著失H，CH3，H2O，HF，OCH3......精品文檔放心下載(5)假設一個分子結構，與已知參考譜圖對照，或取類似的化合物，并作出它的質譜進行對精品文檔放心下載-/比。有機質譜的特點優點:(1)定分子量準確，其它技術無法比。(2)靈敏度高，常規10-7—10-8g,單離子檢測可達10-12g。謝謝閱讀(3)快速，幾分甚至幾秒。(4)便于混合物分析，LC/MS，MS/MS對于難分離的混合物特別有效,其它技術無法勝任。感謝閱讀(5)多功能，廣泛適用于各類化合物。局限性:(1)異構體，立體化學方面區分能力差。(2)重復性稍差，要嚴格控制操作條件。所以不能象低場NMR，IR等自己動手，須專人操作。感謝閱讀(3)有離子源產生的記憶效應，污染等問題。(4)價格稍顯昂貴，操作有點復雜。質譜儀器：質譜儀由以下幾部分組成數據及供電系統┏━━━━┳━━━━━╋━━━━━━┓進樣系統 離子源 質量分析器 檢測接收器┗━━━━━╋━━━━━━┛真空系統真空系統質譜儀的離子源、質量分析器和檢測器必須在高真空狀態下工作，以減少本底的干擾，避免發生不必要的離子-分子反應。所以質譜反應屬于單分子分解反應。利用這個特點，我們用液質聯用的軟電離方式可以得到化合物的準分子離子，從而得到分子量。精品文檔放心下載由機械真空泵(前極低真空泵)，擴散泵或分子泵(高真空泵)組成真空機組，抽取離子源和分析器部分的真空。感謝閱讀只有在足夠高的真空下，離子才能從離子源到達接收器，真空度不夠則靈敏度低。感謝閱讀進樣系統把分析樣品導入離子源的裝置，包括：直接進樣，GC，LC及接口，加熱進樣，參考物進樣等。感謝閱讀離子源使被分析樣品的原子或分子離化為帶電粒子(離子)的裝置，并對離子進行加速使其進入分析器，根據離子化方式的不同，有機質譜中常用的有如下幾種，其中EI，ESI最常用。精品文檔放心下載EI:電子轟擊電離—硬電離。CI:化學電離—核心是質子轉移。FD:場解吸—目前基本被FAB感謝閱讀取代。FAB:快原子轟擊—或者銫離子(LSIMS,液體二次離子質譜)。ESI:電噴霧電離—謝謝閱讀-/屬最軟的電離方式。適宜極性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白質分子多肽等)APCI:大氣壓化學電離—同上，更適宜做弱極性小分子。APPI:大氣壓光噴霧電離—同上，更適宜做非極性分子。MALDI:基體輔助激光解吸電離。通常用于飛行時間質譜和FT-MS，特別適合蛋白質，多肽等大分子．其中ESI，APCI，APPI統稱大氣壓電離(API)感謝閱讀實驗室現有的離子源:ESI電噴霧電離源APCI大氣壓化學電離源電噴霧（ESI）的特點通常小分子得到[M+H]+]+,[M+Na]+或[M-H]-單電荷離子，生物大分子產生多電荷離子，由于質譜儀測定質/荷比，因此質量范圍只有幾千質量數的質譜儀可測定質量數十幾萬的生物大分子。精品文檔放心下載電噴霧電離是最軟的電離技術，通常只產生分子離子峰，因此可直接測定混合物，并可測定熱不穩定的極性化合物；其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質和DNA等生物大分子；通過調節離子源電壓控制離子的碎裂（源內CID）測定化合物結構。謝謝閱讀大氣壓化學電離（APCI）特點大氣壓化學電離也是軟電離技術，只產生單電荷峰，適合測定質量數小于2000Da的弱極性的小分子化合物；適應高流量的梯度洗脫/高低水溶液變化的流動相；通過調節離子源電壓控制離子的碎裂。謝謝閱讀電噴霧與大氣壓化學電離的比較電離機理：電噴霧采用離子蒸發，而APCI電離是高壓放電發生了質子轉移而生成[M＋H]+或[M-H]-離子。感謝閱讀樣品流速：APCI源可從0.2到2ml／min；而電噴霧源允許流量相對較小,一般為0.2-1ml／min.精品文檔放心下載斷裂程度；APCI源的探頭處于高溫，對熱不穩定的化合物就足以使其分解.謝謝閱讀靈敏度：通常認為電噴霧有利于分析極性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，感謝閱讀APCI更適合于分析極性較小的化合物。多電荷：APCI源不能生成一系列多電荷離子精品文檔放心下載NanoSpray離子源專門設計的 NanoSpray離子源特別適合于做微量的生化樣品，其流速范圍可從 5nL／min精品文檔放心下載luL／min。一滴樣品就可做數小時的分析。可在最小的樣品消耗量下獲得最大靈敏度。靈敏度可高達fmole。并可直接與微孔HPLC聯用。感謝閱讀正負離子模式:一般的商品儀器中,ESI和APCI接口都有正負離子測定模式可供選擇。根據樣品的性質選擇，也可兩種模式同時進行質量分析器:是質譜儀中將離子按質荷比分開的部分,離子通過分析器后,按不同質荷比(M/Z)分開,將相同的M/Z離子聚焦在一起,組成質譜。精品文檔放心下載質量分析器的分類：-/雙聚焦扇形磁場-電場串聯儀器(sector).四極質譜儀(Q).飛行時間質譜儀(TOF).離子阱質譜儀（TRAP）付利葉變換-離子回旋共振質譜儀(FT-ICRMS).精品文檔放心下載┏四極+TOF（Q-TOF）串列式多級質譜儀┫三重四極（QqQ）(MS/MS) ┗TOF+TOF進行MS/MS的儀器從原理上可分為兩類第一類儀器利用質譜在空間中的順序，是由兩臺質譜儀串聯組裝而成。即前面列出的串列式多級質譜儀。精品文檔放心下載第二類利用了一個質譜儀時間順序上的離子儲存能力，由具有存儲離子的分析器組成，如離子回旋共振儀（ICR）和離子阱質譜儀。但不能進行母離子掃描或中性丟失。精品文檔放心下載實驗室現有的質量分析器類型：串聯四極質譜儀(MS/MS)：三重四極（QqQ）離子源→第一分析器→碰撞室→第二分析器→接收器MS1 MS2Q1 q2 Q3QqQ儀器可以方便的改變離子的動能，因此掃描速度快，體積小，常作為臺式進入常規實驗室，缺點是質量范圍及分辨率有限，不能進行高分辨測定，只能做到單位質量分辨。（通過高分辨能得到化合物的分子式）謝謝閱讀在液質聯機中使用的碎片化手段，能量都是以碰撞的形式輸送給分子離子，這個能量足以使得處在能量亞穩態分子中的某些化學鍵斷裂并使一些特定的分子發生結構重排。感謝閱讀碰撞誘導解離CID質譜：選擇一定質量的離子作為母體離子，進入碰撞室，室內充有靶子反應氣體(碰撞氣體：N2、He、Ar、Xe、CH4等)，發生離子—分子碰撞反應，從而產生‘子離子’，再經MS2的分析器及接受器得到子離子質譜，一般稱做CID(collision-induceddissociation)譜感謝閱讀影響CID質譜的因素：較大影響的因素有：所用碰撞氣體的種類，壓力，離子的能量，儀器的配置以及離子電荷狀態感謝閱讀-/由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品，任何一個給定的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的質譜，尤其是各個離子峰的相對豐度的差別幾乎是無法避免的。因而目前尚難以建立商品化的譜庫供檢索使用，只能進行人工解析或自己建庫。感謝閱讀大氣壓電離技術中產生的離子為偶數電子離子，其主要的碎片應由化學鍵的誘導斷裂和重排反應來產生，所以在EI質譜解析中總結出的偶數電子離子的開裂規則一般可適用于CID質譜的解釋。精品文檔放心下載檢測接收器：接收離子束流的裝置，有：電子倍增器、光電倍增器、微通道板數據及供電系統精品文檔放心下載將接收來的電信號放大、處理并給出分析結果及控制質譜儀個部分工作。謝謝閱讀從幾伏低壓到幾千伏高壓。LC-MS分析條件的選擇和優化1.接口的選擇：ESI適合于中等極性到強極性的化合物分子，特別是那些在溶液中能預先形成離子的化合物和可以獲得多個質子的大分子（如蛋白質）謝謝閱讀APCI不適合可帶多個電荷的大分子，其優勢在于弱極性或中等極性的小分子精品文檔放心下載的分析。2.正、負離子模式的選擇：選擇的一般原則為：正離子模式：適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時可優先考慮使用正離子模式。謝謝閱讀負離子模式：適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對樣品進行堿化。樣品中含有較多的強伏電性基團，如含氯、含溴和多個羥基時可嘗試使用負離子模式。謝謝閱讀3.流動相的選擇常用的流動相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調節pH值。精品文檔放心下載LC／MS接口避免進入不揮發的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須＜lmmol/l。（鹽分太高會抑制離子源的信號和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）＜2％。含三氟乙酸≤0.5％。含三乙胺＜l％。含醋酸銨＜10一5mmol/l。送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。謝謝閱讀4.流量和色譜柱的選擇不加熱ESI的最佳流速是1—50ul／min，應用4.6mm內徑LC柱時要求柱后分流，目前大多采用l—2.1mm內徑的微柱，TIS源最高允許lml／min，建議使用200—400ul／minAPCI的最佳流速～lml／min，常規的直徑4.6mm柱最合適。謝謝閱讀為了提高分析效率，常采用＜100mm的短柱（此時UV圖上并不能獲得完全分離，由于質譜定量分析時使用MRM的功能，所以不要求各組分沒有完全分離）。這對于大批量定量分析可以節省大量的時間。謝謝閱讀-/5.輔助氣體流量和溫度的選擇霧化氣對流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級質譜的產生。操作中溫度的選擇和優化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點20℃左右即可。對熱不穩定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。選用干燥氣溫度和流量大小時還要考慮流動相的組成，有機溶劑比例高時可采用適當低的溫度和流量小一點的。謝謝閱讀樣品的預處理：為什么要進行樣品的預處理：從保護儀器角度出發，防止固體小顆粒堵塞進樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對分析結果的干擾。要求獲得最佳的分析結果，從ESI電離的過程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與雜質在液滴表面存在競爭，不揮發物（如磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發，大量雜質防礙帶電樣品離子進入氣相狀態，增加電荷中和的可能。精品文檔放心下載樣品的預處理常用方法a）超濾 b）溶劑萃取／去鹽 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）凈化／去鹽精品文檔放心下載e）色譜分離反相色譜分離親和技術分離f）甲醇或乙腈沉淀蛋白g）酸水解，酶解h）衍生化感謝閱讀化合物鑒別全掃描方式（Q1掃描）全掃描數據采集可以得到化合物的準分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質量及結構。感謝閱讀子離子分析（MS/MS）子離子，用于結構判斷(得到化合物的二級譜圖即碎片離子)和選擇離子對作多種反應監測（MRM）。子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內CID）可能十分相似，所不同的是子離子質譜圖已知只有一種質量通過MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產生的，所以我們更相信由MS/MS產生的譜圖的純度。用大氣壓電離質譜儀可以得到分子量信息謝謝閱讀影響分子量測定的因素1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負離子方式pH要高些，除對離子化有影響外，還影響LC的峰形。謝謝閱讀2）氣流和溫度：當水含量高及流量大時要相應增加。3）溶劑和緩沖液流量：流速適當高可以提高出峰的靈敏度。謝謝閱讀4）溶劑和緩沖液的類型：通常正離子用甲醇好，負離子乙腈好些謝謝閱讀5）選擇合適的液相色譜類型：正相、反相、選擇合適的色譜柱精品文檔放心下載6）合適的電壓：DP電壓高時，樣品在源內分解或碎裂；高DP電壓時回使多電荷離子比例低，多聚體也減少精品文檔放心下載7）樣品結構和性質8）雜質的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當成分復雜，雜質太多時，競爭使被測物離子化不好，同時使LC分離不好感謝閱讀9）樣品濃度不夠，有時需要濃縮-/分子量測定中的誤判溶劑中的雜質來自于塑料添加劑的峰樣品容器不干凈，常見表面活性劑的峰進樣系統污染樣品在源內碎裂，形成碎片離子LC-MS中常見的本底離子m/z50-150,溶劑離子，[(H2O)nH+ ，n=3-112]謝謝閱讀m/z102,H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549謝謝閱讀m/z149,管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,14