宮頸病變組織中水通道蛋白1的表達

水通道1（aqua-1，aqp1）是水通道蛋白質（aquap1，aqps）的成員之一。此前發現了13種類型的母乳水通道蛋白質（aqp0）aqp12。水通道蛋白于動植物及微生物中普遍存在,選擇性地分布在與體液吸收或分泌有關的上皮細胞及可能協同液體跨細胞轉運的內皮細胞中,執行著各部位水分的重吸收、液體分泌和細胞內外水環境穩定的功能。它所介導的自由水快速被動的跨生物膜轉運,是水進出細胞的主要途徑。AQP1是第1個被鑒定的水通道蛋白,其分布范圍廣,于人紅細胞膜和大動脈、小動脈、毛細血管平滑肌細胞上表達。研究表明,它在多種腫瘤組織如黑色素瘤,乳腺癌,腦膠質瘤等腫瘤中表達升高,但未見在宮頸癌中的報道。本實驗的目的是了解AQP1在慢性宮頸炎、CIN和宮頸癌的表達,探討AQP1在宮頸癌發生發展過程中的意義。1材料和方法1.1患者的診斷背景收集2004年5月～2007年6月華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院手術切除或活檢的子宮頸組織標本,包括25例慢性宮頸炎,27例宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)和31例子宮頸癌組織。CIN27例中Ⅰ級9例,Ⅱ級10例,Ⅲ級8例。31例宮頸癌組織根據2000年國際婦產科聯盟(FIGO)宮頸腫瘤TNM分期標準:Ⅰ期19例,Ⅱ期8例,Ⅲ期4例;病理學分級:G16例,G211例,G314例;組織學分型:鱗癌24例,腺癌7例;有淋巴結轉移8例,未轉移23例;術前均無放、化療史。以上病例均經2位病理醫生確定診斷。3組患者平均年齡38.3歲,38.9歲和36.9歲,無顯著差異(P>0.05)。所有標本均經4%多聚甲醛固定,常規組織處理,石蠟包埋,4μm厚連續切片。1.2辣根過氧化物酶的檢測兔抗人和鼠多克隆抗體(武漢博士德),免疫組化SP試劑盒及DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術)。石蠟切片常規脫蠟至水,3%H2O2室溫孵育15min,以封閉內源性辣根過氧化物酶,微波抗原修復,正常血清封閉,加入抗Mcl-1(工作濃度1:200)抗體4℃孵育過夜,再用生物素標記的羊抗兔IgG37℃孵育15min,辣根酶標記鏈霉卵白素37℃孵育15min,最后用DAB顯色,蘇木素復染,酒精逆度脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。每一步驟間均用pH7.4PBS緩沖液漂洗3次,每次5min。以抗原陽性切片(卵巢癌組織)為陽性對照,PBS代替一抗為陰性對照。1.3觀察指標與標準AQP1免疫組化染色以胞膜被染呈棕黃色為陽性細胞,高倍鏡(×400)視野下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標準:不著色0分,著色淡1分,著色適中2分,著色深3分。每張切片隨機觀察5個視野,計數500個細胞中陽性細胞所占比例。評分標準:陽性細胞數<10%0分,10%～30%1分,31%～60%2分,>60%3分。兩項評分相加,0～1.0分(-),1.1～2.0分(+),2.1～3.0分(++),3.1～5.0分(+++)。(-～+)陰性,(++～+++)為陽性。1.4統計處理用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析,率的比較用χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。2結果2.1胞膜表達改變免疫組織化學結果顯示,AQP1只在慢性宮頸炎組織的微小動脈、微小靜脈內皮細胞膜上表達,CIN和宮頸癌組織中除微小動脈、微小靜脈內皮細胞膜上有表達外,在非典型增生的上皮細胞和癌細胞的膜上也有表達(圖1～3)。慢性宮頸炎組織AQP1陽性表達率4.0%(1/25),CIN組織陽性表達率33.3%(9/27),宮頸癌組織陽性表達率74.2%(23/31)。3組AQP1表達陽性率逐漸升高,宮頸癌組分別與慢性宮頸炎及CIN組相比,差異有統計學意義(P<0.01),慢性宮頸炎組與CIN組相比,差異亦有統計學意義(P<0.05),見表1。2.2各組患者cin情況AQP1陽性表達率CINⅠ11.1%(1/9),CINⅡ40.0%(4/10),CINⅢ50.0%(4/8),組間差異無統計學意義(P>0.05),見表2。2.3病理學分級3gAQP1陽性表達率與宮頸癌臨床分期、組織學分型和淋巴結轉移無關(P>0.05),病理學分級G1+G2表達水平顯著低于G3(P<0.05),見表3。3討論3.1aqp1蛋白的結構人AQP1基因定位于染色體7P14,包含4個外顯子,分別編碼第1～128、129～183、184～210和211～269位氨基酸序列,其中3個內含子的長度分別為9600、430和800bp。AQP1蛋白由269個氨基酸多肽組成,其非糖基化型分子的相對分子質量28000,糖基化型分子的相對分子質量35000～60000。AQP1蛋白分布廣泛,不僅存在于分泌及吸收型上皮細胞中,在毛細血管及小血管內皮細胞中也很豐富。通過動物及人體研究發現,AQP1蛋白表達與毛細血管通透性有關,敲除AQP1基因的小鼠肺泡毛細血管的水交換明顯減少,微血管內皮細胞對水的通透性下降了10%。3.2關于apq1蛋白表達與aqp1免疫本研究免疫組化染色結果顯示,AQP1蛋白主要于非典型增生的上皮細胞和癌細胞的膜上以及正常宮頸組織毛細血管及小血管內皮細胞的細胞膜上表達,提示AQP1蛋白表達與正常宮頸、非典型增生宮頸組織和宮頸癌血管的水跨膜轉運有關。由于宮頸癌細胞和部分非典型增生的上皮細胞膜上表達AQP1蛋白,表明它除了在血管的水跨膜轉運過程中起作用外,在維持細胞內外水平衡方面起著重要作用。研究表明,缺乏APQ1蛋白表達的小鼠,肺癌細胞平均生長時間降低50%,腫瘤部位缺乏血管。還有研究發現,降低AQP1表達,腫瘤血管增殖受損,導致腫瘤壞死。因此認為,APQ1蛋白表達可能與腫瘤生長和血管形成有關。本研究發現,AQP1蛋白在慢性宮頸炎、CIN、宮頸癌中都有不同程度的表達,陽性率分別為4.0%,33.3%和74.2%,表明AQP1蛋白在宮頸癌發展過程中的表達呈現逐漸升高的進行性變化趨勢,而且宮頸癌組織病理級別越高AQP1蛋白表達越強,提示AQP1蛋白表達與宮頸癌的發生及惡性程度相關。但是,AQP1蛋白表達與腫瘤分期和淋巴結是否轉移無相關,表明宮頸癌起源時就具有是否轉移的性質,并在發生發展中