凝膠柱層析操作要點(diǎn)(一)根本原理凝膠是一種不帶電荷的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀構(gòu)造、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每為外水體積V。不能進(jìn)入凝膠孔徑的那些大分子，當(dāng)洗脫體積為V。時(shí)，消滅洗脫Vi，能全部滲入凝膠的那些小分V。+Vi時(shí)消滅洗脫峰。(二)凝膠的類型及性質(zhì)1.交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex，3-氯-1.2-環(huán)氧丙烷(交聯(lián)劑)以醚鍵相互交聯(lián)而形成具有三維空間多孔網(wǎng)狀構(gòu)造的高分子化合物。交聯(lián)葡86–2)。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀構(gòu)造越嚴(yán)密，孔徑越小，吸水膨脹就愈小，故只能分別相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì);而交聯(lián)度g10SephadexG–25SephadexG–25G–50LH交聯(lián)葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機(jī)溶劑中較穩(wěn)定，10期保存，應(yīng)參加適量防腐劑，如氯仿、疊氮鈉等，以免微生物生長。交聯(lián)葡聚糖凝膠由于有羧基基團(tuán)，故能與分別物質(zhì)中的電荷基團(tuán)(如堿性蛋白質(zhì))發(fā)生吸附作用，但可借助提高洗脫液的離子強(qiáng)度得以抑制。因此在進(jìn)展凝膠層NaCl蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量。1.凝膠處理交聯(lián)葡聚糖及聚丙烯酰胺凝膠的市售商品多為枯燥顆粒，使用前必需充分溶5,106–2細(xì)菌，同時(shí)排解氣泡。2(凝膠柱制備1:25,1:100。凝膠柱的裝填方法和要求，根本上與離子交換柱的制備一樣。一根抱負(fù)的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一20002g/L觀看色帶是否均勻下移，以鑒定裝柱的技術(shù)質(zhì)量是否合格，否則，必需重裝填。3(加樣與洗脫床體積小，加樣量可小;否則，加樣量增大。例如利用凝膠層析分別蛋白質(zhì)時(shí)，假設(shè)28Onm2cm×6Ocm5mg高。通常樣品液的參加量應(yīng)把握在凝膠床總體積的5,,10,。樣品體積過大，分離效果不好。對(duì)高區(qū)分率的分子篩層析，樣品溶液的體積主要由內(nèi)水體積(Vi)所打算，故高mL0.3,0.5mg0.O2倍總體積;而低吸水量凝膠如SephadexG–75，每mL總床體積加溶質(zhì)質(zhì)量0.2mg，0.Ol加樣方法如同離子交換柱層析一樣，凝膠床經(jīng)平衡后，吸去上層液體，待mL洗管壁。然后連續(xù)用大量洗脫液洗脫。洗脫加完樣品后，將層析床與洗脫液儲(chǔ)瓶、檢測(cè)儀、分部收集器及記錄儀mL。各組分可用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)展定性或定量分析。凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液，有時(shí)甚至可用蒸餾方法進(jìn)展。4.凝膠的再生和保存稍加平衡即可進(jìn)展下一次的分析操作。但使用屢次