熒光定量pcr檢測輪狀病毒腸炎患兒腸道中3種細菌

采用熒光定量pcr法可以直接從樣品中提取的細菌dna進行測定和定性分析。因16SrRNA具有在細胞中相對穩定,同時含有保守序列及高變序列等優點,近年來一直是微生物系統分類的一個重要指標,并且根據其設計屬種特異PCR引物。該文用熒光定量PCR方法對腸道中較常見的3種細菌進行了定量,并與用傳統的培養方法獲得的結果比較,來證明熒光定量PCR法是一種特異、準確、快速、簡便的檢測腸道菌群的方法。1對象和方法1.1標準物質和樣品的研究1.1.1藥物及其生態制劑于2003年及2004年10月至次年1月在昆明醫學院第一附屬醫院兒科住院的腹瀉患兒,病前2周及病后收集大便標本前未用過抗生素及微生態制劑。用無菌離心管收集其糞便標本,在-70℃冰箱保存備用,用ELISA法進行RV-Ag的初篩,陽性標本進行RT-PCR和聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳明確為輪狀病毒感染(在中國醫學科學院生物研究所進行)。1.1.2elisa法檢測選擇同期到該院兒童保健科定時體檢的正常兒童,其年齡、喂養方式與腹瀉組相當,要求4周內無腹瀉病或其他胃腸道疾病史,無抗生素及微生態制劑使用史,大便常規檢查無異常,用ELISA法對其糞便進行RV-Ag檢測為陰性者。以上述相同方法收集其糞便標本,于-70℃冰箱保存備用。1.2方法1.2.1懸浮細菌回復突變pbs所有糞便標本凍融后參照文獻的方法,取大便1g加9ml的PBS(0.05mol/L,pH7.4)充分顛倒混勻5～10min,然后低速離心(1440r/min)5min,取上清,上述過程重復3次,收集上清高速離心(9200r/min)3min后取沉渣,沉淀的細菌用PBS液洗4次,水洗1次,后加50μl蒸溜水懸浮細菌及50μl1%TritonX-100破碎菌體,100℃煮沸5min立即放入冰水中冷卻備用。1.2.2pcr索引1.2.3pcr擴增過程25μl反應體系包括10×Buffer2.5μl,4×dNTP(0.25mmol/L)2μl,MgCl2(25mmol/L)2.5μl,上下游引物(0.25μmol/L)各0.25μl,Taq酶(1u/μl)0.75μl,DNA模板3μl,水13.75μl。采用GeneAmpPCRsystem9600型PCR儀進行擴增。反應程序為:95℃變性5min后,95℃15s,55℃1min,72℃45s共30個循環,最后以72℃10min延伸后結束。擴增產物通過PAGE電泳顯示各細菌的擴增片段。見圖1。1.2.4熒光定量pcr檢測細菌熒光信號25μl反應體系包括10×Buffer2.5μl,4×dNTP(0.25mmol/L)2μl,MgCl2(25mmol/L)2.5μl,上下游引物(0.25μmol/L)各0.25μl,Taq酶(1u/μl)0.75μl,DNA模板3μl,熒光染料SYBRgreen2.5μl,水11.25μl。采用GeneAmp5700型熒光定量PCR儀進行擴增與分析。在PCR的反應過程中,所形成的DNA會和熒光染料結合,兩者結合后形成的熒光信號可被檢測到。結合各細菌的溶解曲線,得到雙歧桿菌引物二聚體的TM值為83～87℃,而產物的TM值為88～91℃(圖2)。以此類推,大腸埃希菌的TM值分別為72.5～77℃和82～86℃,而乳酸桿菌的TM值分別為80～85℃及85～89℃。在定量過程中,需要將引物二聚體和熒光染料結合的熒光信號消除,所以在產物之前和引物二聚體之后的TM值之間加上5s以消除其引物,即經95℃變性5min后。各細菌的反應程序為:雙歧桿菌95℃15s,60℃1min,72℃45s,87℃5s共40個循環,以72℃10min延伸后結束;大腸埃希菌95℃15s,60℃1min,72℃45s,82℃5s共40個循環,72℃10min結束;乳酸桿菌95℃15s,60℃1min,72℃45s,85℃5s共40個循環,72℃10min結束。利用相應的引物和模板進行熒光定量PCR反應,可得到不同拷貝的模板循環數與熒光強度關系圖(圖3),其中橫坐標代表PCR反應的循環數,縱坐標代表DNA與SYBRGreen熒光染料結合后的熒光強度(Rn)。從圖中可以看出不同拷貝數的模板隨著循環數的增加,其熒光強度逐漸增強,當達到一定的循環數時曲線趨于平行,即出現“平臺效應”。1.2.5熒光定量pcr方法的制備和測定dna分別純化上述PCR反應過程中得到的雙歧桿菌和大腸埃希菌PCR產物,具體步驟如下:在DNA溶液中加入1/10體積3mol/LpH5.2的乙酸鈉,在旋渦混合器上稍加振蕩或用手指輕彈離心管壁幾次使之混勻,加入2～2.5倍體積的無水乙醇,振蕩混勻并置于冰上30min,離心5min棄上清,加入1ml70%的乙醇,顛倒混勻離心棄上清,干燥沉淀。將干燥沉淀物溶于適當體積的無菌水或TE緩沖液即成。在分光光度儀上測定出2種純化產物的A值。參照分子克隆,1個A雙鏈DNA片段(1KB)相當于4.74×1013分子/ml,計算出每mlPCR產物中所含的拷貝數,然后做10倍系列稀釋,使其形成109～105拷貝/ml,按上述條件進行熒光定量PCR。同時取準確定量的細菌(雙歧桿菌由昆明加加寧生態食品有限公司惠贈,濃度為109CFU/ml。大腸埃希菌由昆明醫學院附屬第一醫院保存的質控菌株培養,濃度為108CFU/ml。)做系列稀釋后直接9200r/min離心3min,PBS洗2次,水洗1次,懸浮,破碎菌體,加熱、即冷等步驟同前,所得細菌的DNA也同時進行熒光定量PCR,結果發現同一濃度的純化的DNA和標準細菌DNA所出現熒光信號的初始循環數是一致的,證明了上述2種方法所獲得的DNA都可以用來作標準曲線。乳酸桿菌的標準樣品通過PCR產物進行純化獲得。將3種細菌的標準樣品和待測樣品同時進行PCR反應作為標準曲線,雙歧桿菌的標準曲線見圖4。以不同拷貝數的陽性模板的對數為橫坐標,以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數(Ct)為縱坐標繪制而成。待測樣品和標準曲線進行比較,獲得各樣品中3種細菌的數量。1.3統計分析所得結果經對數轉換后以xˉ±sxˉ±s表示,兩組間比較用t檢驗。1.4雙歧桿菌的分子檢測通過對標準的乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸埃希菌做引物交叉后行熒光定量PCR,用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析常規PCR擴增產物,以Mark為分子量標準,結果表明雙歧桿菌在230bp處有特異性擴增區,而大腸埃希菌和乳酸桿菌無此特異性擴增區。乳酸桿菌在166bp處有特異性擴增區,而大腸埃希菌和雙歧桿菌無此特異性擴增區。大腸埃菌也有自己的特異性擴增區,且引物特異性產物均有特征性曲線生長,而其它2種菌無特征性曲線。上述結果說明實驗所設計引物能正確特異地鑒別3種常見的腸道菌群,為利用此引物定量測定3種細菌提供了依據。1.5熒光定量pcr檢測通過對標準3種細菌做系列稀釋(109～102個細菌)后行熒光定量PCR,少至100個細菌仍有特征性曲線生長,說明用此引物通過熒光定量PCR檢測上述3種細菌有較好的敏感性。2不同性別罪犯腸道菌的數量30名健康兒童和52名腹瀉兒童糞便的三類細菌的定量結果見表1,其中患兒與健康兒童進行比較,其腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量明顯減少(P<0.05),而大腸埃希菌的數量差異無顯著性(P>0.05)。所得結果與張琳等用培養方法獲得的結果接近,見表2。3實時定量pcr方法的應用人體腸道菌群數量龐大,構成復雜。健康成人的腸道棲息著1014個細菌,是人體細胞總數的10～20倍,有多達近500余種細菌,其重量約1kg,每克大便的細菌的數量達到1012拷貝。腸道的微生物菌群與宿主的健康息息相關,它對宿主食物的消化、內源性和外源性物質的代謝、抵御致病菌的入侵等起著不可替代的作用。傳統的細菌定量的方法是細菌培養后計數菌落,但是在復雜的腸道菌群中,只有一小部分(大約10%～40%)可以通過這種方法達到鑒定和定量。它只能定量檢測可培養的細菌,不能檢測許多無法培養和未知的細菌,而且它的敏感性很低、效率低、費時,費力,易受操作方法的影響,另外由于腸道菌群各種細菌的生長條件及生長率的不同,使培養鑒定法不夠準確。隨著分子生物學技術的發展,16SrDNA的基因序列分析,變性梯度凝膠電泳,溫度梯度凝膠電泳,生物芯片技術,熒光原位雜交等方法已經廣泛應用于人和動物腸道的菌群分析中。但是上述方法或者不直接或者需要和培養方法結合,并且具有技術要求高,費力及低敏感性等特點,在一定程度上都限制了它們的使用。只有實時定量PCR(real-timepolymerasechainreaction)法能夠應用從標本中提取的細菌DNA來直接進行定量和定性分析。因16SrDNA具有在細胞中相對穩定,同時含有保守序列及高變序列等優點,近年來一直是微生物系統分類的一個重要指標,并且根據其設計屬種特異PCR引物。熒光定量PCR(Fluorescentquantitative-PCR)是由美國于20世紀90年代末期推出的的一種新的核酸定量技術。它的工作原理為SYBRGreen是一種可以和雙鏈DNA結合的熒光染料,在PCR反應過程中,隨著PCR產物的增加,PCR產物與SYBRGreen結合的量也增大,兩者結合后形成的熒光信號可被儀器檢測到,通過對已知拷貝數的不同稀釋倍數的陽性模板做熒光定量PCR,制出標準曲線,未知樣品通過與標準曲線進行比較即可得出定量結果。實時定量PCR與常規檢測細菌的方法相比,具有更省時省力,敏感性高,特異性強,操作簡單快速的特點,且傳統的方法只是可以檢測活的病原體遺傳物質,而這種方法不但可以檢測活的細菌的遺傳物質,還可以檢測死的細菌的遺傳物質,不受實驗時間的限制。可以收集標本后凍存送到有該實驗條件的地方檢測,有利于各研究組織之間的合作。應用熒光定量PCR的方法對輪狀病毒性腸炎患兒的腸道菌群主要是雙歧桿菌、乳酸桿菌和大腸埃希菌進行了定量分析,并和同年齡同性別的正常兒童菌群進行比較。其結果和其他文獻報道的用培養的方法得到的結果接近,說明了熒光定量PCR法可以準確特異地對腸道菌群進行定量。PCR技術能快速特異地擴增目的基因,并能很容易的使得微微克水平的起始靶序列達到微克水平的量,PCR的敏感性推動了早期診斷技術的發展,但臨床應用的最大缺點是假陽性污染,而杜絕產物污染帶來假陽性的根本措施是在封閉狀態下進行擴增和產物分析。熒光定量PCR可以使PCR擴增和產物分析的全過程均在單管封閉條件下進行,并通過微機控制,實現了對PCR擴增產物進行實時動態檢測和自動分析結果,該技術從根本上解決了PCR擴增產物污染和不能定量的問題。在實驗過程中,熒光定量PCR反應條件的選擇和優化對于反應的成功與否非常關鍵,對于在反應過程中所需要的各種條件如引物、Mg2+的濃度、Taq酶、SYBRGreen及模板等物質的量和濃度都需要不斷摸索,找出最佳的條件,尤其是各引物二聚體和產物的TM值需要反復的實驗,才能在以后的PCR反應過程中消除引物二聚體