地衣芽孢桿菌發(fā)酵桿菌肽的研究

標準的蘑菇是白色或淡黃色的粉末。它沒有味道，也沒有味道。吸濕性好。易被氧化破壞，溶液中可能殘留各種重金屬鹽。在水中易溶,在乙醇中溶解,在丙酮、氯仿或乙醚中不溶。對革蘭氏陽性菌特別對金黃色葡萄球菌和鏈球菌屬具殺菌作用。由于桿菌肽局部外用刺激性小,過敏反應少,常用以治療敏感菌引起的感染。桿菌肽鋅還是很好的促生長類藥物飼料添加劑,并增強動物的抵抗能力。測定桿菌肽效價的國際常用方法是管碟法,是利用抗生素在特定實驗菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴散作用,形成一定濃度的含抗生素的球型區(qū),抑制了試驗菌的繁殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈,將已知效價的標準溶液和未知效價的供試品溶液在相同條件下進行培養(yǎng),比較兩者的抑菌圈的大小,利用各種不同的計算原理,就可以準確地測定出供試品的效價。雖然使用標準樣品比較,但是由于各種因素的影響使得抑菌圈在相同劑量下偏小,不規(guī)則,那對低劑量的效價難于測定,使效價測定的誤差更大,為此,作者通過對影響測定抑菌圈大小的各種因素進行比較試驗及分析,得出產(chǎn)桿菌肽的優(yōu)化培養(yǎng)基及效價測定的最佳條件。1材料和方法1.1材料表面1.1.1地衣芽孢桿菌b.lihenifminis4.3菌株分子中雙標樹的發(fā)酵試驗指示菌:金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus;發(fā)酵試驗菌地衣芽孢桿菌B.licheniformis;均由重慶師范大學應用微生物研究所提供。1.1.2培養(yǎng)基產(chǎn)品1g、水制備下層培養(yǎng)基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、水1000mL、pH7.2、121℃/30min滅菌。上層培養(yǎng)基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂8g、水1000mL、pH7.2、121℃/30min滅菌。2玉米粉、玉米粉、nh4豆芽汁培養(yǎng)基:豆芽200g、蔗糖20g、水1000mL、pH7.5。黃豆粉培養(yǎng)基:黃豆40g、玉米粉15g、(NH4)SO41g、CaCO300.4g、MgSO40.1g、泛酸鈣1g、β-丙氨酸0.1g、半胱氨酸1g、水1000mL、pH7.5。蛋白胨水培養(yǎng)基:牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20g、水1000mL、pH7.5。1.1.3標準的細菌活性物質(zhì)美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品。1.1.4微生物測量儀器離心機,電子天平JA-FA9(FA1004A),多功能微生物自動測量儀(ZY-300IV),高壓滅菌鍋,酸度計pHS-2C,培養(yǎng)皿,牛津杯,振蕩培養(yǎng)箱,生化培養(yǎng)箱HSP-1500,細菌過濾器,Pipette取液器。1.2方法1.2.1菌種肽發(fā)酵液的制備將地衣芽孢桿菌接種于裝有100mL豆芽汁培養(yǎng)液(經(jīng)過初步篩選后,確定的一種培養(yǎng)基)中振蕩培養(yǎng),37℃發(fā)酵48h,離心后用細菌過濾器除菌即得桿菌肽發(fā)酵液。1.2.2不同濃度的菌懸液的制備將葡萄球菌接種于牛肉膏蛋白胨上,活化培養(yǎng)24h后用5mL無菌水將菌苔洗入到95mL帶玻璃珠的無菌水中,把指示菌制成106、107、108、109、1010cfu/ml不同濃度的菌懸液。1.2.3抑菌圈的測定采用上下層培養(yǎng)基的厚度不同,加入同一發(fā)酵液測定抑菌圈的大小;同時采用不同pH值的上層培養(yǎng)基,加入同一發(fā)酵液測定抑菌圈的大小;再采用不同濃度的指示菌,加入同一發(fā)酵液測定抑菌圈的大小。雙碟法測定桿菌肽的影響因素的實驗統(tǒng)一使用美國Sigma-Aldrich公司購得的桿菌肽標準品。2結(jié)果與討論2.1培養(yǎng)基優(yōu)化2.1.1菌種培養(yǎng)基的確定地衣芽孢桿菌用不同的培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生的桿菌肽的量不同,選用豆芽汁培養(yǎng)基,肉湯胰蛋白胨培養(yǎng)基,肉湯魚蛋白胨培養(yǎng)基(此三種實驗室常用),黃豆粉培養(yǎng)基(目前工業(yè)生產(chǎn)選用)進行對比研究,結(jié)果如圖1。從圖1可知,豆芽汁培養(yǎng)基發(fā)酵的桿菌肽所得抑菌圈最大,與其他發(fā)酵液差異較顯著,說明不同營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基,發(fā)酵效果不同;通過對加復合鹽與未加復合鹽的豆芽汁培養(yǎng)基發(fā)酵比較,差異不明顯,可見豆芽汁培養(yǎng)基營養(yǎng)十分豐富。從不同蛋白胨的肉湯培養(yǎng)基所產(chǎn)桿菌肽的量進行分析,說明不同N源對桿菌肽產(chǎn)量影響大。2.1.2培養(yǎng)基中c源對桿菌肽發(fā)酵的影響配制豆芽汁培養(yǎng)基時,分別按0%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的比例加入蔗糖,得到7種不同碳質(zhì)量分數(shù)的豆芽汁培養(yǎng)基,結(jié)果如圖2。圖2可以看出,以加入質(zhì)量分數(shù)2%蔗糖的豆芽汁培養(yǎng)基發(fā)酵后所得到的抑菌圈最大,除了與3%的差異不顯著以外,與其他的比例都顯著,原因是培養(yǎng)基中C源越高,N源相對低,控制了菌數(shù)的增加,有利于桿菌肽的形成,但如果C源過高,桿菌肽的形成反而下降,可能是由于糖濃度過高,增加了培養(yǎng)液的粘稠度,使發(fā)酵液溶解氧減少,并降低了菌體細胞膜的通透性,影響了菌的正常代謝,導致桿菌肽產(chǎn)量下降。2.2雙cd法測定了細菌血漿的影響因素2.2.1低計量效價測定中主、副產(chǎn)物的抑菌圈下層20mL不變,上層分別取5.0、7.5、10.0、12.5、15.0mL與下層10mL不變,上層分別取5.0、7.5、10.0、12.5、15.0mL兩種處理進行比較,其結(jié)果見圖3。從圖3可看出兩種條件下都是上層量越少抑菌圈越大,上層量為5mL的與10mL后的差異顯著。說明桿菌肽在牛津杯中的球形擴散過程中,上層培養(yǎng)基越薄,越有利于桿菌肽的橫向擴散,以及培養(yǎng)基越薄,指示菌數(shù)相對更少一些,故而抑菌圈大。由于上層量為5mL不容易鋪滿上層,并且冷卻快,未鋪平就凝固了,所以在添加上下層時最好將環(huán)境溫度升高一些。所以可以根據(jù)情況,在不需要低計量效價測定時可選用上層7.5mL到10.0mL。需要低計量效價測定時選用上層5.0mL。同時,下層為10mL的普遍比下層20mL效果好?？紤]到節(jié)省材料和更好效果,下層的量以10mL為好,既可起到支撐作用,又可節(jié)省藥品。2.2.2生長ph值對抑菌圈直徑的影響分別配制pH值為6.5,7.0,7.5,8.0共4種上層培養(yǎng)基,進行抑菌圈的大小測定試驗,結(jié)果如圖4。從圖4可知,當上層培養(yǎng)基pH值為7.0時,抑菌圈的直徑最大,并與pH6.5,pH7.5,pH8.0差異顯著。說明上層培養(yǎng)基的pH值對抑菌圈的直徑有影響。這可能與該菌最適pH和桿菌肽的穩(wěn)定性有關,因為該菌的生長條件中,最適生長pH值是7.4。當pH值7.0時,既避開了該菌的最適生長pH值,又對桿菌肽的穩(wěn)定性影響最小。2.2.3抑菌圈測定結(jié)果采用金黃色葡萄球菌作指示菌,把菌懸液分別稀釋為106、107、108、109、1010cfu/mL不同濃度的菌懸液,然后按照1mL/dL分別加入到100mL上層培養(yǎng)基中,實驗結(jié)果如圖5。從圖5可知,指示菌濃度的影響對抑菌圈的大小影響非常顯著,濃度越高抑菌圈越小,當菌懸液稀釋到10-2和10-3時抑菌圈直徑較大,都與10-1的差異顯著,與原液差異極顯著。但由于菌數(shù)10-3太少,有的邊緣已不太明顯,并且它與稀釋到10-2的抑菌圈直徑差異不明顯,因此稀釋到10-2時(此濃度的菌懸液用平板活菌計數(shù)法計數(shù)得108cfu/mL),所得的抑菌圈效果最好。這可能是由于指示菌濃度過大,菌數(shù)太多,直接影響抑菌作用;而被抑制的菌數(shù)太少,抑菌圈邊緣就不整齊,甚至顯示不出來。3培養(yǎng)基的設置及抑菌圈的測定綜上所述,通過對不同培養(yǎng)基發(fā)酵的桿菌肽產(chǎn)量的研究以及對影響桿菌肽測定中抑菌圈大小的因素研究,發(fā)現(xiàn)以豆芽汁培養(yǎng)基作發(fā)酵液效果較好,其加入蔗糖的量為2g/dL時,達