GGTA1基因敲除巴馬小型豬SLA單倍型分型及轉(zhuǎn)hEPCR基因豬的制備GGTA1基因敲除巴馬小型豬SLA單倍型分型及轉(zhuǎn)hEPCR基因豬的制備

摘要：基因編輯技術(shù)的迅速發(fā)展為進行人工合成器官、涉及人類疾病模型研究以及產(chǎn)生改良豬種提供了有力工具。本研究旨在利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除巴馬小型豬（Susscrofadomesticus）體細胞中的GGTA1基因，并進行SLA單倍型分型，然后進一步轉(zhuǎn)入hEPCR基因進行豬的制備。結(jié)果表明，通過合成兩個目標導(dǎo)向RNA（gRNA）并導(dǎo)入體細胞，成功編輯基因組，敲除了GGTA1基因。隨后，利用PCR擴增并測序，確認了基因組的編輯情況。然后，采用DNA芯片技術(shù)對豬的SLA單倍型進行分型，結(jié)果顯示出不同SLA單倍型的分布情況。最后，采用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將hEPCR基因轉(zhuǎn)入編輯后的豬細胞中，進一步驗證了編輯的有效性。

關(guān)鍵詞：基因編輯；GGTA1基因；巴馬小型豬；SLA單倍型分型；hEPCR基因

引言

巴馬小型豬是一種近年來逐漸興起的豬種，其體型小巧，易于飼養(yǎng)和繁殖，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學研究、生產(chǎn)實踐和生殖生物技術(shù)等領(lǐng)域。然而，巴馬小型豬與人類存在SLA(SwineLeukocyteAntigen)系統(tǒng)的類似性，導(dǎo)致在使用巴馬小型豬作為移植器官來源時，易產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。因此，通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除巴馬小型豬體細胞中的GGTA1基因，能夠?qū)崿F(xiàn)抗原減毒，從而降低移植器官的免疫排斥反應(yīng)。

材料與方法

1.合成目標導(dǎo)向RNA（gRNA）：通過生物合成技術(shù)合成兩個目標gRNA序列。

2.細胞培養(yǎng)：采集巴馬小型豬的體細胞，并進行離心、洗滌和培養(yǎng)。

3.轉(zhuǎn)染CRISPR/Cas9載體：通過電穿孔法將合成的gRNA和Cas9蛋白共轉(zhuǎn)入巴馬小型豬細胞中。

4.DNA提取、PCR擴增和測序：收集巴馬小型豬細胞后，提取細胞DNA進行PCR擴增，然后測序確認編輯情況。

5.SLA單倍型分型：采用DNA芯片技術(shù)對巴馬小型豬的SLA單倍型進行分型。

6.hEPCR基因轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將hEPCR基因轉(zhuǎn)入編輯后的巴馬小型豬細胞中。

結(jié)果與討論

成功合成兩個目標gRNA序列，并將其導(dǎo)入巴馬小型豬細胞中。通過PCR擴增和測序，確認了基因組中的GGTA1基因編輯情況。進一步利用DNA芯片技術(shù)對巴馬小型豬的SLA單倍型進行分型，結(jié)果顯示出不同SLA單倍型的分布情況。這表明巴馬小型豬具有多樣性的SLA單倍型，為個體的免疫特征奠定了基礎(chǔ)。最后，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)成功將hEPCR基因轉(zhuǎn)入編輯后的巴馬小型豬細胞中，驗證了編輯的有效性。

結(jié)論

本研究成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了巴馬小型豬體細胞中的GGTA1基因，并通過PCR擴增、測序和DNA芯片技術(shù)對巴馬小型豬的SLA單倍型進行了分型。通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)進一步驗證了編輯后的有效性。這些結(jié)果為巴馬小型豬作為移植器官來源的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究支持，為生物醫(yī)學研究和器官移植領(lǐng)域的發(fā)展提供了有力的工具和方法。

綜上所述，本研究成功利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功編輯了巴馬小型豬體細胞中的GGTA1基因，確認了基因組的編輯情況。此外，通過PCR擴增和測序確認了編輯的有效性，并利用DNA芯片技術(shù)對巴馬小型豬的SLA單倍型進行分型，發(fā)現(xiàn)了多樣性的SLA單倍型分布情況。最后，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)成功將hEPCR基因轉(zhuǎn)入編輯后的巴馬小型豬細胞中，驗證了編輯的有效性。這些結(jié)果為巴馬小型豬作為移植器官來源的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)研究支持，并為生物醫(yī)學研究和